毛果杨PLD基因家族全基因组水平鉴定及其盐胁迫下的表达分析

[目的]对木本模式植物毛果杨PLD基因家族的进化中的选择压力、启动子中顺式作用元件、组织表达特性以及盐胁迫下表达模式进行分析,为挖掘PtrPLD在非生物胁迫中作用提供参考。[方法]利用拟南芥PLD基因家族蛋白序列比对得到毛果杨基因组同源基因,再经过保守结构域鉴定后确定PtrPLD基因;利用软件ClustalW和MEGA对PtrPLD和AtPLD基因的氨基酸序列进行比对和系统进化分析;利用MEME、PlantmPLoc、 ExPasy等软件工具分析PtrPLD基因及编码蛋白的特征;利用Tbtools软件分析同源基因的Ka/Ks值;利用Plantcare在线工具分析PtrPLD启动子中顺式作用元件;利用Phytozome转录组数据库以及qRT-PCR分析PtrPLD组织表达特性;利用qRT-PCR分析各组织中PtrPLD对盐胁迫响应情况。[结果]PtrPLD家族的16个基因可分为C2-PLD和PX/PH-PLD 2个亚家族,分别包含13个和3个基因;有7对旁系同源基因且它们之间的Ka/Ks均远小于1;PtrPLD家族基因启动子区含有大量非生物胁迫和激素响应元件,其中,PtrPLDδ4启动子共含有9种、20个元件;PtrPLD家族编码的蛋白均含有Motif 1～4,且同一进化分支上的基因编码蛋白序列高度保守。PtrPLD基因家族表达特性分析表明,PtrPLD家族基因在根、茎和叶中具有表达特异性,并且多数成员主要在根部表达;NaCl胁迫下,PtrPLD家族基因在根、茎和叶中表达量在0～72 h内均表现为先上升后下降再上升的变化趋势。[结论]PtrPLD家族基因在毛果杨响应盐胁迫过程中有着重要作用,本项研究对于今后PtrPLD家族基因生物学功能的鉴定与非生物逆境胁迫响应基因资源的挖掘具有推动作用。     

牵牛E3泛素连接酶PNRma1基因的克隆及抗旱相关性分析

为研究牵牛E3泛素连接酶对其干旱胁迫的响应情况,利用RT-PCR技术从牵牛中克隆得到1个E3泛素蛋白连接酶基因PNRma1的cDNA全长序列,其序列长度为734bp,编码244个氨基酸。对牵牛PNRma1蛋白进行二级结构预测,结果表明该蛋白主要由α螺旋(41.88%)和无规则卷曲(37.18%)构成,并且牵牛PNRma1蛋白与野生潘那利番茄的同源性最高(相似度为94%)。在干旱胁迫处理下,PNRma1基因在牵牛根部的表达量总体上与对照相比呈现上升后下降的趋势,其在叶片中表达水平呈现后期上升趋势,试验结果表明,PNRma1基因响应牵牛的干旱胁迫反应,并且在根部(6h)早于叶片(9h)应答干旱信号。     

低磷胁迫下不同杉木家系根系H^+流动态变化

通过分析不同杉木家系在不同供磷处理下根系H^+流变化规律,探讨根系H^+流与杉木适应低磷胁迫调控的关系,为揭示磷高效利用杉木适应低磷胁迫的内在机制提供科学依据。以前期筛选出的不同磷利用效率杉木家系M28与M32为研究对象,通过设计3个供磷处理[正常供磷(H-P),31 mg·L^-1;中度缺磷(L-P),16 mg·L^-1;重度缺磷(N-P),0 mg·L^-1]和3个时间处理梯度(3、8、15 d)室内水培试验,并利用非损伤微测技术(NMT)分别测定两个家系在不同供磷处理和不同时间处理梯度下完整根系及不同部位的H^+动态变化规律。结果表明:不同杉木家系完整根系H^+全程表现为内流,但二者H^+流变化存在显著差异,M28完整根系H^+吸收表现为8 d>15 d>3 d,M32在不同时间处理下H^+的变化无显著差异(P>0.05)。结合根系不同部位H^+流向分析可得,M28与M32仅在L-P和N-P处理3 d时表现出少量H^+外排现象,其中M28对外界磷环境的感应比M32更为敏感,在L-P处理下就发生H^+外排现象,M32在N-P处理才发现H^+外排。随着时间推移,在处理8、15 d后,两个杉木家系均未观测到H^+的外排,可见低磷胁迫下根系H^+外排是一种应激反应。不同杉木家系根系H^+流在低磷环境下表现出不同的适应性变化,其中M28根系的H^+流对外界磷环境的改变更为敏感。     

油桐ALDH22A1和ALDH2C4基因克隆及其序列分析

为给油桐ALDH基因的结构与功能研究提供理论依据,以葡萄桐的近成熟种子为材料,根据油桐转录组测序结果设计引物,采用RT-PCR技术克隆了油桐ALDH22A1基因和ALDH2C4基因的全长cDNA序列。ALDH22A1的cDNA序列全长1 782 bp,编码593个氨基酸,该基因编码蛋白质的相对分子质量为65.60 kDa,理论等电点为6.62,蛋白二级结构以α螺旋为主,具有1个明显的跨膜结构,是稳定的非分泌蛋白。ALDH2C4的cDNA序列全长1 506 bp,编码501个氨基酸,该基因编码蛋白质的相对分子质量为54.82 kDa,理论等电点为6.58,蛋白二级结构以α螺旋为主,是不具有跨膜结构的膜外蛋白。BLASTp分析结果表明,这2个基因所编码序列与麻疯树、蓖麻的乙醛脱氢酶一致性最高,高达80%以上,含有醛脱氢酶基因家族的保守结构域。     

毛竹PeAMT2;1基因克隆及表达分析

铵态氮是植物吸收利用的主要氮源之一,铵态氮的吸收主要通过铵转运蛋白(AMT)进行。为从分子水平上探讨竹子中AMT的分子特征,本研究通过RT-PCR的方法对毛竹(Phyllostachys edulis)中的一个AMT基因编码区进行了克隆分析,并对其系统进化和表达模式进行了分析。结果表明,该基因的开放阅读框为1458 bp,与NCBI数据库中毛竹序列(FP095543)的一致性为99.04%,被命名为PeAMT2;1。PeAMT2;1编码485个氨基酸,分子量为51.62 kDa。蛋白序列分析表明,PeAMT2;1编码的蛋白序列具有11个跨膜结构域,与其他植物的AMT2亚家族具有较高的同源性,聚类分析与水稻、二穗短柄草等的AMT2亚家族成员在同一个分支。组织表达分析表明,PeAMT2;1在毛竹的根、茎、叶中均表达,但在根和茎中表达量相对较高。本研究对于今后深入了解PeAMT2;1的基因功能奠定了基础。     

闽楠中WRKY家族成员鉴定及缺磷胁迫下表达分析

【目的】在闽楠全基因组范围内鉴定WRKY家族成员，分析基因和蛋白序列结构特点及在闽楠幼苗缺磷胁迫下的表达特征，筛选响应缺磷逆境的WRKY基因，为进一步研究它们在楠木磷饥饿响应分子途径中的功能以及耐低磷胁迫分子辅助育种提供参考。【方法】利用WRKY蛋白序列的隐马尔科夫模型(pfam03106),经hmmsearch在闽楠蛋白数据库中检索，筛选WRKY基因。对获得的PbWRKYs利用Protaram、GSDS2.0、MEGA、Batch CD-Search、TBtools和ClustalX等软件进行基因结构、定位分析，蛋白理化性质、序列特征分析以及进化树构建。提取3年生闽楠植株的根、韧皮部和形成层、木质部和叶的RNA,进行转录组测序，分析PbWRKYs在不同组织中的表达特点。对半年生闽楠植株进行缺磷水培处理，60天后，分别取缺磷处理和对照的叶和根进行磷含量测定和转录组测序，分析磷缺乏条件下PbWRKYs表达特征，并对差异表达基因进行qPCR验证。【结果】鉴定到68个WRKY基因，命名为PbWRKY1-68,在各染色体上均有分布，第3号染色体上数量最多，内含子数目在1～28个之间，蛋白分子质...     

珙桐DiZF-CCCH1基因的克隆及表达分析

【目的】珙桐Davidia involucrata有性生殖能力弱是限制其自然更新的主要原因。为研究珙桐种子发育的分子机制,本课题组前期完成了珙桐种子转录组分析,筛选到1个编号为c37849.graph_c0的转录本,其在正常种子中高量表达,而在发育异常的种子中表达量很低,差异表达显著,因此将其作为研究目标。【方法】使用PCR克隆该转录本的全长序列,并利用在线分析工具对其编码氨基酸的序列特征、蛋白结构和系统进化等进行生物信息学分析预测,采用qRT-PCR检测目标基因在珙桐不同组织部位以及种子不同发育阶段中的表达情况。【结果】序列分析确定目标基因为一个编码CCCH型锌指蛋白转录因子的基因,将其命名为DiZF-CCCH1,该基因开放阅读框全长为711 bp,编码236个氨基酸,无内含子,相对分子量26.74 kDa,为不稳定蛋白,其氨基酸序列含有植物特有的RR-TZF结构域,与来源于甜橙Citrus sinensis的CCCH蛋白同源性最高。基因表达模式分析显示,DiZF-CCCH1在种子发育前期的表达量最高,后期表达量降低,在其他组织中仅有微量表达,推测其可能在种子发育过程中发挥重要作用。【结论】对珙桐DiZF-CCCH1基因进行了克隆与初步生物信息学分析,发现其编码的蛋白属于RR-TZF型锌指蛋白,且DiZF-CCCH1可能是珙桐种子发育过程中的重要调控基因,为进一步探索该基因在珙桐生殖发育过程中的功能奠定基础。     

茶树2个MYB转录因子基因的克隆及表达分析

MYB类转录因子是一类包含一段保守的DNA结合结构域的基因家族,广泛地参与植物发育和植物次生代谢的调节。根据前期芯片杂交和文库筛选得到的2个MYB转录因子的部分序列,采用RT-PCR和RACE技术分离得到它们的全长基因:CsMYB1和CsMYB2,在GenBank的登录号分别为HQ660373和HQ660374。序列分析表明:CsMYB1基因全长1132bp,开放阅读框长879bp,编码292个氨基酸,推测的蛋白分子量约为32.9ku,理论等电点为8.13;CsMYB2基因全长1020bp,其中开放阅读框长675bp,编码224个氨基酸,推测的蛋白分子量约为25.4ku,理论等电点为9.05。2个基因编码的蛋白均具有明显的R2R3MYB结构域,且在R3结构域的下游都含有1个相对保守的C1(LIXXGIDPXTHR)基序。同源性分析表明:茶树CsMYB1和CsMYB2编码的氨基酸序列与其他植物的MYB类转录因子具有较高的相似性,其中CsMYB1编码的氨基酸序列与陆地棉MYB1的相似性为57%,CsMYB2编码的氨基酸序列与葡萄MYBC2的相似性为75%。利用荧光定量PCR技术检测2个转录因子基因在遮荫处理条件下的表达规律,及其在茶树不同组织中的表达特性,结果表明:CsMYB1和CsMYB2在不同组织中均有表达,但表达量具有明显区别,其中CsMYB2在叶片中的相对表达量是根中的100多倍;而遮荫处理能明显降低叶片中的花青素含量,并提高CsMYB1的表达,但对转录因子CsMYB2的影响不大。     

中华大节竹耐盐基因Is SOS1的克隆与序列分析

通过RACE技术,从中华大节竹根中克隆出一个质膜型Na+/H+逆向转运蛋白基因,并命名为Is SOS1(基因登录号:KC113048)。Is SOS1序列分析结果显示,Is SOS1的全长为3 516 bp,其中开放读码框为3 105 bp,编码了1 035个氨基酸多肽。氨基酸同源性和聚类分析证实,Is SOS1氨基酸序列与拟南芥At SOS1和水稻Os SOS1的氨基酸序列同源性较高,分别为50. 3%和76. 63%,但是与液泡型的Na+/H+逆向转运蛋白氨基酸序列同源性较低。     

普通油茶两个Δ-12脂肪酸脱氢酶基因序列特征及表达模式研究

[目地]研究普通油茶油脂成分形成的调控机制。[方法]通过转录组测序获得2条普通油茶Δ-12脂肪酸脱氢酶基因序列,分别命名为Cofad6和Cofad2-2,并对这两个基因及其编码蛋白的序列特征进行比较,对其基因表达量与脂肪酸成分含量的相关性进行分析。[结果]Cofad6基因c DNA编码区全长1 347 bp,编码448个氨基酸;Cofad2-2基因c DNA编码区全长1 152 bp,编码383个氨基酸。经比对,Co FAD6蛋白与其余物种FAD6蛋白有65.7%83.68%的氨基酸同源,Co FAD2-2与浙江红花油茶FAD2-2蛋白有99.22%的氨基酸同源,与其余物种的蛋白质78.59%81.72%同源。蛋白质二级结构分析表明,Co FAD6和Co FAD2-2均具有一个脂肪酸去饱和酶结构域,属于脂酰-Co A去饱和酶基因家族;两者均为跨膜蛋白,且Co FAD2-2具有定位于内质网的保守模序。定量PCR检测发现,在普通油茶‘长林4号’无性系未成熟种子中,Cofad6表达量随着种子发育先升高后降低,而Cofad2-2基因随着种子发育表达量逐渐降低,与种子油脂中亚油酸、亚麻酸含量变化趋势呈显著正相关,与油酸含量变化呈显著负相关。[结论]推测Cofad2-2基因是调控普通油茶种子油脂中油酸和亚油酸含量的关键基因之一,该研究为普通油茶油脂改良基因工程育种奠定了基础。     

馥郁滇丁香LgFKF1基因的克隆及节律表达分析

[目的]研究馥郁滇丁香LgFKF1基因的结构特点及其在特异组织中的节律表达特征,探索其在成花调控过程中的作用。[方法]采用RACE技术克隆获得馥郁滇丁香LgFKF1基因的cDNA全长序列,利用生物信息学方法对获得的基因核昔酸序列及编码蛋白质序列进行分析,利用qRT-PCR技术对特异组织的节律表达模式进行分析。[结果]序列分析表明:LgFKF1基因cDNA全长为2 271 bp,开放阅读框为1 917 bp,编码一个638个氨基酸的蛋白质;推导的氨基酸序列与扁果树、软枝黄蝉、纳塔尔倒吊笔、马利筋的FKF1蛋白具有较高同源性,达92.59%;预测LgFKF1蛋白属于不稳定的亲水性蛋白,定位在细胞核,无信号肽和跨膜区;结构主要由无规则卷曲结构、α螺旋结构、扩展长链和β-转角构成;遗传进化关系与扁果树最亲近。qRT-PCR分析表明:Zg如7在诱导光周期下处理7d时较非诱导光周期下的表达量高,而诱导光周期下处理10d后其表达量则低于非诱导光周期的表达。一天中,在各组织中均有表达,且以叶片中的相对表达量较高。LgFKF1因组织不同在不同的时间呈现出单峰和双峰表达,其中,根、芽及花蕾中均在夜间23:00出现单峰表达;茎、叶及开放的花朵中在不同时间出现双峰表达,茎在晚上20:00和凌晨5:00,叶在凌晨2:00和早上8:00,开放花朵在夜间23:00和凌晨5:00. [结论]从馥郁滇丁香中克隆获得了LgFKF1基因,其编码的蛋白序列与其它植物的FKF1具有较高的同源性。LgFKF1基因的表达受光周期影响,在诱导光周期下,不同的组织呈现出不同的表达模式,其中,仅叶片中的1个表达峰值出现在白昼,其余组织中的表达峰值均出现在夜间。在各组织中,叶片中的表达量较高。LgFKF1基因的特异组织节律表达有助于为其生物学功能的进一步研究提供参考依据。     

板栗脂质转运蛋白基因的克隆及表达

利用RACE技术从板栗短雄花序突变体中扩增得到660bp的板栗脂质转运蛋白(lipid transfer protein,LTP)cDNA片段。该cDNA编码118个氨基酸,具有8个位置保守的半胱氨酸(C)残基及26个氨基酸的信号肽,它与棉花、草莓脂质转运蛋白氨基酸序列相似性为63%,基因序列已提交数据库(GenBank),其登录号分别为FJ490676(基因)和ACL01093(蛋白)。荧光定量分析表明板栗短雄花序突变体较正常雄花序的脂质转运蛋白表达量更高。将板栗脂质转运蛋白基因插入到硫氧还蛋白融合表达载体pET32a(+)中,构建了板栗的原核表达载体pET-LTP,在大肠杆菌菌株Rosetta-gamiTM2(DE3)中,IPTG诱导5h大量表达约为30ku的融合蛋白,通过Ni2+-chelating sepharose fast flow柱纯化的融合蛋白具有抑制板栗镰刀菌属病原真菌孢子萌发的功能。     

荔波连蕊茶GA2ox1基因的克隆及表达分析

[目的]GA2氧化酶是赤霉素生物合成代谢过程中关键酶之一,GA2ox家族基因常被用于植物矮化基因工程育种。[方法]根据植物GA2氧化酶基因编码区的保守序列设计引物,以山茶属荔波连蕊茶嫩枝为材料,提取总RNA,进行RT-PCR。采用RACE技术扩增获得1 371 bp的GA2ox基因全长cDNA序列,命名为ClGA2ox1(GenBank登录号KJ502290)。[结果]序列分析表明,ClGA2ox1放阅读框(ORF)为1 002 bp,编码333个氨基酸,5'非编码区59 bp,3'非编码区310 bp。预测的蛋白质分子量为37.31 kD,等电点为5.92,具有GA2ox超基因家族的保守结构域和特有的氨基酸残基。ClGA2ox1蛋白与GenBank中收录的其它植物GA2ox蛋白氨基酸的相似性达到80%。构建系统进化树,结果显示山茶GA2氧化酶与烟草GA2ox蛋白的亲缘关系最为密切。实时定量PCR结果显示,该基因在荔波边蕊茶不同器官及发育不同时期的均有表达,表达量有所不同:ClGA2ox1基因在2年生茎段中的表达量最高,在嫩枝和根中也有较高的表达,而在新抽生的嫩叶中最低。[结论]试验结果为进一步明确ClGA2ox1基因的功能特征及揭示其参与调控植物生长的分子机制奠定基础。     

2个野扁桃自交不亲和SFB基因全长的克隆与序列分析

为给野扁桃的遗传改良和自交不亲和机制的进一步研究提供理论依据,以新疆野扁桃花药为试材,利用RT-PCR和RACE技术克隆野扁桃自交不亲和性花粉特异性决定因子编码基因SFB全长序列。采用BLAST进行序列比对,ORF Finder寻找开放阅读框,CDD分析蛋白保守结构域,Prot Param分析蛋白理化性质,TMHMM预测蛋白跨膜区,Signal P预测蛋白信号肽,Sub Loc预测蛋白亚细胞定位,SOPMA分析蛋白二级结构,DANMAN进行氨基酸多序列比对,MEGA6进行系统进化分析,Prot Fun预测蛋白功能。结果表明:克隆到的Pt SFB16基因和Pt SFB17基因属于F-box基因家族,与其它多种植物的SLF/SFB基因的序列相似度为88%,推导的氨基酸序列均具有F-box蛋白典型结构;Pt SFB16基因ORF长1 146 bp,编码381个氨基酸,Pt SFB17基因ORF长1 131 bp,编码376个氨基酸;预测2个SFB蛋白均为略显亲水性、不稳定的细胞质蛋白,二级结构均以α-螺旋,延伸链和无规则卷曲为主,SFB/SLF蛋白在蔷薇科李属植物中具有较高的系统进化一致性,种间同源性可能大于种内同源性,SFB蛋白可能的功能主要有辅助因子生物合成、能量代谢和裂合酶。     

绿竹BoSUT2基因的分子特征与亚细胞定位

植物蔗糖转运蛋白(sucrose transporter,SUT)作为一种功能性蛋白,在蔗糖运输以及蔗糖特异信号感应过程中发挥着重要的生理功能。采用RT-PCR方法从绿竹中分离1个新的编码蔗糖转运蛋白基因,cDNA长1668bp,编码555个氨基酸,命名为BoSUT2(注册号:EU247931)。序列分析表明,BoSUT2与其他单子叶植物的蔗糖转运蛋白有着较高的一致性,其中与绿竹BoSUT1一致性最高,达92.3%。编码蛋白二级结构预测分析显示,BoSUT2具有糖运转子保守域和跨膜结构域,属于膜蛋白。组织特异性表达检测表明,BoSUT2在叶片和叶鞘中的表达丰度较高且比较接近,在根中有微弱表达。将BoSUT2置于35S启动子之下,构建了含GFP的融合表达载体,并转化烟草悬浮细胞,观察结果表明,BoSUT2主要定位到细胞质膜上。     

低磷胁迫下杉木幼苗生长特性与内源激素的关系

【目的】研究低磷环境中,不同磷利用效率杉木家系幼苗生长特性与其叶片和根尖内源激素含量变化的相关性,为进一步揭示磷高效利用杉木基因型对低磷胁迫响应策略的内在调控机制提供参考依据。【方法】选择在缺磷环境下磷素利用效率较低的No.4与磷素利用效率较高的No.41杉木半同胞家系为研究对象,通过设计3个供磷水平(P0:不供磷,0 mmol·L~(-1)KH_2PO_4;P_1:低度供磷,0.5 mmol·L~(-1)KH_2PO_4;P_2:正常供磷,1.0mmol·L~(-1)KH_2PO_4)的室内沙培模拟试验,分别测定2个家系幼苗在不同供磷水平下的生长特性以及叶片与根系内细胞分裂素(ZT)、赤霉素(GA_3)、生长激素(IAA)和脱落酸(ABA)含量的变化。【结果】1)不供磷条件下,41号家系杉木幼苗根长、根表面积和根平均直径的增量以及根冠比均明显高于4号家系(P0.05)。2)低度供磷条件下,4号家系杉木幼苗叶片内ZT和IAA含量显著高于41号家系,而这2个家系杉木幼苗在不供磷条件下根系内ZT含量与正常供磷处理相比显著降低(P0.05),IAA和ABA含量则显著增加(P0.05),且41号家系杉木幼苗根系ABA含量显著高于4号家系的任意供磷水平(P0.05)。3)正常供磷条件下,2个家系叶片、根系内源激素含量与幼苗生长特性指标均无显著相关(P0.05);低度供磷条件下,4号家系仅叶片IAA、GA_3含量与根长增量呈显著负相关(P0.05),而41号家系叶片ZT含量与根长、根表面积增量呈显著正相关(P0.05),苗高增量与IAA呈显著正相关(P0.05),与ABA呈显著负相关(P0.05);不供磷条件下4号家系叶片IAA含量与苗高增量呈极显著正相关(P0.01),根系ABA含量与根长、根表面积和根平均直径呈显著负相关(P0.05),而41号家系仅有根平均直径与ZT和GA_3呈一定的相关性(P0.05);从根冠比来看,这2个家系在低度供磷和不供磷条件下,叶片内源激素含量与根冠比未达到显著相关(P0.05),但4号家系根冠比与根系ZT含量却成极显著正相关,与GA_3含量呈极显著负相关(P0.01),41号家系根冠比与根系ZT含量呈极显著负相关,与IAA含量呈极显著正相关(P0.01)。【结论】低水平供磷条件下,磷素利用效率较低的杉木家系(No.4)幼苗根系生长量明显低于磷素利用效率较高的杉木家系(No.41);不供磷条件下,不同磷素利用效率杉木家系(No.4和No.41)叶片和根系内ABA含量均显著增加,而根系仅有ZT含量显著降低,并分别与磷素利用效率较低家系(No.4)和磷素利用效率较高家系(No.41)的根冠比呈显著正、负相关性,这可能与不同磷利用效率杉木家系幼苗在低磷环境下根系皮层组织溶解并释放磷营养的能力有关,需进一步研究。     

荔波连蕊茶肌动蛋白基因全长cDNA的克隆及其表达分析

根据植物肌动蛋白(Actin)基因编码区的保守序列设计引物,以山茶属植物荔波连蕊茶幼嫩茎段为材料,提取总RNA,进行RT-PCR。采用RACE技术扩增获得1 631 bp的Actin基因全长cDNA序列,命名为ClActin1(GenBank登录号KF366912)。序列分析表明,ClActin1开放阅读框(ORF)为1 134 bp,编码377个氨基酸,5’非编码区90 bp,3’非编码区407 bp。预测的ClActin1蛋白分子量为41.69 kD,理论等电点为5.31,具有Actin超基因家族的保守结构域和肌动蛋白家族特有的特征信号序列。ClActin1与GenBank中收录的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性在82%以上,氨基酸序列的相似性在97%以上。与其它植物肌动蛋白比较并构建系统进化树,结果显示山茶肌动蛋白与茶树和杨树的肌动蛋白的亲缘关系最为密切。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在荔波边蕊茶不同组织器官及不同发育时期的表达量稳定,表明ClActin1基因可作为内参基因。     

山新杨钾离子通道基因PdbSKOR的克隆与功能分析

【目的】植物SKOR是典型的外向整流型Shaker类钾离子(K+)通道蛋白,介导根部K+向地上部的长距离运输。本研究克隆并鉴定杨树K+通道基因Pdb SKOR,在转录水平探讨其组织特异性表达特征及对缺钾、高钾、干旱和低温胁迫的响应情况,并明确其电生理学功能。【方法】通过同源克隆法,在山新杨中鉴定并克隆1个K+通道基因Pdb SKOR;运用MEGA 7.0软件构建山新杨等14种不同科属木本植物SKOR通道成员的系统进化树;利用实时荧光定量PCR分析Pdb SKOR的组织特异性表达特征及在转录水平根部Pdb SKOR对缺钾、高钾(60 mmol·L-1KCl)、干旱(15%PEG6000)和低温(4℃)处理的响应情况;借助膜片钳系统研究Pdb SKOR的电生理功能。【结果】在山新杨中克隆1个K+通道基因Pdb SKOR(Gen Bank No. MT335814),其编码蛋白含有6个离子通道跨膜域(S1—S6)、环核苷酸结合域、Ankyrin锚蛋白域和KHA二聚体功能结构域,属于典型的Shaker类K+通道; 14种木本植物SKOR蛋白的氨基酸一致性高达81.09%,S6跨膜区的氨基酸一致性最高(96%);不同科属植物的SKOR同源蛋白在遗传进化关系上差异较大,而同一科属植物的遗传距离较近,山新杨PbdSKOR与同属杨柳科的红皮柳的同源蛋白Spu SKOR的遗传距离最近;在Pdb SKOR启动子区域预测到18种顺式作用元件,主要包括发育调控、激素响应和胁迫响应等相关的调控元件;实时荧光定量PCR表明Pdb SKOR在3年生山新杨根部的相对表达量最高,其次是盛开期花和花序,在茎部、叶片和果絮中的表达量相对较低; Pdb SKOR在组培幼苗根部的表达水平也是最高的,且在转录水平对高钾处理没有响应,但对缺钾、干旱和低温胁迫处理较为敏感,其中,Pdb SKOR在幼苗根部的表达水平受缺钾或干旱处理的抑制均显著降低,受低温胁迫诱导而显著增强;膜片钳研究表明当细胞膜电位为+20 m V时,PdbSKOR离子通道即被激活,并记录到典型的外向整流电流,并随胞外K+浓度的降低而增大,且正向电压越大,内向整流的电流越强,表明PdbSKOR是一个电压依赖的外向整流型K+通道。【结论】从山新杨中克隆并鉴定了1个K+通道基因Pdb SKOR;山新杨PdbSKOR与红皮柳Spu SKOR在系统进化关系上最近; Pdb SKOR主要在山新杨根部(成年树和幼苗)表达,幼苗根部Pdb SKOR在转录水平受缺钾、干旱和低温胁迫的调控; PdbSKOR是山新杨根部主导K+外排的通道。     

杉木对低磷胁迫的响应和生理适应机制

[目的]研究低磷胁迫对杉木幼苗各种抗氧化酶等生理指标的变化影响,探讨抗氧化酶活性与杉木耐低磷能力的关系,揭示低磷胁迫下杉木养分吸收的适应机制,阐明杉木体内生物大分子对低磷胁迫的响应。[方法]通过设置不同磷浓度(0、0.25、0.50、1.00 mmol·L~(-1))Hoagland营养液,模拟低磷胁迫试验,测定低磷胁迫对杉木幼苗的生理指标的影响,研究低磷胁迫对杉木幼苗养分吸收的影响机制以及测定杉木幼苗不同部位的光谱特性。[结果]随着缺磷程度的增加,杉木幼苗中SOD活性、CAT活性以及叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总量均先升后降,根系中POD活性呈现出升高的趋势、MDA含量先降再升后降,叶片中POD活性和MDA含量先降后升。低磷胁迫对杉木幼苗根系和叶片吸收利用营养元素有显著影响。杉木苗根系所含的Mn随着缺磷程度的增加呈上升趋势,而Al和Cu先降后升,Fe和K则有所下降,Ca先升后降。此外,杉木叶片中Fe和Mn的积累量呈降低的趋势,Cu和K先升后降。低磷胁迫对杉木幼苗根系和叶片组织在3 367、2 924、1 736、1 630、1 380、1 150 1 000 cm~(-1)处特征峰吸光值影响不同。[结论]低磷胁迫下,杉木幼苗的根系和叶片会通过改变保护酶(SOD、CAT和POD)活性抑制MDA形成,降低膜脂过氧化对细胞膜系统的破坏,通过增加对其他养分元素的吸收来规避损伤以及通过改变不同部位糖类、氨基酸和蛋白质等物质含量来适应低磷环境。     

美国白蛾HcSID-1基因的克隆、表达模式分析及其在幼虫中的功能验证

【目的】克隆美国白蛾系统性RNA干扰缺失基因序列,对该基因进行序列特征分析和时空表达模式检测,并研究其在美国白蛾幼虫系统性RNA干扰中的功能。【方法】通过RT-PCR和RACE技术从美国白蛾幼虫中进行基因克隆,并进行生物信息学分析;利用qPCR技术检测该基因在美国白蛾不同发育阶段和幼虫不同组织中的相对表达量;利用RNAi和qPCR技术验证外源dsRNA对该基因的干扰效率,以及干扰该基因表达后对其他靶标基因干扰效率的影响。【结果】从美国白蛾幼虫中克隆得到一个美国白蛾系统性RNA干扰缺失基因并命名为HcSID-1(Gen Bank登陆号:MG696730)。该基因全长2 761 bp,开放阅读框(ORF) 2 613 bp,编码870个氨基酸,预测蛋白分子量为97. 08 kD,理论等电点(pI) 6. 81,有1个19 aa的信号肽。氨基酸序列分析表明,Hc SID-1蛋白有1个长N末端(308 aa),序列中后段309—855位氨基酸之间具有典型的11个跨膜结构域;系统进化分析表明HcSID-1与鳞翅目昆虫同源性较高,和家蚕的Bm SID-3亲缘关系最近;时空表达分析表明,HcSID-1在美国白蛾各发育阶段和幼虫各组织中均有表达,在幼虫中肠组织表达量最高。注射HcSID-1 dsRNA可显著降低该基因在转录水平的相对表达量,且该基因的下调能降低HcChi dsRNA在美国白蛾幼虫中的RNA干扰效率。【结论】获得具有典型家族特征的美国白蛾SID-1基因序列,该基因的下调能够影响其他靶标基因dsRNA的RNAi效率,表明该基因可能具有与其他SID基因在系统性RNAi过程中相同的功能。