犊牛睾丸细胞用于犊牛血清BVD/MD抗体检测的可行性探讨

用犊牛睾丸细胞和牛肾细胞，ＢＴ细胞，通过中和试验分别做犊牛血清牛病毒性腹泻／粘膜病（ＢＶＤ／ＭＤ）抗体的检测，检测了４１批犊牛血清样品，结果一致性较好，用犊牛睾丸细胞血清（ＢＶＤ／ＭＤ）抗体检测是可行的。     

宁夏部分地区规模化奶牛场4种疫病的血清学调查分析

为了解宁夏主要奶牛养殖区规模化奶牛场牛传染性鼻气管炎(IBR)、牛病毒性腹泻(BVD)、新孢子虫抗体和布鲁菌病原的流行状况,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对未接种过IBR、BVD、新孢子虫疫苗、接种过布鲁菌疫苗的奶牛群体进行血清抗体检测,并对银川、吴忠和青铜峡地区的阳性状况进行分析。结果发现,76份流产牛血清中,IBR抗体阳性率为50.00%(38/76),BVD抗体阳性率为19.74%(15/76),新孢子虫抗体阳性率为27.63%(21/76),布鲁菌阳性率为19.74%(15/76),4种病原均感染的阳性率为34.21%(26/76),IBR和新孢子虫混合阳性率占总阳性率的34.62%;408份非流产牛血清中,BVD抗体阳性率为12.75%(52/408),IBR抗体阳性率为21.08%(86/408);IBR和BVD在宁夏的3个主要养殖区均有不同程度的流行,其中以银川地区阳性率最高。说明宁夏部分地区IBR和BVD在不同的地区存在着不同程度的感染,流产牛中普遍存在上述4种疫病的感染并且IBR和BVD阳性率明显高于非流产牛。     

衣原体单克隆抗体在牛羊血清诊断上的应用

采用淋巴细胞亲交瘤技术，研制出的抗衣原体单克隆抗体，应用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）方法，对本地区所采集的１２８份羊血清、９０份牛血清进行检测，结果，羊血清阳性检出率为２５．８％，牛血清阳性检出率为３２．２％，选择５０份羊血清、５０份牛血清用已建立的检测衣原体抗体ＥＬＩＳＡ与间接血凝试验（ＩＨＡ）进行比较，牛血清ＥＬＩＳＡ阳性检出率为３２．０％，ＩＨＡ为２４．０％，ＥＬＩＳＡ比ＩＨＡ试验高出８个百分点；羊血清ＥＬＩＳＡ阳性检出率为２６．０％，ＩＨＡ为２２．０％，ＥＬＩＳＡ比ＩＨＡ高出４个百分点。     

用猪瘟胶体金快速检测试纸卡检测牛病毒性腹泻抗体的试验

用猪瘟胶体金快速检测试纸卡和牛病毒性腹泻(BVD)抗体ELISA试剂盒分别对50份免疫场乳牛血清和184份非免疫场牛血清进行BVD抗体检测。结果50份免疫场牛血清阳性率分别为86%和92%,184份非免疫场牛血清阳性率分别为78.8%和82.1%,检测结果相近,说明用猪瘟胶体金快速检测试纸卡检测牛病毒性腹泻抗体水平具有一定的参考价值。     

用PPA-ELISA检测鸡痘病毒抗体的研究

建立了检测鸡痘病毒抗体的ＰＰＡ－ＥＬＩＳＡ。用该法检测７５份鸡血清样品，鸡痘病毒抗体检出率（２１．３３％）高于琼脂扩散试验（１０．６７％）。经血清抗体吸收和重复性试验，证明ＰＰＡ－ＥＬＩＳＡ法具有特异性强和重复性好特点。此外，对４种封闭液的封板结果表明：１０％犊牛血清ＰＢＳ／Ｔ效果最好，次之为０．２５％白明胶ＰＢＳ／Ｔ、０．５％牛血清白蛋白ＰＢＳ／Ｔ、０．１％牛血清白蛋白ＰＢＳ／Ｔ。     

牛睾丸原代细胞在牛病毒性腹泻/粘膜病中和试验上的应用

牛病毒性腹泻/粘膜病(BVD—MD),是我国进口检疫应检疫病之一。常用的实验室诊断方法有中和试验和血清病毒分离。由于犊牛睾丸原代细胞(BT细胞)对BVD—MD病毒最敏感,常用于病毒分离。而在检测中和抗体效价时,人们常用牛肾次代细     

用PPA—ELISA检测鸡痘病毒抗体的研究

建立了检测鸡痘病毒抗体的ＰＰＡ－ＥＬＩＳＡ，用该法检测７５份鸡血清样品，鸡痘病毒抗体检出率（２１．３３％）高于琼凝扩散试验（１０．６７％），经血清抗体吸收和重复性试验，证明ＰＰＡ－ＥＬＩＳＡ法具有特异性强和重复性好特点，此外，对４种封闭液的封板结果表明，１０％犊牛血清ＰＢＳ／Ｔ效果最好，次之为０．２５％白明胶ＰＢＳ／Ｔ，０．５％牛血清白蛋白ＰＢＳ／Ｔ，０．１％牛血清白蛋白ＰＢＳ／Ｔ。     

河南省肉牛病毒性腹泻的流行动态调查研究

从河南省15个县市的规模化肉牛场和散养户随机采取血清671份熏直肠粪拭子645份熏分别用微量细胞中和试验和双抗体夹心ELISA试剂盒检测牛病毒性腹泻/黏膜病(BVD/MD)的抗体和抗原。检测结果表明:十五个县市牛群的BVD/MD平均抗体阳性率为22.9%,其中肉牛抗体阳性率为21.0%鸦BVD/MD病毒抗原阳性检出率为7.22%～23.80%,从而证实中原地区肉牛群中已普遍存在有BVD/MD。     

热应激牛初乳对新生犊牛血清免疫指标的影响研究

新生犊牛通过初乳获得被动免疫,但是关于热应激对新生犊牛被动免疫的影响程度尚不清楚。本试验旨在研究热应激牛初乳对新生犊牛被动免疫是否有显著影响,并与非热应激生产条件下进行比较。试验动物为对应于采食热应激和非热应激母牛初乳的新生犊牛各4头,在其采食母牛初乳后的不同时间内采血用于免疫指标分析。结果表明:热应激奶牛哺乳犊牛血清中各成分含量在144h内均低于非热应激奶牛哺乳犊牛血清中相对应成分,其中IgG、T3、T(472h内)变化差异显著(P<0.05),INS和IGF-Ⅰ变化差异不显著(P>0.05),热应激在一定程度上影响新生犊牛被动免疫,有关机理有待于进一步研究。     

应用小牛血清代替犊牛血清生产鸡痘细胞苗的研究试验

生产鸡痘细胞苗一直以来都是在细胞中加入适量犊牛血清的培养液进行培养．但是由于犊牛血清中广泛性的存在牛黏膜病的病毒抗体，给鸡痘细胞苗的生产带来了很大的困难。为了排除该病毒抗体的干扰，顺利而稳定地生产鸡痘细胞苗，因此笔者应用小牛血清代替犊牛血清生产鸡痘细胞苗的试验。最后测得两种细胞苗的效价基本相等．从而可以得出利用小牛血清代替犊牛血清生产鸡痘细胞苗是可行的。     

利用血清冷冻保存犊牛睾丸原代细胞试验

在不利用冷冻保护剂的条件下,用犊牛血清对经胰酶消化分散的犊牛睾丸原代细胞进行超低温冷冻保存试验。结果表明,解冻后细胞成活率达75.73%以上,培养时可有效形成单层细胞,满足常规试验要求。复苏后的犊牛睾丸原代细胞于体外培养时存在贴壁迟缓,前期生长速度较慢等现象,且要求pH值低于7.0。     

兽用生物制品生产用牛血清质量标准研究——牛血清对Sp2/0细胞增殖试验研究

为制定兽用生物制品生产用牛血清对Sp2/0细胞增殖试验的质量标准,将处于对数生长期的Sp2/0细胞分散,配制成50万/mL细胞悬液,用含10%不同牛血清的MEM营养液,在96孔细胞培养板上作对倍稀释,在5%CO2培养箱37℃培养48 h,计数每种血清对Sp2/0细胞的绝对克隆形成率。结果表明,胎牛血清对Sp2/0细胞的绝对克隆形成率为20%-26%,犊牛血清对Sp2/0细胞的绝对克隆形成率为12%-18%。以胎牛血清作为标准参考血清计算不同牛血清对Sp2/0细胞的相对克隆形成率,3批胎牛血清的相对克隆形成率均在80%以上,6批有效期之内的新生牛血清的相对克隆形成率为50%左右。因此,将兽用生物制品生产用胎牛血清对Sp2/0细胞增殖试验的质量标准规定为对标准血清相对克隆形成率不低于80%;新生犊牛血清对Sp2/0细胞增殖试验的质量标准规定为对标准血清相对克隆形成率不低于50%。     

单克隆抗体在动物衣原体病血清诊断上的应用

采用淋巴细胞杂交瘤技术，研制出的抗衣原体单克隆抗体，应用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法，对本地区所采得的231份猪血清，128份羊血清，90份牛血清进行检测，结果：猪血清阳性检出率为30．7％，羊为25．8％，牛为32．2％；选猪、羊、牛血清各50份，用已建立的检测衣原体抗体ELISA方法与的间接血凝试验（IHA）进行比较，猪血清ELISA阳性检出率为30％，IHA为26％，ELISA比IHA试验高出4个百分点。牛血清ELISA阳性检出率为32％，IHA为24％，ELISA比IHA试验高出8个百分点。羊血清ELISA阳性检出率为26％，IHA为22％，ELISA比IHA高出4个百分点。     

应用MTT比色法评价不同牛血清促细胞生长作用

细胞培养过程中血清的选择对细胞的促生长增殖具有重要作用。本试验分别以商品新生牛血清、自制新生牛血清、自制成年牛血清培养成纤维细胞、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞,通过MTT比色法来判断细胞的增殖能力,进而对血清质量作出评价。结果表明,自制新生牛血清具有良好的促细胞生长作用(相对生长率＞0.96),并且3次试验结果比较差异不显著(P＞0.05),具有较好的重复性;而成年牛血清和无血清空白对照组促细胞作用不明显。因此应用MTT比色法能够评价血清质量。     

应用MTT比色法评价不同牛血清促细胞生长作用

细胞培养过程中血清的选择对细胞的促生长增殖具有重要作用。本试验分别以商品新生牛血清、自制新生牛血清、自制成年牛血清培养成纤维细胞、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞，通过MTT比色法来判断细胞的增殖能力，进而对血清质量作出评价。结果表明，自制新生牛血清具有良好的促细胞生长作用(相对生长率＞0.96)，并且3次试验结果比较差异不显著(P＞0.05)，具有较好的重复性；而成年牛血清和无血清空白对照组促细胞作用不明显。因此应用MTT比色法能够评价血清质量。     

细胞中和试验法检测牛病毒性腹泻-粘膜病病毒抗体

用原代的、二倍体的或传代的细胞生产疫苗有成本低、疫苗含异源性成分少等优点。但影响细胞苗毒价的因素很多,我厂在生产猪瘟羊肾细胞苗时,由于牛血清中含有牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVD/MD或BVD)抗体,致使细胞不产毒或产毒很低。对此,     

疑似牛病毒性腹泻──粘膜病病毒细胞培养及其抗体对猪瘟牛睾丸细胞苗生产影响的观察

1993年猪瘟牛睾丸细胞苗生产过程中出现细胞病变、毒价不高．猪瘟、牛病毒性腹泻─粘膜病病毒、猪细小病毒（HCV、BVD／MDV、PPV）三价荧光抗体及其他中间监测结果观察．初步认为，长沙市部分乳牛场已铁牛病毒性腹泻─粘膜病病毒感染．     

胎牛血清中牛病毒性腹泻病毒2型毒株分离及脱脂奶粉中抗体的检测

本研究旨在对进口胎牛血清中的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）进行分离及鉴定。利用BVDV抗原和抗体检测试剂盒检测,提取胎牛血清中的病毒RNA,用5'-UTR巢式PCR进行扩增,PCR扩增产物连接pMD19-T进行测序分析。胎牛血清样品接种MDBK细胞,进行细胞传代培养,通过细胞分离培养、直接免疫荧光抗体检测对实验室进口胎牛血清样品进行病毒分离及鉴定,应用DNAStar对BVDV 5'-UTR、N^pro与GenBank中公布的瘟病毒参考株进行多序列比对,采用Mega 6.0进行遗传进化分析。同时通过包被脱脂奶粉进行间接ELISA检测其中的BVDV抗体。结果显示,胎牛血清中BVDV抗原和抗体均为阳性,并且从胎牛血清中成功分离到一株新的牛源BVDV,命名为BVDV-GC株,该病毒株在MDBK细胞上进行增殖培养时未能引起细胞病变;5'-UTR与N^pro PCR扩增为阳性,扩增产物大小均与预期相符;直接免疫荧光检测荧光信号为阳性;病毒滴度为10^-3.6TCID₅₀/0.1 mL;遗传进化分析表明,该分离株与USMARC-60779（BVDV-2）株有较近的亲缘关系,同属于BVDV-2型毒株;通过包被脱脂奶粉和商品化的ELISA试剂盒进行检测,结果表明脱脂奶粉中存在BVDV抗体。本研究从进口胎牛血清中分离出1株BVDV-2型非致细胞病变病毒,从脱脂奶粉中检测到BVDV抗体,表明进口胎牛血清和脱脂奶粉中都存在BVDV抗原和抗体污染,本研究为后续试验分析提供参考。     

牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的分离鉴定 Ⅰ.病毒分离培养、理化特性测定、中和试验

用牛睾丸细胞,从呼和浩特市某奶牛场病牛脾脏中分离出1株病毒,并对其细胞培养特性、形态特征、核酸类型和对某些理化因素的敏感性进行了观察和检测,均与BVD—MDV一致,进一步用标准BVD—MDV Oregon C_(24)V阳性血清对分离病毒进行中和试验,结果为阳性。表明该病毒为BVD—MDV。     

河南省牛病毒性腹泻病毒地方株的分离及鉴定

从河南省不同地区规模化肉牛场牛病毒性腹泻(BVD)疑似病例中采集病料,将处理好的6份病料接种MDBK细胞,并盲传4代,得到了两株可产生细胞病变的病毒,经测定该两株病毒的TCID50分别为10-6.59/0.1ml和10-6.51/0.1ml;琼脂扩散试验表明该两株病毒均能与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)OregonC24标准阳性血清反应,出现沉淀线,且均能被BVDV标准阳性血清中和;电镜观察到圆形、有囊膜、直径为40～60nm、囊膜表面有突起的病毒粒子,与BVDV颗粒基本一致。动物回归试验表明,用两株分离毒攻毒的2头3月龄犊牛均出现了和BVD自然病例相似的临床症状,并检测其抗原和抗体,结果均为阳性,从而确定分离的两株病毒均为BVDV,分别将其命名为HN-1和HN-2株。