中棉(Gossypium arboreum)光锈导基因Gacab启动子在转基因烟草中的功能缺失分析

分离了金华中棉(Gossypiun arboreum var. jinhua)光诱导基因cab 5'上游的调控序列1 009 bp,并对其功能进行了分析,证明获得的这一DNA片段具有驱动光诱导表达的功能。为了进一步分离具有最大转录活性的最小光诱导启动子,根据光诱导表达调控元件所在的位置,构建了Gacab P和197 bp、504 bp、779 bp的5'端缺失体,并将这些缺失体分别与gus (uid A)基因融合,构建植物表达载体。用农杆菌介导法转化烟草,获得转基因烟草。GUS组织化学分析表明,转基因烟草的T1代种子在光下培养时,只有Gacab P驱动gus基因在转基因烟草的叶片表达,其他3个启动子驱动gus基因在转基因烟草的整个植株中均有表达;当转基因烟草的T1代种子在暗中萌发及培养时,Gacab P驱动gus基因在转基因烟草中无表达,其他3个启动子驱动gus基因在转基因烟草的整个植株中均有表达。GUS定量分析表明,–504 ~ –1 bp的启动子缺失体启动活性最高,比CaMV35S启动子高0.6倍。上述结果表明只有全长的Gacab启动子具有光诱导和绿色组织特异表达特性,且–504 ~ –1 bp的启动子缺失体启动活性最高。     

陆地棉GhRACK1启动子的克隆与缺失分析

在基因工程发展中,有应用前景的纤维特异表达启动子的缺乏是制约棉花纤维品质改良的主要因素之一。本研究利用反向PCR的方法克隆到陆地棉纤维优势表达基因GhRACK1的上游启动子GhRACK1-P。GhRACK1-P全长为1987 bp,含有TATA-box、CAAT-box、MYB2和I-box等顺式作用因子和调控元件。根据调控元件的分布对GhRACK1-P进行不同程度的缺失,获得了p1、p2、p3和p4缺失体;构建不同缺失体和全长GhRACK1-P的植物表达载体并通过农杆菌介导法导入烟草,获得不同类型转基因烟草。GUS组织化学染色结果表明,全长启动子GhRACK1-P只能驱动gus基因在转基因烟草的幼根及根毛中表达,其它缺失体驱动gus基因在转基因烟草的花粉、叶片和根中表达,为组成型表达启动子。由于根毛与棉花纤维具有相似的发育机理,推测全长GhRACK1-P可能为纤维优势表达启动子。研究结果为棉花纤维品质改良基因工程提供了新的调控元件。     

受多逆境诱导表达的GhWRKY64基因启动子克隆与功能分析

WRKY蛋白属于锌指型转录调控因子,参与植物生长发育及耐逆响应。以陆地棉遗传标准系TM-1为材料,克隆Gh WRKY64(KF031101)基因上游1064 bp的启动子序列,并对其调控元件及功能进行分析。生物信息学分析表明,该区域含18个组织器官表达及诱导表达关键元件,分别为6个ROOTMOTIFTAPOX1根特异调控元件,4个CACTFTPPCA1叶肉特异性调控元件、4个OSE2ROOTNODULE病菌诱导元件、2个GTIGMSCAM4盐调控元件和2个W-box胁迫应答响应元件。将该启动子与GUS基因融合,构建p BIW64:GUS植物表达载体,通过农杆菌介导叶盘转化法获得12个转基因烟草株系。选择GUS表达量最高的p BIW64-5进行转基因不同组织器官表达及诱导表达分析。GUS组织化学染色显示,苗期的转基因烟草植株在叶和根部均具有GUS活性,开花期在转基因烟草植株根、叶及叶柄均检测到GUS活性,特别在转基因烟草的根及根尖部分染色更深,在茎和花组织上未检测到GUS活性。对该转基因烟草幼苗进行黄萎病菌诱导处理,诱导48 h后,转基因烟草幼苗根和叶片的GUS染色比未诱导处理的对照明显加深。结果表明,Gh WRKY64上游1064 bp长度的DNA序列,具有启动子的相关顺式作用元件,且为病原菌诱导型启动子。该启动子可为开展棉花抗黄萎病转基因研究提供调控元件。     

大豆CHI1基因启动子的克隆及功能初探

为了解大豆ClassⅠ几丁酶基因(Chitinase gene)对不同胁迫响应的分子机制。利用PCR技术克隆了大豆ClassⅠChitinase基因的启动子片段(Gm CHI1p),序列分析表明,扩增片段(1 641 bp)与Gen Bank中的已知序列同源性达99.8%,且含有多个胁迫响应调控元件。利用GUS基因上游无启动子的表达载体p CAMBIA1391Z,构建GmCHI1p与GUS基因融合的植物表达载体pCAM-Gm CHI1p,并通过农杆菌介导法导入烟草中。在转基因烟草愈伤组织中检测到GUS活性,表明该启动子具有启动活性。对转基因烟草中的GUS活性进行初步定性分析,结果表明,GmCHI1p可驱动GUS基因在转基因烟草的根部特异性表达,而且在伤害处理的叶片中检测到GUS的强烈表达,表现出明显的根组织特异性及伤害诱导性。这种伤害诱导仅在伤害组织部位及其附近高效表达而没有被长距离传递,预计该启动子在转基因抗虫分子育种中具有巨大的应用前景。     

Pib基因启动子内YTCANTYY暗诱导分子元件功能的转基因验证

用不同长度5′端缺失的Pib启动子驱动gus基因的水稻转基因植株, 系统研究了Pib启动子中分子元件YTCANTYY拷贝数目与该启动子启动活性和暗诱导性的关系。GUS组织化学分析结果表明, 含6个、3个和1个拷贝该分子元件的Pib启动子的转基因水稻愈伤组织在暗处理后均能在X-Gluc溶液中显示不同深浅的GUS蓝色, 而6个分子元件全部缺失的启动子片段的转基因愈伤组织不显现GUS蓝色。荧光定量分析结果表明, Pib启动子序列具有很强的器官特异性, 即便是长仅222 bp、不含YTCANTYY元件的5′端缺失体Pib启动子-gus构建的转基因植株, 其根部Pib启动子活性仍高于地上部器官。但其启动活性和暗诱导性都随启动子缺失片段的缩短即该分子元件拷贝数增加而提高。这些结果表明, YTCANTYY在Pib启动子序列中是一个暗诱导的功能性分子元件, 它赋予了启动子的暗诱导性, 至少在6个拷贝以内, Pib启动子的暗诱导活性与其拷贝数目呈正相关, 各个YTCANTYY分子元件的暗诱导活性可能是累加的。     

Pib基因启动子内YTCANTYY暗诱导分子元件功能的转基因验证

用不同长度5′端缺失的Pib启动子驱动gus基因的水稻转基因植株, 系统研究了Pib启动子中分子元件YTCANTYY拷贝数目与该启动子启动活性和暗诱导性的关系。GUS组织化学分析结果表明, 含6个、3个和1个拷贝该分子元件的Pib启动子的转基因水稻愈伤组织在暗处理后均能在X-Gluc溶液中显示不同深浅的GUS蓝色, 而6个分子元件全部缺失的启动子片段的转基因愈伤组织不显现GUS蓝色。荧光定量分析结果表明, Pib启动子序列具有很强的器官特异性, 即便是长仅222 bp、不含YTCANTYY元件的5′端缺失体Pib启动子-gus构建的转基因植株, 其根部Pib启动子活性仍高于地上部器官。但其启动活性和暗诱导性都随启动子缺失片段的缩短即该分子元件拷贝数增加而提高。这些结果表明, YTCANTYY在Pib启动子序列中是一个暗诱导的功能性分子元件, 它赋予了启动子的暗诱导性, 至少在6个拷贝以内, Pib启动子的暗诱导活性与其拷贝数目呈正相关, 各个YTCANTYY分子元件的暗诱导活性可能是累加的。     

水稻稻瘟病菌诱导表达启动子OsQ16p的克隆与功能分析

qRT-PCR分析表明,日本晴OsQ16基因受稻瘟病菌诱导表达。利用PCR技术从日本晴基因组中克隆了该基因编码区5′端上游1 229 bp的启动子序列,命名为OsQ16p。用其取代pBI121中gus基因上游的CaMV35S启动子,构建重组表达载体pBIQ16p,经农杆菌介导转化日本晴,获得转基因植株。GUS组织化学染色和qRT-PCR分析表明: (1) gus基因在抗性愈伤组织和阳性转基因植株中均能表达; (2)转基因植株在接种稻瘟病菌后12 h,GUS表达量是处理前的2.7倍; (3)抗病相关信号分子水杨酸(salicylic acid,SA)和茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)喷施转基因植株叶面后12 h,GUS表达量分别为处理前的3.1倍和3.5倍。以上结果表明,OsQ16p启动子具有启动活性,并明显受稻瘟病菌、MeJA和SA诱导表达。     

桑树1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因(MnACO)启动子功能分析

1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO)作为关键酶,能够催化1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)形成乙烯。为探究桑树MnACO基因在桑树生长发育和抵御外界胁迫中的功能,本研究构建了p MnACO::GUS的植物表达载体并转化拟南芥。采用GUS组织染色法鉴定转基因拟南芥不同生长阶段及胁迫处理后的GUS活性。通过PCR克隆得到MnACO1和MnACO2启动子片段,它们分别为1518 bp和1429 bp,启动子区域有大量的TATA-box、CAAT-box和其他响应外界刺激的顺式作用元件。GUS活性分析显示MnACO启动子能驱动GUS在拟南芥中表达;MnACO1启动子能驱动GUS在拟南芥的根、叶片、花瓣、花药、花丝、柱头以及果荚中表达,且活性较MnACO2强;MnACO2启动子不能驱动GUS在果荚中无表达。转MnACO1和MnACO2植株经不同逆境处理后GUS表达活性不同,转MnACO1植株的GUS活性随处理延长时间而减弱,转MnACO2植株GUS活性随处理时间延长而增强。q RT-PCR检测2周苗龄的桑幼苗在经过胁迫处理后Ma ACO1和Ma ACO2的基因表达量,发现Ma ACO基因的表达模式与MnACO启动子GUS活性变化趋势一致。本研究结果表明,MnACO为诱导型启动子,MnACO1兼具组成型启动子特性,MnACO2兼具组织特异型启动子特性。MnACO1在转基因植株中对胁迫响应能力更强,预示着可将其用来调控改良桑树品种抗逆性靶基因;Ma ACO2可能与果实成熟有关,可将其启动子作为果实特异性启动子对桑椹品质进行合理改良。     

甘菊DlBADH1基因启动子DBP12表达特性研究

用pCAMBIA1305.2做载体,构建含有甘菊(Dendranthema lavandulifolium)DlBADH1基因(登录号:DQ011151)启动子DBP12(登录号:DQ497621)的质粒pCHW-2.利用叶盘转化法,通过农杆菌EHA105菌株介导,将重组质粒导入烟草叶片.采用GUS组织活性检测法鉴定烟草转基因植株,结果表明:DPB12启动子驱动的GUS基因表达无组织特异性.对转基因植株进行NaCl、ABA、SA处理,GUS荧光测定发现:100μmol/L ABA胁迫处理24 h和400 mmol/LNaCl胁迫处理48 h,转pCHW-2烟草植株叶片中GUS酶活性均有大幅度提高.该结果表明:DlBADH1基因启动子DBP12是一个诱导型启动子.这一研究结果为进一步研究甘菊中BADH基因调控表达机理提供了参考.     

木薯AGPase大亚基MeAGPL3基因启动子调控区域鉴定

木薯是重要的热带作物,具有高淀粉积累等特点,但其高效积累机制尚不明确.为研究腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)大亚基对木薯淀粉积累的调控作用,本研究通过RT-PCR技术对木薯AGPase 5个大亚基基因(MeAGPL1～MeAGPL5)进行筛选,发现MeAGPL3基因在木薯块根中高表达且受100 μmol/L外源ABA正向调控;克隆了该基因2455 bp 5'侧翼序列,利用该序列及4个不同长度的5'端截短片段分别与β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因融合构建表达载体,转化本氏烟草,通过检测各转基因烟草GUS蛋白活性,发现-1至-1711 bp序列具有最佳的启动活性.利用100 μmol/L外源ABA处理各转基因烟草株系,分析处理前后GUS蛋白活性变化,发现ABA信号响应元件分布于-1711至-2150区域.本研究为从转录调控角度阐释木薯淀粉高效积累机制提供理论支撑.