CPA-核酸试纸条检测鸭肉源性成分方法的建立和优化

为建立简单、有效的动物源性成分定性检测方法,根据交叉引物恒温扩增技术(CPA)原理,以鸭属线粒体D-loop基因序列设计引物和探针,优化反应体系与恒温扩增条件,并配合核酸试纸条显色,建立鸭肉源性成分的快速检测方法。结果表明,建立的鸭D-loop基因CPA扩增体系中交叉引物、内引物、外引物分别为0.6、0.3、0.1μmol·L-1,Mg SO4为8 mmol·L-1。在63℃、60min恒温扩增条件下,单一鸭源性DNA成分检出限为0.1 ng·μL-1,对混合肉制品中鸭肉成分的检出比例为1%(相当于1ng·μL-1)。本研究建立的鸭源性成分检测方法为肉制品掺假鉴定提供了有效的手段。     

应用PCR技术检测饲料中的鱼源性成分

PCR方法在动物源性饲料检测中有很好的应用前景。为了有效检测反刍动物饲料中的鱼源性成分，降低疯牛病传播风险，本研究根据鱼线粒体1DNA 6S rRNA序列设计并筛选了鱼源性特异引物，使用Qiagen公司的组织DNA提取试剂盒提取核酸。PCR特异性检测结果表明，引物NC_Fish2480/2501F/ NC_Fish2565/2586R与牛、羊、猪、鸡成分无交叉反应；灵敏性检测结果表明，该引物可以检测到0.1%的鱼源性成分。该方法的建立为饲料中鱼源性成分的PCR检测提供了依据。     

Semi-nested PCR检测饲料中牛羊源成分

加强对进口饲料中牛羊源成分的检测是防止疯牛病和痒病传播的一个重要措施。根据已发表的牛和羊特异性基因及引物序列，分别设计了1条牛和羊特异性semi-nested PCR引物，并采用semi-nested PCR技术对饲料中的牛和羊成分进行了扩增检测。结果表明，semi-nested PCR能够扩增得到247 bp的牛特异性基因条带和214 bp的羊特异性基因条带，其对饲料中牛或羊源性成分的检测灵敏度可达到0.00001%～0.0001%，比普通PCR检测灵敏度要高出103倍；对牛或羊成分DNA的检测灵敏度可以达到10-6～10-5 ng，比普通PCR检测灵敏度要高出105倍以上。该技术具有快速、灵敏和结果稳定的特点，是检测饲料中痕量牛羊源成分的一种有效方法。     

狐狸肉源性成分快速检测方法的建立

为了规范食品安全标识,防止非食用性的狐狸肉添加到肉品中导致伦理、宗教等敏感问题,迫切需要建立狐狸肉源性成分鉴定方法。本研究以狐狸、牛、羊、猪、鸭、驴和鼠肉以及模拟掺假样本为研究对象,根据狐狸线粒体基因序列设计特异性交叉引物组合,Bst DNA聚合酶反应体系经63℃恒温扩增60 min,扩增产物经电泳检测和一次性核酸试纸条检测,显示结果一致,建立了交叉引物等温扩增技术与核酸试纸条检测结合的快速检测狐狸源性成分的方法。本研究建立的狐狸肉源性成分特异性的等温扩增体系,对单一狐狸源性DNA成分的灵敏度为10 ng·μL^-1,对狐狸肉与羊肉混合物中狐狸肉成分的检出比例为1%,可为肉制品市场现场检测提供简便、经济、快速有效的技术支持。     

栽培种花生AFLP标记体系的优化及多态性引物筛选

为建立并优化适合花生的EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ内切酶组合的AFLP标记技术体系,本试验对花生基因组DNA大样提取方法、双酶切反应、连接体系、预扩增和选择性扩增等影响因素进行反复调试与优化,并对适合花生AFLP分析的引物组合(E/M)进行多态性筛选。结果表明,高质量的模板DNA提取采用改进的SDS-CTAB法,DNA样品的浓度在150~200 ng·μL~(-1),37℃双酶切3.0 h,接头浓度为50pmol·μL~(-1),T4-DNA连接酶浓度为10 U·μL~(-1),16℃连接10 h。以2×Es Taq MasterMix(含有Es Taq DNA Polymerase,3 mmol·L~(-1)MgCl_2和400μmol·L~(-1)d NTP)作为PCR反应原料,其中,预扩增反应体系为50μL,预扩增引物(E00和M00)的浓度为50 ng·μL~(-1),预扩增产物最适稀释倍数为20倍;选择性扩增反应体系为20μL,扩增产物中加入10μL Loading Buffer,经95℃变性10 min后,立刻转移到冰浴中冷却备用。最终,从225对AFLP引物组合中,筛选出稳定且多态性丰富的42对引物组合,可用于后期作图群体基因型检测和种质资源遗传多样性分析。本研究结果为下一步构建花生高密度遗传连锁图谱和开展分子标记辅助育种奠定了基础。     

硝普钠(SNP)对红毛丹采后生理指标的影响

以海南红毛丹"保研7号"为试验材料,分别置于10μmol·L~(-1)、100μmol·L~(-1)、200μmol·L~(-1)的SNP溶液中,对褐变指数、果实硬度等生理指标进行测定,以筛选最适保鲜浓度。结果表明,与对照相比,3种浓度SNP对红毛丹生理指标变化均有明显影响,以浓度200μmol·L~(-1)的SNP处理的保鲜效果最佳。浓度200μmol·L~(-1)的SNP处理可有效延缓果实褐变指数上升,有效延缓果实变软过程,有效延缓果实中丙二醛(MDA)含量增加及可溶性蛋白质蛋白含量下降。其中,贮藏至第7 d时,200μmol·L~(-1)处理的红毛丹可溶性蛋白含量为0.25 mg·g~(-1),较对照高47.2%,而MDA含量活性值为2.18μmol·g~(-1),仅为对照的82.3%。实验表明:浓度200μmol·L~(-1)的SNP溶液处理能较好保持采后红毛丹的各项生理指标,可为红毛丹采后保鲜技术提供理论科学依据和实践指导。     

唐古特大黄SRAP反应体系优化及引物筛选

SRAP-PCR反应体系的优化是SRAP分子标记的基础,为建立高效稳定的唐古特大黄SRAP反应体系,进一步对唐古特大黄进行遗传多样性、种质资源分析,本研究在单因素试验基础上,对唐古特大黄SRAP-PCR反应体系主要影响因素Mg~(2+)、d NTPs、引物、Taq酶进行正交试验L9(34)。结果表明,唐古特大黄最佳SRAP-PCR反应体系为:Mg~(2+)0.5 mmol·L~(-1),d NTPs 0.4 mmol·L~(-1),引物0.2μmol·L~(-1),Taq聚合酶0.06 U·μL~(-1),总体积25μL。利用最优体系进行引物筛选,从58对SRAP引物中获得了30对条带清晰、多态性好的引物对组合。SRAP-PCR优化反应体系的建立为利用SRAP技术进行唐古特大黄种质资源分析、遗传多样性研究等奠定了基础。     

不同动物部分组织基因组甲基化程度的差异分析

应用甲基敏感扩增多态性(MSAP)技术,检测和分析了猪、牛、羊、小鼠、鸡和鸭基因组的甲基化程度。结果表明,对CCGG位点,实验中检测的几种动物的甲基化程度多数在0.40￣0.50之间(不包括牛);不同动物来源相同组织基因组的甲基化程度不同,相同动物不同组织基因组的甲基化模式具有特异性;同一种动物,组织基因组的甲基化程度一般都高于血液基因组;另外,哺乳动物与禽类基因组甲基化程度未发现较大的差别,但哺乳动物基因组全甲基化位点较多,半甲基化位点较少。     

柠檬酸对西瓜幼苗铝毒害的缓解作用

为了探究柠檬酸对西瓜幼苗铝毒害的缓解作用,本试验采用水培法,以早春红玉(耐铝型,HY)和早蜜王(铝敏感型,ZM)2个西瓜品种为材料,用不同柠檬酸浓度(200、400、800、1 200μmol·L~(-1))处理铝胁迫(1 500μmol·L~(-1))下的西瓜幼苗,研究不同柠檬酸浓度对西瓜幼苗生长和生理特性的影响。结果表明,铝胁迫对HY和ZM幼苗的生长和生理均产生了明显的毒害作用,与HY相比,ZM受毒害的程度更大。加入柠檬酸后,铝对HY和ZM的毒害作用得到了有效的缓解,且缓解效果存在浓度差异,在一定浓度范围内(≤800μmol·L~(-1)),随着柠檬酸浓度增加缓解效果增强,其中以800μmol·L~(-1)效果最佳;当浓度增至1 200μmol·L~(-1)时,缓解效果反而减弱。柠檬酸对ZM的缓解作用强于HY,同时随着处理时间的延长柠檬酸缓解效果越明显。综上所述,柠檬酸能够有效缓解铝对西瓜幼苗的毒害作用,以400~800μmol·L~(-1)解毒效果最佳。本研究结果为明确柠檬酸缓解西瓜铝毒害作用机制以及西瓜优质高产栽培提供了理论依据。     

探究阿苯达唑对猪带绦虫糖原的影响

为探究阿苯达唑对体外培养的猪带绦虫不同部位(头部、颈部、节片)的糖原作用效果,分别制备浓度为0μmol·mL~(-1)、10μmol·mL~(-1)、20μmol·mL~(-1)、30μmol·mL~(-1)、40μmol·mL~(-1)的阿苯达唑溶液,并加入等量含营养液的生理盐水,在此条件下各培养24 h、48 h、72 h、96 h,最后采用石蜡切片法制片、染色,观察猪带绦虫糖原在头部、颈部、节片的情况。结果表明:阿苯达?破坏猪带绦虫的最佳浓度为20μmol·mL~(-1),且随着时间的延长,糖原可被完全破坏。此外,颈部糖原减少最明显,说明阿苯达?对颈部糖原破坏最大。     

不同浓度CO2施肥对温室番茄果实积硒效应的影响

试验以"兴海12号"番茄为研究对象,在施用4种不同浓度的CO_2的基础上,又对每个CO_2浓度处理下的番茄做了4个不同浓度的硒处理。研究了不同浓度CO_2施肥对番茄积硒效应的影响。设各独立隔间CO_2浓度依次为大气浓度(CK)、(600±25)μmol·mol~(-1)(T1)、(800±25)μmol·mol~(-1)(T2)、(1 000±25)μmol·mol~(-1)(T3)。在此基础上每个隔间的番茄材料实施包括空白在内的4个硒水平的处理L0(空白)、L1(2 mg·L~(-1))、L2(4 mg·L~(-1))、 L3(6 mg·L~(-1))。在相同的CO_2条件下叶面喷硒,随着施硒浓度的升高,使番茄果实内总硒和有机硒含量均有所升高,并且当施硒浓度相同时,随着CO_2浓度升高,番茄果实内总硒及有机硒都有显著的提升,且800μmol·mol~(-1)处理下效果最佳。本次试验在研究了CO_2施肥对番茄硒积累及转化的同时也比较了不同CO_2与亚硒酸钠的不同组合配施下成熟果实主要营养物质含量,结果为单独施硒与CO_2以及硒与CO_2的配施均使番茄营养品质得到提升。果实内维生素C、番茄红素及可溶性总糖在组合T2L3(CO_2浓度为800μmol·mol~(-1),硒浓度为6 mg·kg~(-1))时含量最高,提升显著。在T3L2(CO_2浓度为1 000μmol·mol~(-1),硒浓度为4 mg·kg~(-1))时有较高的糖酸比。     

牛、羊肉中水貂、猪、鼠混杂成分的多重荧光PCR鉴定方法的建立

针对现阶段肉类食品市场中出现的以劣充优的掺假问题,通过视觉、触觉、嗅觉和味觉等传统方法来鉴定肉的外观、色泽、气味和硬度,已不能满足现阶段肉类质量和源性的鉴别要求。基于现代分析仪器和生物技术的肉类掺假识别方法主要包括:基于蛋白质的检测方法、酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、色谱分析方法和基于DNA序列的分子生物学检测方法。其中,基于DNA序列的分子生物学检测方法特别是荧光PCR法具有特异性强、灵敏度高,快速准确的优点。本实验运用了多重荧光PCR的技术,建立了检测牛羊肉类中掺杂水貂(Mustela lutreola)、猪(Sus scrofa)、鼠(Mus musculus)3种动物源性成分的检测方法。在3种动物源性的线粒体16S r DNA的保守区设计了一对通用引物,在可变区设计了水貂、猪、鼠3种物种特异性的分子信标探针,分别进行了探针的特异性验证、实验体系的灵敏度验证和样品的检出限实验。特异性验证中,3种探针均可有效排除其他物种DNA的干扰,特异扩增;灵敏度验证实验中,设置了7个DNA浓度稀释梯度,每个梯度6个重复,确定了该体系的灵敏度为0.01 ng/μL;样品检出限实验中,设置了3种掺杂方式,每种方式7个不同的掺杂质量比,每个质量比4个平行样,确定了本实验的样品检测灵敏度可达到1%(质量比)。本研究结果显示,本方法能特异、准确、灵敏地鉴别出牛羊肉中水貂、猪和鼠的掺杂成分,为多物种的源性鉴别提供了科学依据。     

分散液液微萃取与GC-MS联用分析葡萄酒中苯醚甲环唑残留

为建立葡萄酒中苯醚甲环唑的测定方法,以超声辅助-凝固-漂浮分散液液微萃取(UADLLME-SFO)为富集、净化手段,采用气相色谱-质谱(GC-MS)联用法检测葡萄酒中苯醚甲环唑的残留量,应用正交试验对萃取参数进行优化。结果表明,最适宜的萃取条件为:萃取剂十一醇30μL、超声时间5 min、氯化钠浓度30 g·L~(-1),此条件下苯醚甲环唑的检出限为2.3 ng·L~(-1),相对标准偏差(n=5)在3.5%~6.2%之间,当添加浓度为1μg·L~(-1)和50μg·L~(-1)时,苯醚甲环唑的添加回收率在90.2%~98.4%之间。本研究结果为葡萄酒中苯醚甲环唑残留的检测提供了研究方法和科学依据。     

进口饲料中牛、羊源成分的PCR同时检测方法

为防止疯牛病和痒病的传入，研究提供了一种利用Chelex-100快速提取动物基因组DNA的方法，并依据牛、羊线粒体基因的同源性序列片段，设计1对通用引物，通过PCR扩增，实现了对进境饲料中牛、羊源成分的同时检测。该方法简单、快捷，在口岸检疫部门中有一定的推广价值。     

多重PCR筛查检测进口转基因玉米

为获得进口转基因玉米筛查检测策略,并根据策略建立多重PCR方法,对15个进口转基因玉米分子特征进行分析。结果表明,将P-Ca MV 35S、T-NOS等2个基因组合作为检测策略可全部检出15个进口转基因玉米至少1次;将P-Ca MV 35S、P-ract1、T-NOS、bar、pat、PMI等6个基因组合作为检测策略,除MON810检出1次外,其他每个转化体可检出至少2次。同时,利用获得的筛查检测策略建立多重PCR体系,对2个基因组合的策略优化,结果表明适宜退火温度为58℃,适宜引物终浓度(μmol·L-1)配比为0.2∶0.2;对6个基因组合的策略优化,结果表明适宜退火温度为60℃,引物终浓度配比为0.2∶0.1∶0.1∶0.1∶0.1∶0.05。采用已知样品对多重PCR体系进行验证,图谱显示与转化体分子特征完全一致。该研究结果将为进口转基因玉米筛查检测提供参考。     

多重PCR检测耐除草剂转基因作物

为建立耐除草剂转基因作物的高通量检测方法,本试验以目前生产上广泛应用的5种除草剂抗性基因dmo、pat、CP4EPSPS、bar和aad1为靶标进行多重PCR(MPCR)研究。通过引物适用性测试、反应体系中的不同引物浓度和反应程序中的退火温度测试、灵敏度和特异性验证等,建立了能同时检测5种除草剂抗性基因的MPCR检测方法。结果表明,当dmo、pat、CP4EPSPS、bar、aad1基因的检测引物终浓度分别为0.2、0.2、0.3、0.4、0.2μmol·L^-1,退火温度为63℃时5种靶标扩增效果较好,且特异性条带清晰且均一。此外,MPCR检测方法具有较好的特异性,对每种靶标的检测灵敏度均可达到0.1%。适用性测试结果显示,MPCR检测方法可对含有5种除草剂抗性基因的多种转基因作物的单个品系或多个品系混合物进行筛选检测。无假阳性和假阴性结果表明,MPCR检测方法对实际样品具有很好的适用性。本试验结果为筛选高效耐除草剂转基因作物检测技术提供了一定的理论依据。     

外源一氧化氮与水杨酸对盐胁迫下小麦幼苗生理特性的影响

在液培条件下,以小麦(山农22号)为试验材料,外源一氧化氮(Nitric oxide, NO)供体硝普钠(Sodiumnitroprusside,SNP)和水杨酸(Salicylicacid,SA)作为调控物质,研究外源NO和SA单独及复配施用对120mmol·L~(-1)NaCl胁迫下小麦生长及生理特性的影响。结果表明,120mmol·L~(-1)NaCl胁迫严重抑制了小麦幼苗的生长,添加适宜浓度的SNP(100μmol·L~(-1))或SA(100μmol·L~(-1))均能显著缓解盐胁迫对小麦造成的伤害。而与单独添加SNP或SA相比,SA+SNP复合调控更能明显降低盐胁迫诱导的活性氧(Reactive oxygen species, ROS)积累、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量以及电解质渗出率;提高小麦叶绿素含量、抗氧化酶活性和脯氨酸含量,从而提高其抗盐性;通过提高根系活力来促进对矿质元素的吸收,从而提高小麦幼苗的干物质积累;同时抑制了小麦对Na的吸收,以此减缓盐胁迫的毒害。由此说明NO与SA在缓解小麦幼苗盐胁迫中表现出积极的协同作用。试验各处理中施用50μmol·L~(-1) SA+50μmol·L~(-1) SNP的处理缓解小麦盐胁迫的效果最为明显。     

同步检测海水养殖动物5种病原菌的扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR)方法的建立与应用

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)是我国海水养殖动物5种重要的病原菌.本研究在分析了其致病因子基因的基础上,依据扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR)的原理,设计了5套特异性的套式PCR引物,并在各内引物的5'端分别加上能被一对通用引物识别的标签序列;通过对套式PCR中影响扩增结果的引物混合物浓度、退火温度、Mg2+浓度、dNTPs浓度以及Taq DNA聚合酶浓度等5个反应参数的调整和优化,最终建立了一种能同步检测海水养殖动物5种常见病原菌的Arm-PCR方法.优化后的Arm-PCR方法第一步PCR反应体系为:10×PCR Buffer 5 μL(含20 mmol/L的Mg2+),dNTP(各2.5mmol/L)5μL,T的酶(2.5 U/μL)0.6 μL,10×Primer Mix(2 μmol/L)5 μL,DNA模板各1μL,灭菌双蒸馏水补足至50 μL,反应的退火温度为55℃.实验结果表明:对鳗弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌和副溶血弧菌这5种病原菌,使用该方法可以在1支反应管内快速、同步进行检测,得到大小分别为144、190、266、315和371 bp的特异性产物,其检出灵敏度分别为1.745、1.847、16.000、28.126和369.900 pg细菌基因组DNA;该方法特异性强,与大肠杆菌(Escherichia coli)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、河豚毒素假交替单胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等其他细菌以及半滑舌鳎基因组DNA不产生交叉反应.2012年,应用该Arm-PCR方法对分离自病鱼的24个优势菌株进行了检测,确定出5株迟缓爱德华氏菌、3株嗜水气单胞菌、2株哈维氏弧菌及2株副溶血弧菌,证实该方法具有良好的可靠性和实用性.该方法不仅适用于海水养殖动物中致病性鳗弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、副溶血弧菌的快速、同步检测和病原流行情况调查,也为进一步开发相应的基因芯片检测方法打下了基础.     

宛氏拟青霉提取物对樱桃萝卜产量及品质的影响

为探讨植物内生菌宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)提取物对作物产量及品质的影响,以碧护(0.136%芸苔·吲乙·赤霉酸)、腐植酸钠、海藻酸为对照,通过对樱桃萝卜(Raphanus sativus L.var.radculus pers)浸种及灌根的基质栽培试验,探讨宛氏拟青霉提取物对萝卜块根产量、干物质积累量、根冠比,以及可溶性蛋白、过氧化物酶等指标的影响。结果表明,与清水处理相比,2.50μg·L~(-1)的宛氏拟青霉提取物和2.00×10~5μg·L~(-1)的腐植酸钠处理的萝卜块根产量分别显著提高64.2%和25.7%;1.00×10~5μg·L~(-1)的碧护与1.00×10~6μg·L~(-1)的海藻酸处理的萝卜块根产量分别显著降低45.8%和30.3%,其他浓度各处理的块根产量差异不显著。2.50μg·L~(-1)的宛氏拟青霉提取物处理的萝卜块根干物质积累量显著提高67.7%;2.50μg·L~(-1)的宛氏拟青霉提取物和2.00×10~5μg·L~(-1)的腐植酸钠处理的萝卜根冠比分别显著提高87.1%、60.9%。2.50μg·L~(-1)的宛氏拟青霉提取物处理的萝卜可溶性蛋白总量显著提高50.1%;2.00×10~5μg·L~(-1)碧护处理的萝卜过氧化物酶活性显著提高了31.3%。本试验条件下,2.50μg·L~(-1)的宛氏拟青霉提取物可显著提高樱桃萝卜块根产量、干物质积累量、根冠比和品质,其有效浓度仅为碧护和腐植酸钠浓度的约1/30 000,海藻酸浓度的约1/300 000,表明宛氏拟青霉提取物具有极高的生物活性和较低的应用成本。     

杧果SC-SSR分子标记反应体系的建立与优化

采用正交设计方法,对影响PCR反应体系的5个因素(Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物和模板DNA)进行了优化,建立了适用于杧果的SC-SSR-PCR反应体系。结果表明,总反应体系25μL中,包含模板DNA用量100 ng·mL-1、Mg2+浓度2.00 mmol·L-1、引物浓度0.40μmol·L-1、 Taq DNA聚合酶浓度1.00 U、 dNTPs浓度0.15 mmol·L-1。利用优化的杧果SC-SSR-PCR反应体系对10对SC-SSR引物进行验证,均能扩增出清晰、明亮、特异的电泳条带。因此,优化的杧果SC-SSR-PCR反应体系适用于杧果种质鉴定和亲缘关系分析。