禾谷镰刀菌蔗糖转运蛋白FgSut1和FgSut2的鉴定及功能研究

小麦赤霉病是以禾谷镰刀菌为优势种的镰刀菌复合种群引起的一种影响小麦产量和粮食安全的重大真菌病害。蔗糖转运蛋白在禾谷镰刀菌中的功能尚不明确。本研究通过与裂殖酵母蔗糖转运蛋白Sut1的氨基酸序列同源比对鉴定到禾谷镰刀菌蔗糖转运蛋白FgSut1和FgSut2,通过基因敲除获得禾谷镰刀菌的Fgsut1、Fgsut2突变体和Fgsut1Fgsut2双敲突变体。研究表明：Fgsut1、Fgsut2突变体和Fgsut1Fgsut2双敲突变体的营养生长、产孢、有性生殖和产毒过程均没有出现缺陷。在葡萄糖为单一碳源的培养基上Fgsut1突变体的生长速率减缓，Fgsut1Fgsut2双敲突变体生长速率下降更显著。Fgsut1Fgsut2双敲突变体在果糖和麦芽糖为碳源的平板上生长速率减缓，说明FgSut1和FgSut2对碳源的利用存在功能的分化和冗余。在小麦穗和小麦胚芽鞘接种实验中，Fgsut2突变体和Fgsut1Fgsut2双敲突变体的致病力降低，说明FgSut2可能在禾谷镰刀菌侵染过程中发挥主要作用，FgSut1和FgSut2在侵染过程存在功能冗余。本研究将禾谷镰刀菌在生长发育过程中对碳源吸收、毒素合成及...     

禾谷镰刀菌脂质转运蛋白Vps13的功能分析

 Vps13蛋白家族是真核生物中高度保守的一类脂质转运蛋白,其在丝状真菌中的功能尚不清楚。小麦赤霉病主要由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起,是小麦最重要病害之一。禾谷镰刀菌含有酿酒酵母VPS13的一个同源基因FgVPS13。通过同源重组的方法获得禾谷镰刀菌FgVPS13敲除突变体。研究表明,FgVPS13敲除突变体出现生长、产孢和有性生殖的缺陷。FgVPS13敲除突变体在小麦胚芽鞘和麦穗上的致病力下降,产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)毒素含量也明显降低。而且,FgVPS13抑制线粒体自噬。总之,FgVPS13参与调控禾谷镰刀菌菌丝生长、无性和有性生殖、致病力和线粒体自噬。     

禾谷镰刀菌中硝基单加氧酶的功能分析

 硝基单加氧酶(nitronate monooxygenase, NMO)将硝基烷烃氧化成相应的羰基化合物和亚硝酸盐。尽管硝基单加氧酶的生化特性在少数真菌中得到了深入解析,但是在植物病原真菌中关于其生物学功能的报道很少。本研究通过同源比对,在禾谷镰刀菌(Fusarium graminearium)中鉴定到了5个硝基单加氧酶,利用基因敲除获得了相应的单敲突变体。通过表型分析发现,基因缺失突变体ΔFgNMO1-5的生长速率、菌落形态以及致病力与野生型相比均未发生明显变化,说明硝基单加氧酶之间存在部分功能冗余。突变体ΔFgNMO1、ΔFgNMO4和ΔFgNMO5的分生孢子产量降低了约50%。通过融合绿色荧光蛋白进行功能回补发现,禾谷镰刀菌中这5个硝基单加氧酶在细胞内发挥催化功能的场所存在差异。     

禾谷镰刀菌中硝基单加氧酶的功能分析

 硝基单加氧酶(nitronate monooxygenase, NMO)将硝基烷烃氧化成相应的羰基化合物和亚硝酸盐。尽管硝基单加氧酶的生化特性在少数真菌中得到了深入解析,但是在植物病原真菌中关于其生物学功能的报道很少。本研究通过同源比对,在禾谷镰刀菌(Fusarium graminearium)中鉴定到了5个硝基单加氧酶,利用基因敲除获得了相应的单敲突变体。通过表型分析发现,基因缺失突变体ΔFgNMO1-5的生长速率、菌落形态以及致病力与野生型相比均未发生明显变化,说明硝基单加氧酶之间存在部分功能冗余。突变体ΔFgNMO1、ΔFgNMO4和ΔFgNMO5的分生孢子产量降低了约50%。通过融合绿色荧光蛋白进行功能回补发现,禾谷镰刀菌中这5个硝基单加氧酶在细胞内发挥催化功能的场所存在差异。     

禾谷镰刀菌缺氧诱导脱氢酶参与发育和致病性

 缺氧诱导脱氢酶(hypoxia-induced dehydrogenase, HorA)参与辅酶Q(coenzyme Q, CoQ)的生物合成。在禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)基因组中确定了一个缺氧诱导脱氢酶基因,命名为FgHorA。通过同源重组的方法获得FgHorA敲除突变体。研究发现,FgHorA敲除突变体出现生长和产孢的缺陷,并且延迟了分生孢子萌发,FgHorA突变体不能产生子囊壳。FgHorA突变体在小麦胚芽鞘上的致病力和产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)毒素含量明显下降。FgHorA突变体表现出对盐胁迫的抗性提高,而对氧胁迫抗性降低。此外,FgHorA突变体产生的内源性活性氧明显减少。研究结果表明,禾谷镰刀菌FgHorA参与菌丝生长、无性和有性生殖、胁迫反应和致病性。     

禾谷镰刀菌对苯基吡咯类杀菌剂咯菌腈的抗性机制

由禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病是世界小麦生产上的重要真菌病害。为了进一步明确禾谷镰刀菌对苯基吡咯类杀菌剂咯菌腈产生抗性的机制,本文以前期室内通过药剂驯化方式得到的4株禾谷镰刀菌对咯菌腈的高水平抗性突变体 (其抗性倍数在318.2~782.9之间) 为主要研究材料,采用生物测定及分子生物学等方法开展了禾谷镰刀菌对咯菌腈的抗性机制研究。结果表明:供试禾谷镰刀菌抗咯菌腈突变体对小麦幼穗的致病力降低了约50%,部分菌株 (2XZ-4R) 甚至完全丧失了对小麦的致病能力;抗性突变体对渗透胁迫 (0.5 mol/L NaCl, 1.0 mol/L MgCl₂, 1.0 mol/L葡萄糖或1.0 mol/L甘露醇) 高度敏感,且菌丝生长抑制率较敏感菌株降低约50%以上,表明其环境适合度显著下降。同时,抗性突变体中苯丙氨酸解氨酶 (PAL)、过氧化物酶 (POD) 和多酚氧化酶 (PPO) 活性较敏感菌株均升高2倍以上。分子生物学分析发现,供试抗性突变体中候选靶标基因 (FgOs1和FgOs5) 的表达量显著下调 (P<0.05),推测FgOs1和FgOs5可能参与了禾谷镰刀菌对咯菌腈抗性的形成过程。总之,该研究探究了禾谷镰刀菌抗咯菌腈突变体的生物学特性,并为深入揭示禾谷镰刀菌对咯菌腈的抗性分子机制提供了新的思路。     

FpStuA参与假禾谷镰孢的产孢和致病性

 假禾谷镰孢是一种土传真菌,其引起的小麦茎基腐病已成为威胁我国小麦生产的重要病害。APSES蛋白是真菌中保守存在的一类转录因子,参与多种细胞生理过程。本研究,我们在假禾谷镰孢中鉴定到StuA同源蛋白FpStuA。qRT-PCR分析发现FpStuA在假禾谷镰孢分生孢子和侵染阶段诱导表达。通过PEG介导的原生质体转化方法获得3个FpStuA基因缺失的突变体。与假禾谷镰孢野生型菌株相比,Δfpstua突变体的生长速度明显减慢,气生菌丝减少;分生孢子的产生比野生型减少70%,且Δfpstua突变体分生孢子变短、分隔减少;Δfpstua突变体对大麦叶片、小麦胚芽鞘和小麦根的致病性均显著降低,脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)合成明显减少。综上结果,转录因子FpStuA对假禾谷镰孢的生长、产孢和致病性都非常重要。     

禾谷镰刀菌蛋白激酶FgSid1的功能研究

 实验室前期已经对禾谷镰刀菌中116个蛋白激酶进行了鉴定,发现FgSID1基因(FGSG_07344)敲除突变体在有性生殖过程中存在严重缺陷,但其在禾谷镰刀菌中的具体功能却未被详细报道。本研究通过表型分析和亚细胞定位等实验明确了FgSid1在营养生长、有性发育和致病性等方面的功能。本研究发现FgSID1基因敲除突变体菌落生长速度显著变慢,分生孢子隔膜数量减少且产孢量下降;在有性生殖阶段,FgSID1基因敲除突变体的子囊壳形态和大小均正常,但子囊畸形且子囊孢子形成有缺陷;此外,FgSID1基因敲除突变体只能侵染接种小花,而无法扩展到穗轴及临近的小穗,且接种点的小麦籽粒DON毒素含量显著下降;研究还发现FgSID1基因敲除突变体的分生孢子、营养菌丝和子囊孢子的分隔中均含有多个细胞核;本研究又通过亚细胞定位实验发现FgSid1定位于微管组织中心。因此,蛋白激酶FgSid1可能通过参与禾谷镰刀菌无性和有性阶段的细胞分裂影响禾谷镰刀菌的营养生长、分生孢子和子囊孢子的发育以及侵染能力。     

禾谷镰刀菌中磷脂酰肌醇转运蛋白功能分析

磷脂酰肌醇转运蛋白(phosphatidylinositol transfer protein,PITP)保守存在于真核生物中,负责膜系统中磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱的转运,参与胞内的脂类信号调控过程。由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起的小麦赤霉病严重威胁粮食产量和食品安全,而在禾谷镰刀菌的研究中发现磷脂信号网络中的关键元件参与病原菌致病过程的调控。我们利用基因敲除的方法对禾谷镰刀菌中PITP家族的功能进行分析,在禾谷镰刀菌中鉴定了7个PITP蛋白的编码基因,并成功获得了其单敲除突变体。通过表型分析发现,这7个基因的单敲除突变体在营养生长、无性及有性生殖和致病性方面与野生型菌株并无明显差异。研究结果表明:1)禾谷镰刀菌中的PITP基因并不是看家基因;2)不同PITP基因之间可能存在功能冗余;3)丝状真菌中PITP的生理功能与酵母中的PITP存在显著差异。     

禾谷镰刀菌组蛋白乙酰转移酶FgHat1在DON毒素生物合成中的功能

 由禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病是小麦最主要的真菌病害之一。禾谷镰刀菌侵染小麦时分泌脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)真菌毒素,威胁人畜健康。本研究通过对组蛋白乙酰转移酶基因FgHAT1的功能研究,发现该基因编码的蛋白定位于细胞核并调控组蛋白H4的乙酰化。Fghat1敲除突变体在生长发育和致病过程中表现正常,但毒素合成存在显著缺陷。敲除FgHATI导致参与DON毒素合成的TRI基因转录水平降低,突变体产毒相关的细胞分化也表现异常。外源添加cAMP可以有效回复突变体的产毒缺陷,表明FgHat1对毒素的调控与cAMP信号通路有关。研究结果表明组蛋白表观修饰和胞内信号通路之间存在联系,这两者的交叉互作对DON毒素合成的精确调控至关重要。     

陕西省小麦茎基腐病病原菌鉴定及其致病力分析

为明确陕西省小麦茎基腐病病原菌的组成及其致病力,于2019年小麦灌浆期在陕西省宝鸡市、咸阳市、西安市和渭南市共63个采样点采集具有茎基腐病典型症状的病株,对其进行组织分离,结合培养性状和形态学特征,以及利用ITS和EF-1α序列分析鉴定分离菌株所属类群,并对不同病原菌进行致病力分析。结果表明：共分离到224株菌株,基于形态学特征和分子生物学鉴定结果,其中201株菌株鉴定为假禾谷镰刀菌Fusarium pseudograminearum,3株菌株鉴定为禾谷镰刀菌F. graminearum,14株菌株鉴定为三线镰刀菌F. tricinctum,6株菌株鉴定为层出镰刀菌F. proliferatum,其中假禾谷镰刀菌占总分离菌株的89.73%,是陕西省小麦茎基腐病的优势病原菌。不同种的镰刀菌对小麦植株均有一定的致病性,但假禾谷镰刀菌的致病力最强,而且分离自不同地区或者同一地区的假禾谷镰刀菌株间的致病力也存在一定分化。     

禾谷镰刀菌Fgβ2 S138A对多菌灵和噻菌灵敏感性的影响

由禾谷镰刀菌Fusarium graminearum引起的小麦赤霉病（Fusarium head blight,FHB）是小麦、大麦、燕麦、黑麦等禾谷类作物的毁灭性病害。目前,生产上防治小麦赤霉病主要依靠化学药剂防治,多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂使用较为广泛,其作用靶标为β微管蛋白。禾谷镰刀菌有2个β微管蛋白,通过分子对接结果发现β2微管蛋白第138位氨基酸位点可能为多菌灵结合位点。本研究对β2第138位丝氨酸位点进行突变研究,以明晰其生物学功能。结果表明Fgβ2S138A突变后禾谷镰刀菌对多菌灵的敏感性显著增加,EC50值由0.617 mg/L降至0.290 mg/L,但不影响对噻菌灵的敏感性,EC50值为0.950 mg/L左右,并且该突变不影响禾谷镰刀菌菌丝营养生长、无性繁殖、有性生殖和致病性。本研究结果可为多菌灵对小麦赤霉病的化学防治提供理论基础,在生产上具有一定指导意义。     

温度对假禾谷镰刀菌生长、侵染及茎基腐病发生的影响

 研究温度对小麦茎基腐病发生的影响,可为病害的发生规律和生态防控措施的研究提供依据。本研究测定了温度对假禾谷镰刀菌菌丝生长、孢子萌发、对寄主小麦侵染以及在植株体内扩展的影响,结果表明,假禾谷镰刀菌菌丝生长的温度范围为4℃~30℃,其中28℃最适于菌丝的生长,孢子萌发的温度范围为4℃~35℃,其中12℃~30℃较适宜分生孢子萌发,17℃~28℃为假禾谷镰刀菌侵染小麦的适宜温度范围,假禾谷镰刀菌在小麦植株体内扩展的适宜温度范围在22℃~30℃;通过不同温度培养试验以及田间小麦不同生育期接种试验测定温度对小麦茎基腐病发生的影响,结果表明,播种期、起身期接种的小麦茎基腐病发生高于越冬苗期接种处理,而此期的温度较越冬苗期利于假禾谷镰刀菌的侵染和小麦茎基腐病的发生。     

玉米青枯病病原腐霉对其伴生镰刀菌的影响

 本试验以玉米青枯病病原肿囊腐霉(Pythium inflatum Malthews)与禾生腐霉(Pythium gramlnicola Subram)为材料,着重研究了两种腐霉的生长与代谢对其伴生病原禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum Schw.)的影响,结果表明:1.腐霉的定殖生长能力弱于禾谷镰刀菌。在腐霉菌落上,禾谷镰刀菌仍可生长,而在禾谷镰刀菌菌落上,腐霉则不能生长。2.在伴生条件下,腐霉被镰刀菌覆盖的时间长短随接种间隔而有变化,接种间隔愈短,则覆盖愈快。3.两种腐霉的培养滤液均对禾谷镰刀菌的孢子萌发与芽管伸长及菌落扩展有明显的促进作用,表明滤液中含有对镰刀菌生长有利的活性成分。4.腐霉培养滤液对禾谷镰刀菌红色色素的产生有一定的抑制作用,其原因可能与腐霉的嗜糖性有关。5.田间结果表明,腐镰复合接种的发病率接近禾谷镰刀菌单菌接种,但低于腐霉单菌接种。     

温度对假禾谷镰刀菌生长、侵染及茎基腐病发生的影响

 研究温度对小麦茎基腐病发生的影响,可为病害的发生规律和生态防控措施的研究提供依据。本研究测定了温度对假禾谷镰刀菌菌丝生长、孢子萌发、对寄主小麦侵染以及在植株体内扩展的影响,结果表明,假禾谷镰刀菌菌丝生长的温度范围为4℃~30℃,其中28℃最适于菌丝的生长,孢子萌发的温度范围为4℃~35℃,其中12℃~30℃较适宜分生孢子萌发,17℃~28℃为假禾谷镰刀菌侵染小麦的适宜温度范围,假禾谷镰刀菌在小麦植株体内扩展的适宜温度范围在22℃~30℃;通过不同温度培养试验以及田间小麦不同生育期接种试验测定温度对小麦茎基腐病发生的影响,结果表明,播种期、起身期接种的小麦茎基腐病发生高于越冬苗期接种处理,而此期的温度较越冬苗期利于假禾谷镰刀菌的侵染和小麦茎基腐病的发生。     

禾谷镰刀菌CYP51A基因对五种三唑类杀菌剂敏感性的影响

为进一步明确14α-脱甲基酶编码基因CYP51A在禾谷镰刀菌Fusarium graminearum对三唑类杀菌剂敏感性中的作用,利用Split-marker方法敲除禾谷镰刀菌CYP51A基因并获得敲除CYP51A基因的禾谷镰刀菌ΔFgCYP51A菌株,比较该菌株和野生型菌株PH-1对5种三唑类杀菌剂的敏感性变化。结果表明,ΔFgCYP51A菌株对丙环唑、戊唑醇、烯唑醇、三唑醇和三唑酮的EC₅₀分别为0.024、0.047、0.148、0.154和0.474 mg/L。ΔFgCYP51A菌株对戊唑醇、三唑醇、三唑酮和丙环唑的敏感性均显著增加,而对烯唑醇的敏感性无明显变化。表明FgCYP51A基因与禾谷镰刀菌对三唑类杀菌剂的敏感性有关。     

玉米穗粒腐病的病原菌鉴定及致病性测试

在陕西省25个县调查玉米穗粒腐病,采集病穗标样570份。霉坏籽粒达到果穗面积1/3以上的发病严重果穗占35.61％。分离得到1308个菌株,鉴定为17个种,分属14个属,其中串珠镰刀菌出现频率最高,占42.58％,其次为禾谷镰刀菌,占20.34％。对串珠镰刀菌、禾谷镰刀菌等10种主要病原菌进行致病性测试,平均病级1.14～2.41,病情指数22.9～48.4。串珠镰刀菌是玉米穗粒腐病的优势病原菌,禾谷镰刀菌为次优势菌种。     

福建小麦赤霉病的致病菌种及致病型的研究

 1978~1981年采集54个县市小麦病穗标样,单孢分离获1081菌株。经室内外综合鉴定明确本省引起小麦赤霉病的致病病原有禾谷镰刀菌(Fusarium gra-minearum Schwabe),雪腐镰刀菌[F.nival (Fr.) Ces.],本色镰刀菌(F.concolor Rg.),弯角镰刀菌(F.camptoceras Wr.&Rg.),串珠镰刀菌(F.moniliforme Sheld),硫色镰刀菌(F.sulphureum schecht Sacc.)和燕麦镰刀菌草类变种(F.avenaceum var.herberum)。其中禾谷镰刀菌分离频率最高,占绝对优势,分布遍及全省。7个种致病力测定,F=10.48,F> 0.01,不同种致病力差异极显著;禾谷镰刀菌、弯角镰刀菌和硫色镰刀菌致病力最强。     

亚甲基四氢叶酸还原酶参与调控稻瘟病菌的生长、发育和致病性

 稻瘟病菌(Magnaporth oryzae)引起的稻瘟病是水稻上一种毁灭性病害,每年给全球水稻生产造成10%～30%的产量损失,严重威胁着全球的粮食生产安全。从分子水平探究该病菌的致病机制,对于挖掘潜在的控制稻瘟病的药剂靶标具有重要的理论和实践意义。本研究在稻瘟病菌中鉴定到2个分别与酿酒酵母亚甲基四氢叶酸还原酶Met12和Met13同源的蛋白,命名为MoMet12和MoMet13。MoMet12和MoMet13分别含有690和631个氨基酸,两者的一致性为32%。对这2个蛋白编码基因分别进行敲除突变,发现ΔMomet12和ΔMomet13突变体在CM营养丰富培养基上生长减慢、气生菌丝减少。ΔMomet13在MM基本培养基上不能生长,在SDC和OM营养饥饿培养基上生长显著减慢,气生菌丝稀薄。ΔMomet12在MM、SDC和OM培养基上生长均显著减慢;对突变体进行产孢和致病性测定发现,ΔMomet13突变体在CM和SDC培养基上均丧失了产孢能力,而ΔMomet12在CM培养基上产孢量显著下降,在SDC上产孢能力丧失;ΔMomet13突变体侵染菌丝扩展和致病力显著下降,ΔMomet12突变体致病力与野生型比较无明显变化。加入外源的甲硫氨酸可恢复ΔMomet12和ΔMomet13突变体在不同培养基上的生长和产孢缺陷,且能部分恢复ΔMomet13突变体的致病能力。上述结果表明,MoMet12和MoMet13通过参与甲硫氨酸的生物合成,从而控制稻瘟病菌的生长和无性繁殖。MoMet13同时是一个重要的致病相关因子,参与病菌侵染菌丝的生长和致病过程。     

黄淮麦区假禾谷镰刀菌对3种杀菌剂敏感性测定

以假禾谷镰刀菌Fusarium pseudograminearum为主要病原菌引起的小麦茎基腐病已经成为黄淮麦区的主要小麦病害之一,对小麦生产安全带来严重威胁。为了解假禾谷镰刀菌对氰烯菌酯、戊唑醇和咯菌腈3种杀菌剂的敏感性,采用菌丝生长速率法对采自河南、河北、山东的108株假禾谷镰刀菌进行了室内毒力测定。试验结果表明：氰烯菌酯对假禾谷镰刀菌的EC₅₀为0.088～0.929μg/mL,EC₅₀均值为(0.471±0.181)μg/mL;敏感性分布为连续单峰曲线,经Shapiro-Wilk正态性检验符合正态分布(W=0.988,P=0.437>0.05),所以将所有菌株的EC₅₀平均值0.471μg/mL定为假禾谷镰刀菌对氰烯菌酯的敏感基线;戊唑醇对供试菌株的EC₅₀为0.015～0.961μg/mL,EC₅₀均值为(0.384±0.219)μg/mL,敏感性分布不符合连续单峰的正态分布;咯菌腈对供试菌株的EC₅₀为0.029～0.354μg/mL,E...