马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长克隆及序列分析

[目的]分离克隆马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长.[方法]根据其他松科植物α-蒎烯合成酶基因保守区域设计引物,扩增出基因的部分片段,再结合RACE技术分别扩增出基因3’端和5’端序列,通过序列拼接获得cDNA全长,结合生物信息学软件分析该基因编码蛋白的特性.[结果]马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长为2 103 bp,编码区1 980 bp,编码629个氨基酸,含有1个N端结构域、1个金属结合结构域和1个天冬氨酸富集基序（DDMYD）.[结论]该方法成功克隆了马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长序列,具有单萜烯合成酶基因的典型特征,序列提交至GenBank,获得登录号KF547035.     

百合单萜合成酶基因的克隆与序列分析

单萜化合物是‘西伯利亚’百合花香的主要成分,为了研究百合单萜化合物的合成与代谢机理,以百合的花瓣为材料,根据GenBank发表的单萜合成酶基因的保守区设计1对简并引物,通过RT-PCR与RACE相结合的方法,克隆得到一个单萜合成酶基因的cDNA序列,命名为Li-mTPS2。该基因全长为1 766bp,包含1 608bp的基因开放阅读框(ORF),45bp的5′UTR和113bp的3′UTR,编码535个氨基酸,含有萜烯合成酶(TPS)保守序列DDxxD以及TPSb亚家族共有的RRx8W基序。氨基酸同源性分析表明该基因所编码蛋白的氨基酸序列与小苍兰芳樟醇合成酶、姜花单萜合成酶、六出花月桂烯合成酶的同源性分别为55%,53%,51%。     

菊芋查尔酮合成酶基因的克隆与表达分析

为揭示菊芋(Helianthus tuberosus L.)查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因的功能,以菊芋‘廊芋8号’叶片为材料,采用同源克隆和RT-PCR技术,克隆得到菊芋CHS基因命名为HtCHS,其编码区全长为1 197 bp(GenBank登录号MN124515),编码398个氨基酸。HtCHS的基因组DNA(gDNA)全长为1 567 bp,含2个外显子和1个内含子。序列比对和系统进化树分析显示,不同植物中的CHS氨基酸序列具有极高的同源性,菊芋与同属的向日葵CHS氨基酸序列一致性达到99.25%,共聚于一个分支。HtCHS蛋白相对分子质量为43.61 ku,等电点为6.33。HtCHS蛋白具有查尔酮合成酶结构域,属于查尔酮合成酶超家族成员,HtCHS不含信号肽和跨膜区,属于非分泌蛋白。实时荧光定量PCR结果显示,HtCHS在根中表达量最高。与对照相比,150 mmol·L~(-1) NaCl和20%PEG 6000处理6 h时HtCHS表达显著上调,处理12 h时显著下调。原核诱导表达分析结果显示,成功诱导出与预测蛋白大小一致的目的蛋白。     

鹅β-防御素10基因的分离、鉴定与表达

【目的】从鹅的组织中克隆鹅β-防御素10（avian β-defensin 10,AvBD10）基因,通过大肠杆菌进行原核表达,检测重组鹅AvBD10蛋白的生物学特性。【方法】采用RT-PCR方法,从鹅的肾脏组织中扩增鹅AvBD10基因。根据已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素的氨基酸序列构建系统进化树,进行遗传进化分析;并应用荧光定量的方法对该基因的组织表达水平进行鉴定。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1 上进行原核表达,并对该重组蛋白进行纯化,测定体外生物学活性。【结果】从鹅肾脏组织中克隆出了鹅AvBD10基因,该基因的cDNA大小为207 bp,编码68个氨基酸。经遗传进化分析表明,该基因推导的氨基酸序列与鸭AvBD10的同源性最高,达92.7%。通过对重组蛋白抗菌活性的检测发现,该蛋白对12种致病性细菌均具有较强抑菌作用,但在高盐离子浓度下活性减弱。并且重组蛋白不具有溶血的特性。【结论】成功克隆并表达了鹅AvBD10基因,原核表达产物具有广谱的抗菌活性且不具有溶血特性。     

欧李八氢番茄红素合成酶cDNA克隆、序列分析及在大肠杆菌中的功能表达

 【目的】克隆、分析欧李[Cerasus humilis（Bge）Sok]八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase,PSY）基因,并利用大肠杆菌异源表达体系验证其功能。【方法】以欧李果实中分离的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增到PSY cDNA中间片段,再利用RACE技术获得该基因cDNA全长并分析其序列;然后利用PCR技术获得欧李PSY cDNA编码区全长,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+),获得重组质粒pET-ChPSY,转化大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达,并利用工程菌株验证融合蛋白6×His-PSY的催化活性。【结果】欧李PSY cDNA全长1 559 bp,最大开放读码框为1 194 bp,可编码398个氨基酸,命名为ChPSY。核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其它植物PSY核酸、氨基酸序列之间的相似性分别在70%和65%以上,并且发现欧李PSY的N末端存在1—55个氨基酸残基组成的转运肽信号序列,在37—58和219—240氨基酸区域包含2个跨膜结构域。SDS-PAGE分析表明,原核表达获得了具有较高表达水平的融合蛋白6×His-PSY,相对分子量约为45.8 kD。通过大肠杆菌异源表达证实ChPSY可编码一个功能蛋白,促进工程菌株中β-胡萝卜素含量增加。【结论】该研究成功地克隆了欧李PSY cDNA全长并在大肠杆菌中功能表达,为进一步研究该酶蛋白特性和欧李果实类胡萝卜素的合成机制奠定了基础。     

软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因的克隆及原核表达分析

为更好了解L-半乳糖内酯脱氢酶及编码基因在软枣猕猴桃中的生理功能及作用,以‘魁绿’软枣猕猴桃果实cDNA为模板,用RT-PCR及RACE技术,获得L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶基因AaGalLDH(GenBank:KP145007.1)。序列分析表明该基因全长为2 394 bp,开放阅读框为1 833 bp,编码610个氨基酸,与其它植物GalLDH氨基酸序列具有78%～95%的同源性。编码的蛋白序列具有GalLDH蛋白家族典型的保守结构域。进一步将该基因连接到原核表达载体并转化大肠杆菌进行诱导表达,经Western Blotting验证,目的基因在pET-28a表达系统中有表达,但基本为不溶性表达。这为进一步研究该酶蛋白的体外表达和功能以及选育高品质软枣猕猴桃品种奠定了基础。     

尾叶桉GLU4 中4-香豆酰辅酶A连接酶 基因克隆及原核表达

4-香豆酰辅酶A 连接酶(4-coumarate: coenzyme A ligase,4CL）是木质素合成中的关键酶,根据植物中 4CL 保守序列设计引物,以尾叶桉GLU4 嫩茎为材料克隆到其4CL 基因,命名为Eu4CL。该基因gDNA 长5 534 bp, cDNA 长1 640 bp,CDS 区编码544 个氨基酸。Eu4CL 核酸序列与GenBank 已登录的桉属植物4CL 基因同源性达到 98%,与毛竹等其他科属植物4CL 的同源性达77%以上,其编码的氨基酸序列经比对发现具有完整4CL 结构域及 AMP 结合位点、CoA 结合位点,与土肉桂等植物中4CL 基因编码序列同源性也在79%以上,确定为4CL 基因。对 Eu4CL 编码蛋白序列理化性质及结构进行生物信息学分析,利用MEGA 软件对基因序列进行系统进化树分析。采用 pQE30/M15 系统对Eu4CL 进行原核表达,重组质粒成功表达目的蛋白,分子量约60 ku。本研究从尾叶桉GLU4 中克 隆得到Eu4CL 基因并原核表达,为该基因的酶学分析以及利用该基因转化调控尾叶桉木质素合成奠定基础。     

茶陵野生稻DREB类转录因子的克隆及植物表达载体的构建

采用RT-PCR技术获得了茶陵野生稻DREB类转录因子的cDNA全长.序列分析表明,此基因核苷酸序列全长为958bp,编码314个氨基酸,该序列与水稻DREB基因的同源性为98%.其编码的蛋白与小麦CRT/DREB4蛋白的同源性为93%,与大麦CBF2A蛋白和CBFIVc-14.1蛋白的同源性分别为93%和92%.推导蛋白第43～112位氨基酸为典型AP2结构,具有AP2/DREB类转录因子的基本结构特征,并构建了茶陵野生稻DREB基因的植物表达载体pWM101DREB.     

籼稻GAD基因的克隆、序列分析及其植物表达载体构建

[目的]克隆籼稻谷氨酸脱羧酶(GAD)基因的全长cDNA,并进行序列分析和植物表达载体构建,为改良水稻的营养保健品质奠定基础.[方法]根据已知植物GAD基因的保守区域设计引物,以高GABA籼稻品系“新-9-4”的胚芽为材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆GAD基因的全长cDNA;扩增其编码序列,构建双T-DNA植物表达载体.[结果]扩增获得长1962 bp的籼稻GAD基因全长cDNA(OsiGAD),包含1479 bp的开放阅读框,编码492个氨基酸.OsiGAD与已报道的水稻GAD基因OsGAD1、OsGAD2、OsGAD3的核苷酸序列同源性分别为67.1%、69.4%、98.3%,推导氨基酸序列的同源性分别为77.6%、70.1%、100.0%.OsiGAD蛋白序列具有磷酸吡哆醛结合位点和与钙调蛋白结合的C端延伸区域;构建了其具有水稻胚乳特异表达特性的双T-DNA植物高效表达载体pCDMAR-OsiGAD-hpt,选择标记基因和OsiGAD-因分别位于此载体的两个不同T-DNA区.[结论]克隆获得的籼稻GAD基因OsiGAD长1962 bp,并成功构建了其双T-DNA植物高效表达载体.     

芥蓝查尔酮合成酶基因BaCHS的克隆与序列分析

查尔酮合成酶基因是类黄酮生物合成途径的关键基因,在植物发育和逆境反应中起着重要作用.根据已发表的查尔酮合成酶基因序列设计全长引物,以芥蓝(Brassica albograbra)叶片基因组DNA和花蕾cDNA为模板,克隆到了芥蓝查尔酮合成酶基因全长序列,命名为BaCHS.该基因DNA全长为1 263 bp,具一个长度为75 bp的内含子,编码区长度为1 188 bp,编码395个氨基酸.序列比对结果表明,BaCHS基因编码的氨基酸序列与其他十字花科植物之间的同源性很高,仅存在个别氨基酸残基的差别.     

月季丁香酚合成酶基因RhEGS1的克隆及表达分析

【目的】克隆月季丁香酚合成酶基因RhEGS1的全长cDNA序列,分析其序列及表达特征,并对该基因编码的蛋白进行原核表达分析,为深入探讨丁香酚合成酶的生化特性奠定基础。【方法】根据已发表的其它植物EGS基因序列的保守结构域设计简并引物,结合RACE技术,获得RhEGS1的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用半定量RT-PCR对不同组织及不同花发育时期RhEGS1进行表达分析。采用Gateway克隆技术,构建原核表达载体,并进行原核蛋白表达。【结果】月季RhEGS1 的cDNA全长为1 207 bp,包含一个927 bp的ORF,编码309个氨基酸。同源序列比对发现RhEGS1与仙女扇的CbEGS2有83.87%的同源性,与矮牵牛PhEGS1具有81.55%同源性。表达谱分析表明,RhEGS1主要在雄蕊中表达, 且在花盛开期表达最强,而在花蕾期及凋谢期表达较弱。原核表达分析发现,在37℃、0.5 mmol•L-1 IPTG 诱导4 h 后,携带RhEGS1 ORF 的原核表达载体在大肠杆菌中生成了大量的分子量约为35 kD 的蛋白质,其分子量大小与预测的理论值相一致。【结论】从月季雄蕊中克隆到丁香酚合成酶基因RhEGS1,具有EGS基因的结构特征和完整的编码框,且在盛开期雄蕊中表达量最高。     

猪干扰素IFNE1基因克隆及重组表达载体的构建

依据电子延伸序列设计一对克隆引物,用RT-PCR法从猪胃组织扩增出猪干扰素epsilon1(IFNE1)基因的完整编码区并进行序列分析;再根据克隆的序列设计一对表达引物,用PCR法从重组克隆载体中扩增出EcoRI/XhoI酶切位点的猪IFNE1片段,插入原核表达栽体,转化至宿主菌,诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白.结果表明,克隆的猪IFNE1基因包含完整的开放阅读框架,长为586bp.ORF为582bp,编码193个氨基酸,与人、小鼠的同源性分别为83.6%和69.2%,推测的氨基酸序列与人、小鼠的同源性分别为76.2%和55.2%,表达的融合蛋白分子量约为47kD.     

龙眼子叶胚3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的cDNA克隆及序列分析

从龙眼子叶胚中分离得到一个大量表达的表达序列标签(EST),该EST编码序列与金鱼草3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的同源性为84%,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了龙眼GAPDH基因全长序列.序列分析表明,龙眼GAPDH基因的cDNA全长为1395 bp,包括一个长1008 bp、编码336个氨基酸的开放阅读框(ORF),5′端非编码区(UTR)长71 bp,3′-UTR长316 bp.龙眼GAPDH基因编码的氨基酸序列与水稻、葡萄、小果野蕉、拟南芥、银杏等GAPDH基因的氨基酸序列同源性均高达85%以上,该基因在GenBank中的登录号为FJ694011.     

棉花油菜素类固醇合成酶基因GhDWF1的克隆和表达分析

 【目的】研究油菜素类固醇物质（BRs）在棉花纤维生长发育过程中的作用。【方法】通过棉花EST序列的筛选和整合，从陆地棉徐州142纤维中克隆了一个BRs合成酶基因GhDWF1。【结果】其cDNA序列全长1 849 bp，包含一个1 692 bp的开放阅读框，推导编码563个氨基酸，与水稻、玉米、豌豆、番茄和拟南芥的BRs合成酶DWARF1/DIMINUTO有较高的同源性，具有该类蛋白的典型结构。GhDWF1基因在开花当天的胚珠和纤维中表达最强，在根、幼茎和纤维发育的各个时期表达较高。与徐州142野生型相比，无绒无絮突变体胚珠中表达量较低。【结论】暗示GhDWF1基因的表达与棉花纤维的生长发育有密切关系。     

甘薯S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因克隆与表达

从实验室建立的甘薯冷胁迫抑制消减文库中分离出一cDNA片段,经NCBI比对后发现该片段与其它植物的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因具有90%的同源性,根据相关物种S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因cDNA序列设计引物,以甘薯总RNA为模板,经RT-PCR扩增首次获得全长1182bp的甘薯SAMS完全编码区,NCBI比对分析结果表明:该片段与不同种属植物sams基因的编码区序列的核苷酸相似性达85.48%,所推导的氨基酸序列相似性达93.6%。根据核苷酸序列和氨基酸序列分别构建了SAMS系统进化树,从分子水平阐明了植物种属间的亲缘进化关系,为其种质资源利用提供理论依据。利用该序列与原核表达载体pET32a连接构建融合表达载体pET-SAMS,酶切鉴定后转入大肠杆菌BL21,在不同温度下诱导3h后均表达出一63KDa大小融合蛋白。     

芥蓝黑芥子酶基因的克隆与原核表达

根据GenBank上已公布的植物黑芥子酶基因序列设计引物,采用RT-PCR和3′/5′-RACE相结合的方法,从芥蓝中克隆出黑芥子酶基因全长cDNA序列.序列全长为1832 bp,开放阅读框为1647 bp,编码549个氨基酸,含有糖基水解酶家族Ⅰ(Glyco_hydro_1)活性位点,GenBank登录号为DQ767973.该核苷酸序列与十字花科其他植物的黑芥子酶基因序列具有较高的同源性,同油菜、萝卜、芥菜和大白菜的同源性达90%以上.利用pET28-α(+)构建芥蓝黑芥子酶基因的原核表达载体,转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表明表达蛋白的分子质量约为65 ku.     

刚竹属3种重要散生竹光系统Ⅰ基因（Lhca1）的克隆、序列分析和蛋白结构预测

光系统Ⅰ(PSⅠ)在植物光合系统中具有重要功能,Lhca1是编码PSⅠ复合物中最主要的捕光色素蛋白LHCⅠ的基因。该研究采用RT-PCR法,从毛竹中克隆了捕光叶绿素a/b结合蛋白基因Lhca-Pe01(GenBank EU035496)的全长,从红壳竹和角竹中克隆了长度分别为616、613 bp的捕光叶绿素a/b结合蛋白基因片段LhcaH01(GenBank EU513200、 LhcaJ01(GenBank EU513201)。运用生物信息学方法对其核苷酸序列、编码的氨基酸序列以及蛋白结构进行预测。结果表明,LhcaPe01基因序列从第39 bp开始到第779 bp含有1个开放阅读框和一个中止密码子,该基因全长1 051 bp,在5′端有38 bp的非编码区,在3′端含有242 bp的非编码区和Poly(A) 30 bp。对这3个基因的保守片段的序列分析表明,刚竹属3种竹种毛竹、红壳竹和角竹保守区内核酸序列同源性非常高,在禾本科内不同属之间毛竹与大麦序列同源性最高,玉米次之。编码的氨基酸序列同源性与核酸序列同源性一致,最高是毛竹与大麦,水稻次之。经推测LhcaPe01编码的蛋白质等电点和分子量分别为5.400 0和22 107.34 D。蛋白质结构预测表明,毛竹、大麦、水稻、玉米的LHCⅠ蛋白结构非常相似。      

棉花解旋酶基因克隆及生物信息学分析

从棉花cDNA文库中克隆了棉花解旋酶全长基因,GenBank登记号:EU373038,并对其编码的氨基酸序列进行分析.结果显示,基因长度为3 491 bp,编码930个氨基酸,其编码的蛋白质预测等电点和分子质量分别为5.98和103.994 ku.蛋白质氨基酸序列分析表明,所获得的基因编码蛋白的氨基酸序列与GenBank中拟南芥同源性为74%与水稻同源性为60%,与葡萄同源性为79%.     

绿竹光系统Ⅰ捕光叶绿素a/b结合蛋白基因的cDNA全长克隆及分析

为了从分子水平研究竹子光合作用的机理,采用RT-PCR及RACE方法从绿竹中分离了cab家族的一个基因,命名为BoLhca4-1(GenBank注册号为EF690303).BoLhca4-1的cDNA序列全长931 bp.含有一个735 bp的开放阅读框,编码了一个244 aa的蛋白,分子量大小约为26.8 ku.序列分析结果表明,BoLhcn4-1是光系统Ⅰ的一个捕光叶绿素复合蛋白基因,编码肽链与禾本科植物水稻的cab蛋白有着很高的同源性,达到86.1%.系统进化树分析表明,BoLhca4-1编码蛋白与水稻的cab蛋白亲缘关系较近.另外,对绿竹不同组织中BoLco4-1基因的表达进行RT-PCR检测发现,其在叶片中的表达量较鞘和茎中要高.     

大鲵胸腺素β-4全长基因的分离与表达研究

【目的】对大鲵胸腺素β-4基因进行生物信息学分析和原核表达载体构建,为大鲵胸腺素β-4蛋白生理活性的深入研究奠定基础。【方法】从大鲵皮肤cDNA文库中分离获得了大鲵胸腺素β-4基因全长序列,采用多种生物软件对其进行生物信息学分析,用定量PCR研究胸腺素β-4基因在不同组织的表达情况,并以pET32a为载体构建该基因原核表达载体。【结果】胸腺素β-4基因全长共699bp,其中开放阅读框135bp,5′-UTR 87bp,3′-UTR为474bp,该基因编码45个氨基酸,表达蛋白的理论分子质量为5 141.59u,等电点为5.34;结构分析发现,大鲵胸腺素β-4蛋白氨基酸序列的第7～43位处有"THY"特征模体,没有跨膜螺旋区、细胞膜外在跨膜结构域。氨基酸序列进化关系表明,大鲵与人、大鼠、牛、猩猩、鸡、倭蛙等动物亲缘关系较近,氨基酸同源性高于85%;与猪和爪蟾的亲缘关系次之,氨基酸同源性均为83%;而与虹鳟、大菱鲆、斑马鱼等鱼类的亲缘关系较远,氨基酸同源性低于80%。荧光定量PCR检测结果表明,胸腺素β-4基因在大鲵肺中的相对表达量最高。SDS-PAGE电泳结果表明,构建的大鲵胸腺素β-4原核表达重组菌株pET32a-Tβ4,在37℃条件下,用终浓度1.0mmol/mL IPTG诱导4h后,大鲵胸腺素β-4基因获得了较高的表达。【结论】分离获得了大鲵胸腺素β-4基因全长cDNA序列,该基因氨基酸序列与人等高等动物的同源性最高,能在大鲵肺中及大肠杆菌中获得高效表达。