不同营养水平日粮对陕北白绒山羊生长性能和小肠组织SLC7A7、SLC3A1及SLC15A1 mRNA表达的影响

本试验旨在研究日粮营养水平对断奶后2~6月龄陕北白绒山羊生长性能及小肠组织中与氨基酸转运吸收相关的SLC7A7、SLC3A1和SLC15A1 mRNA表达的影响。选取健康、日龄（（60±1.60）d）和体重（（10.73±1.03）kg）相近的雌性陕北白绒山羊羔羊36只，随机分为4组，分别饲喂4种试验日粮，其消化能和粗蛋白质水平分别为标准日粮的85%、100%、115%和130%。标准日粮营养水平参考肉羊饲养标准NY/T816-2004，依据生长阶段（10~19 kg、15~27 kg）和目标增重设置。试验期间，分别于120和180日龄称重，于180日龄，每个重复屠宰1只试验羊，采集十二指肠中上部、空肠中段、回肠末端组织样品，通过实时荧光定量PCR检测SLC7A7、SLC3A1和SLC15A1表达水平。结果表明：1）第一阶段（60~120 d）115%水平组平均日增重显著高于其他三组（P<0.05），第二阶段（121~180 d）115%水平组平均日增重显著高于85%和100%水平组（P<0.05），与130%水平组无明显差异。两阶段115%水平组羔羊干物质采食量极显著高于其他3组（P<0.01）。两阶段料重比115%水平组显著低于85%、100%水平组（P<0.05）。2）相同营养水平下，SLC7A7和SLC15A1 mRNA的表达丰度顺序均为回肠>空肠>十二指肠；3）随日粮营养水平的增加，SLC7A7、SLC3A1和SLC15A1 mRNA在小肠各段的相对表达量呈先上升后下降的趋势，且115%水平组表达量最高。115%水平组SLC7A7和SLC15A1 mRNA相对表达量显著高于其他3组（P<0.05）；115%水平组SLC3A1 mRNA的相对表达量显著高于85%和130%水平组组（P<0.05）。本试验条件下，与其他营养水平组相比，115%水平组陕北白绒山羊羔羊在2~6月龄生长性能最佳，SLC7A7、SLC3A1和SLC15A1 mRNA在小肠各段的表达量最高。     

山羊碱性氨基酸转运载体基因SLC3A1cDNA序列克隆及表达

试验旨在克隆山羊碱性氨基酸转运载体基因SLC3A1 cDNA序列,探究其表达的组织特异性及其在小肠中的表达发育模式。参考GenBank已发表的绵羊、牛SLC3A1基因mRNA序列设计引物,克隆山羊SLC3A1基因的cDNA序列,采用实时荧光定量PCR的方法分析其在1日龄山羊11种组织及其在1日龄、6月龄、8月龄、10月龄、12月龄山羊十二指肠、空肠、回肠中的mRNA表达情况。结果表明,成功克隆得到了山羊SLC3A1基因cDNA序列,其与绵羊、牛、野猪、人、小鼠、大鼠的同源性分别为99%、97%、88%、86%、80%和79%。SLC3A1基因转录表达有明显的组织特异性,其在1日龄山羊肾脏、回肠、空肠、结肠中表达量依次降低(P<0.05),其他组织中表达量很低。同一月龄山羊,SLC3A1基因在不同肠段的表达量数值上回肠>空肠>十二指肠。SLC3A1基因在不同月龄山羊十二指肠表达量以1日龄山羊为最高(P<0.05),6~12月龄山羊相同肠段之间表达量无显著差异(P>0.05);空肠表达量随山羊年龄的增加均呈现逐步降低的趋势;回肠表达量在各个月龄山羊之间差异不显著(P>0.05)。结果说明,山羊碱性氨基酸转运载体基因SLC3A1的主要表达部位在肾脏和肠道,推测b^0,+碱性氨基酸转运系统转运氨基酸的主要部位为肾脏和肠道。SLC3A1基因在山羊小肠受肠段和发育阶段的影响,具有不同的表达发育模式。     

三穗鸭SLC4A9基因表达量及其多态性对蛋壳品质的遗传效应分析

为探究溶质载体家族4成员9（solute carrier family 4 member 9,SLC4A9）基因的表达量及其多态性对鸭蛋壳品质的遗传效应,试验采用实时荧光定量PCR法检测SLC4A9基因在三穗鸭不同组织中的表达水平,采用PCR产物直接测序法筛查三穗鸭SLC4A9基因的SNP位点,并分析SNP位点对三穗鸭蛋壳品质的遗传效应。结果显示,SLC4A9基因mRNA在三穗鸭10个组织中均有不同程度表达,其中在心脏和胰腺中为高度特异性表达,肾脏中为中度表达,其他为低度表达。试验共检测到10个SNPs位点,其中3个位于外显子上（g.6803 C>T、g.7065 C>T和g.7089 C>G）,且均为错义突变,7个位于内含子上（g.7162 C>G、g.11044 G>A、g.11090 T>C、g.11234 C>T、g.11261 C>T、g.11349 C>T和g.11403 G>A）,其中g.6803 C>T位点突变导致丙氨酸（GCG）变为缬氨酸（GTG）;g.7065 C>T位点突变导致丙氨酸（GCC）变为缬氨酸（GTC）;g.7089 C>G位点突变导致丙氨酸（GCA）变为甘氨酸（GGA）。χ²检验结果显示,g.6803 C>T、g.11090 T>C和g.11349 C>T突变位点的基因型分布均偏离了Hardy-Weinberg平衡状态（P<0.05）,其余位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）。关联分析结果表明,g.11349 C>T位点的CC和CT基因型蛋壳强度显著高于TT基因型（P<0.05）。综上,SLC4A9基因的10个SNPs位点均对三穗鸭的蛋壳品质产生影响,其中g.11349 C>T位点达到了显著水平,可为蛋鸭蛋壳品质的改善及遗传标记提供参考依据。     

长顺绿壳蛋鸡SLC8A1基因多态性及其对蛋壳品质的影响

【目的】探究溶质载体家族8成员A1（solute carrier family 8 member A1，SLC8A1）基因多态性对长顺绿壳蛋鸡蛋壳品质的影响，为今后改善蛋壳品质提供参考。【方法】根据GenBank数据库中鸡SLC8A1基因序列（登录号：NC_052534.1），使用Primer Premier 3.0软件设计引物进行PCR扩增，采用直接测序法筛选SLC8A1基因SNP位点，并利用SPSS 22.0软件检测SNP位点不同基因型蛋壳指标的差异。【结果】在SLC8A1基因外显子11上共发现3个新的SNPs：g.16085681 T>C、g.16085766 C>T和g.16085781 T>C，共存在3种单倍型：H1（TCT）、H2（CTC）、H3（TTC），以及6种双倍型：H1H1（TTCCTT）、H1H2（TCTCTC）、H1H3（TTTCTC）、H2H2（CCTTCC）、H2H3（CTTTCC）、H3H3（TTTTCC）。χ²检验结果显示，3个SNPs位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05），均表现为中度多态。关联性分析结果显示，g.16085681 T>C位点TC基因型个体蛋壳强度显著高于TT基因型（P<0.05），g.16085681 T>C位点和单倍型H2（C_16085681T_16085766C_16085781）对SLC8A1基因mRNA二级结构产生明显的影响；g.16085766 C>T位点CC基因型个体蛋形指数显著高于TT基因型（P<0.05）；双倍型H1H1、H1H3个体蛋形指数显著高于H2H3，H2H3个体蛋壳强度和蛋壳厚度均显著高于H1H3，H1H2、H2H2个体蛋重均显著高于H3H3（P<0.05）。【结论】g.16085681 T>C位点可作为影响蛋壳强度的标记位点，g.16085766 C>T位点可作为影响蛋形指数的标记位点，双倍型H2H3可能是蛋壳强度和蛋壳厚度的有利双倍型。     

采用dCas9-SunTag-DNMT3A技术调控玻璃化冷冻牛卵母细胞IVF囊胚中IGF2R基因甲基化水平

旨在探究dCas9-SunTag-DNMT3A编辑系统对玻璃化冷冻牛卵母细胞IVF囊胚中IGF2R基因甲基化水平及胚胎发育能力的影响,为冷冻卵母细胞/胚胎特定位点DNA甲基化的精确调控奠定基础。本研究将经过体外成熟的牛卵母细胞进行玻璃化冷冻,随后进行体外受精,将受精所得到的原核胚进行dCas9-SunTag-DNMT3A编辑系统的注射,统计并计算卵母细胞的发育情况;通过亚硫酸盐测序的方式检测IGF2R基因启动子的甲基化水平,并利用荧光定量PCR检测IGF2R及相关基因的表达水平。与冷冻组相比,注射不同浓度的dCas9-SunTag-DNMT3A编辑系统后,只有40 ng·μL^-1组显著地提高了玻璃化冷冻卵母细胞IVF后的发育能力(P＜0.05),20和60 ng·μL^-1组间差异不显著(P＞0.05),但40 ng·μL^-1组发育效果仍然显著低于新鲜对照组(P＜0.05);对检测冷冻组、新鲜组、40 ng·μL^-1组IGF2R基因启动子甲基化水平分析发现,40 ng·μL^-1组水平与新鲜组相似,显著高于冷冻组(P＜0.05);荧光定量试验结果显示,40 ng·μL^-1组IGF2R基因mRNA表达水平相较于冷冻组显著降低(P＜0.05),与新鲜组相似。注射40 ng·μL^-1的dCas9-SunTag-DNMT3A甲基化编辑系统能够通过有效升高IGF2R基因启动子甲基化水平(P＜0.05)及显著降低其mRNA表达水平(P＜0.05),来正向调节玻璃化冷冻卵母细胞IVF胚胎的发育情况,提高胚胎发育能力,使得其卵裂率和囊胚率都得到显著提高(P＜0.05),同时促进胚胎发育相关基因的表达。     

新西兰白兔CYP11A1基因的克隆、生物信息学分析及其对繁殖相关基因的影响

【目的】旨在通过分析细胞色素P450家族成员11A1（CYP11A1）的生物信息功能及其在新西兰白兔卵巢颗粒细胞中对繁殖性能相关基因的调控作用，为探究其在卵泡发育过程中调控功能奠定基础。【方法】根据GenBank上兔CYP11A1基因的序列，设计特异性引物，以新西兰白兔卵巢组织cDNA为模板，PCR扩增并克隆CYP11A1基因序列，构建pcDNA3.1-CYP11A1过表达重组载体；用Mega 5.1在线软件构建系统进化树，并通过生物信息学软件对CYP11A1蛋白的氨基酸组成、理化性质、磷酸化位点、保守结构域、二级结构、三级结构、亚细胞定位、蛋白互作进行预测分析。分离新西兰白兔卵巢颗粒细胞，并通过免疫荧光法鉴定颗粒细胞特异性抗体卵泡刺激素受体（FSHR）的表达。设计3条干扰CYP11A1基因表达的引物（siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3），筛选出干扰效率最高的1条，并将其与pcDNA3.1-CYP11A1过表达重组载体转染到卵巢颗粒细胞中，用实时荧光定量PCR检测颗粒细胞中羟基类固醇17-β脱氢酶1（HSD17B1）、骨形态发生蛋白15（BMP15）和促卵泡刺激素受体（FSHR）等繁殖相关基因mRNA表达水平。【结果】成功克隆新西兰白兔CYP11A1基因，其CDS全长序列为1 557 bp，编码518个氨基酸，其中亮氨酸含量（10.6%）最高，精氨酸（7.6%）、缬氨酸（7.4%）和丙氨酸（7.2%）次之。进化树分析显示，CYP11A1蛋白序列与家鼠、人和猩猩的距离最近。生物信息学分析显示，CYP11A1蛋白理论等电点为7.4，正负电荷残基数各占50个，脂肪族氨基酸指数为82.16，不稳定性指数39.54，其中氨基酸序列中亲水性残基数量多于疏水性残基；CYP11A1蛋白具有40个潜在的磷酸化位点，其中以苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸最为丰富；CYP11A1蛋白二级结构由α-螺旋（48.31%）、无规则卷曲（40.22%）、延伸链（7.42%）和β-转角（4.04%）组成，三级结构为弯曲螺旋状。亚细胞定位预测结果显示，CYP11A1蛋白主要分布于线粒体（52.2%）、细胞质（17.4%）和细胞核（13.0%）中，还具有1个p450家族的结构域，并与多个繁殖性能相关的蛋白（STAR、CYP21A2、CYP17A1和FDX1）相互作用。分离的兔颗粒细胞表达FSHR，可以用于后续试验；CYP11A1基因在颗粒细胞中过表达后，HSD17B1和FSHR基因表达量极显著上调（P＜0.05），BMP15基因表达量显著上调（P＜0.01）；干扰CYP11A1基因表达后，BMP15和FSHR基因的表达量极显著下调（P＜0.01），HSD17B1基因表达量显著下调（P＜0.05）。【结论】CYP11A1是一个稳定、亲水、相对保守且具有抗氧化和类固醇激素合成功能的蛋白。CYP11A1基因可调控卵巢颗粒细胞中与繁殖性能相关的基因HSD17B1、BMP15、FSHR的表达，说明CYP11A1基因在母兔繁殖过程中发挥一定作用。     

促卵泡素对体外培养牛卵泡类固醇合成相关基因表达的影响

本研究旨在探究促卵泡素（follicle stimulating hormone,FSH）处理对体外培养的牛有腔卵泡颗粒细胞和膜细胞类固醇激素合成相关基因表达的影响。采集牛卵巢表面直径9~11 mm的有腔卵泡,用含不同浓度FSH的DMEM/F12体外培养牛有腔卵泡24 h。提取卵泡颗粒细胞、膜细胞RNA并反转录成cDNA,利用实时荧光定量PCR检测卵泡颗粒细胞、膜细胞中类固醇激素合成酶基因（CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1、CYP19A1、17β-HSD）和促性腺激素受体基因（FSHR、LHR）的表达水平。结果显示,FSH处理上调了颗粒细胞中CYP11A1、3β-HSD和CYP19A1基因表达,其中,25 ng/mL FSH处理极显著上调了CYP11A1基因表达（P<0.01）,10 ng/mL FSH处理显著上调了3β-HSD基因表达（P<0.05）,50 ng/mL FSH处理显著上调了CYP19A1基因表达（P<0.05）;50 ng/mL FSH处理显著或极显著上调了膜细胞中CYP11A1、3β-HSD和CYP17A1基因表达（P<0.05;P<0.01）,但在10和25 ng/mL FSH处理组中CYP11A1、3β-HSD和CYP17A1基因表达显著或极显著下调（P<0.05;P<0.01）。对FSHR、LHR基因研究结果显示,不同浓度FSH处理对颗粒细胞中FSHR、LHR基因的表达均无显著影响（P>0.05）,只有25和50 ng/mL FSH处理显著或极显著上调了膜细胞中LHR基因表达水平（P<0.05;P<0.01）,且不同处理组之间膜细胞中CYP11A1、3β-HSD和CYP17A1基因的表达变化与LHR基因表达变化趋势较一致。结果表明,FSH处理可提高牛有腔卵泡颗粒细胞中CYP11A1、3β-HSD和CYP17A1基因的表达,膜细胞中CYP11A1、3β-HSD和CYP17A1基因对LH的刺激更敏感,FSH可能通过影响LHR基因的表达来调节膜细胞中类固醇合成酶基因的表达。     

WIP1基因对3T3-L1前脂肪细胞增殖分化的影响及其在小鼠不同生长阶段的表达

【目的】探究野生型p53诱导磷酸酶1(WIP1)基因与脂肪细胞增殖和分化的关系,以期为猪优质性状育种提供新基因素材。【方法】利用脂质体转染方法将合成的WIP1基因的3对siRNAs (WIP1-790、WIP1-893和WIP1-1845)和阴性对照NC-siRNA分别转染3T3-L1前脂肪细胞,通过实时荧光定量PCR检测WIP1基因的表达水平,比较不同siRNA的干扰效率。然后利用筛选到的干扰效率最高的siRNA敲减WIP1基因在3T3-L1前脂肪细胞中的表达,通过CCK-8检测siRNA敲减细胞和NC-siRNA细胞不同生长时期(0、12、24、48、72、96和120 h)的增殖情况,并通过实时荧光定量PCR检测上述2种细胞24和48 h的细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)和Cyclin D1的表达水平。对干扰效率最高的siRNA和NC-siRNA组3T3-L1前脂肪细胞进行成脂诱导分化,通过油红O染色和甘油三酯定量法评估成脂分化效率,利用实时荧光定量PCR检测过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)、CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)、脂肪酸结合蛋白4(FABP4)、硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD1)的表达水平,Western blotting法检测PPARγ蛋白的表达水平;通过实时荧光定量PCR检测WIP1基因在21日龄、8周龄和6月龄小鼠腹股沟皮下脂肪组织和性腺脂肪组织的时空表达情况。【结果】基因干扰试验结果显示,3对siRNAs对WIP1基因的表达均具有极显著的干扰作用(P＜0.01),其中WIP1-790的干扰效率最高,达到了70%以上。CCK-8检测结果显示,与NC-siRNA组相比,WIP1-790干扰组细胞的增殖速率在各生长时期均极显著降低(P＜0.01),且细胞周期基因Cyclin B1和Cyclin D1的表达量在24和48 h均极显著下调(P＜0.01)。成脂诱导分化结果显示,与NC-siRNA组相比,WIP1-790干扰组细胞在成脂分化第8天油红O染色阳性细胞明显减少,脂滴含量极显著降低(P＜0.01),甘油三酯含量显著降低(P＜0.05);PPARγ、C/EBPα、FABP4、SCD1等标记基因mRNA表达水平均极显著降低(P＜0.01),PPARγ蛋白表达水平极显著降低(P＜0.01)。WIP1基因在8周龄和6月龄小鼠的腹股沟皮下脂肪组织中的表达量分别显著或极显著高于21日龄小鼠(P＜0.05;P＜0.01),且在6月龄小鼠的性腺脂肪组织中,WIP1基因的表达量极显著高于21日龄和8周龄的小鼠(P＜0.01)。【结论】WIP1基因通过调控Cyclin B1、Cyclin D1和PPARγ等细胞周期和成脂分化相关基因的表达影响3T3-L1细胞的增殖和分化,且参与小鼠脂肪沉积过程,结果可为深入解析WIP1基因调控脂肪发生的分子机制提供参考。     

不同乳脂率德宏奶水牛乳腺组织脂滴形成相关基因的表达研究

本研究旨在探索脂滴形成相关基因嗜乳脂蛋白(BTN1A1)、黄嘌呤脱氢酶(XDH)、围脂滴蛋白1(PLIN1)和PLIN2在不同乳脂率德宏奶水牛乳腺组织中的表达差异。试验选取同一养殖小区的健康德宏奶水牛216头,采集乳样,用乳品分析仪测定乳脂率。根据乳脂率测定结果,分为低乳脂率组(L组,<7.0%)、中乳脂率组(M组,7.5%±0.5%)和高乳脂率组(H组,>8.0%),每组选取第2胎、年龄相近、处于泌乳中期的德宏奶水牛各3头,采集乳样,进行乳脂率测定;屠宰后采集乳腺组织,提取总RNA,利用实时荧光定量PCR技术检测脂滴形成相关基因的mRNA表达水平,并与乳脂率及脂肪酸含量进行相关性分析。试验结果显示,BTN1A1、XDH、PLIN1和PLIN2基因具有相同的表达趋势:H组>M组>L组;其中H组德宏奶水牛乳腺组织BTN1A1、XDH、PLIN1和PLIN2基因mRNA表达水平均极显著高于M组和L组(P<0.01);M组BTN1A1基因表达水平与L组差异不显著(P>0.05),但XDH、PLIN1和PLIN2基因mRNA表达水平均极显著高于L组(P<0.01)。相关性分析表明,BTN1A1、XDH、PLIN1和PLIN2基因表达水平均与乳脂率、总脂肪酸、长链脂肪酸及不饱和脂肪酸含量呈极显著正相关(P<0.01)。本研究结果表明,BTN1A1、XDH、PLIN1和PLIN2基因在乳腺组织的表达可能对德宏奶水牛的乳脂合成及分泌有显著促进作用,可为深入解析脂滴形成相关基因在泌乳过程中的调控机制提供参考。     

毛壳素对绒山羊ADSCs组蛋白甲基化修饰的影响研究

为了探究毛壳素对绒山羊脂肪间充质干细胞(gADSCs)组蛋白甲基化修饰差异的影响。本研究采用不同浓度的毛壳素对gADSCs进行不同时间的处理，以期筛选出对细胞活性影响最低且能够最大程度抑制gADSCs组蛋白甲基化的药物处理浓度及时间。以最适药物浓度和时间处理组为试验组，无药物处理组为对照组，通过实时荧光定量PCR检测H3K9 me2和H3K9 me3甲基化相关酶和胚胎发育多潜能基因mRNA表达水平的改变，并检测毛壳素对组蛋白H3K9 me2和H3K9 me3蛋白表达水平的影响。结果显示，20 nmol·L^-1的毛壳素处理gADSCs 48 h时对细胞活性影响较小，组蛋白甲基化转移酶G9A的表达显著降低(P<0.05)，为最适处理浓度和时间。实时PCR结果显示，试验组H3K9 me2和H3K9 me3甲基化转移酶EHMT1、EHMT2、SUV39H1、SUV39H2表达显著降低(P<0.05)，H3K9 me2和H3K9 me3去甲基化酶KDM3A、KDM3B、KDM4B、KDM4D表达显著增高(P<0.05)，多潜能性相关基因SOX2、OCT4、NANOG表达量增高。免疫荧光和WB结果显示，处理组H3K9 me2蛋白水平无明显变化，而H3K9 me3蛋白水平显著降低(P<0.05)。20 nmol·L^-1的毛壳素处理gADSCs 48 h后可以显著降低组蛋白H3K9 me2和H3K9 me3的甲基化修饰作用，提高多潜能性相关基因的表达。     

猪肌内脂肪沉积相关基因的筛选及其表达特性分析

【目的】 通过分析马身猪和大白猪背最长肌转录组测序数据,筛选肌内脂肪沉积相关基因,并对其表达特性进行分析。【方法】 采集180日龄马身猪和大白猪背最长肌,采用RNA-Seq技术对其进行转录组测序,筛选差异表达基因并进行GO功能和KEGG通路富集分析;采用GeneCards在线查询基因功能,进一步筛选与肌内脂肪沉积相关的差异基因;采用实时荧光定量PCR技术检测差异基因在2个品种猪不同组织以及肌内脂肪细胞成脂分化过程中的表达变化。【结果】 获得2个品种猪背最长肌差异表达基因共280个,其中128个表达显著上调,152个表达显著下调。GO功能富集分析注释到46个条目,其中生物过程24条,分子功能8条,细胞组分14条。KEGG通路分析显著富集到PPAR信号通路、MAPK信号通路和脂肪细胞因子信号等脂肪沉积相关通路。GeneCards功能查询获得TRAF2、DUSP1、ACOT4、NR4A1、SLC27A6、PLIN5共6个与脂肪沉积相关的基因。实时荧光定量PCR分析表明,马身猪和大白猪背最长肌中NR4A1、DUSP1、PLIN5基因表达量差异显著或极显著(P<0.05;P<0.01),TRAF2、ACOT4和SLC27A6基因表达量差异不显著(P>0.05),但表达变化趋势与测序结果一致;马身猪腹部皮下脂肪组织中NR4A1和PLIN5基因表达量极显著高于背部皮下脂肪组织(P<0.01),而大白猪背部皮下脂肪组织中NR4A1和DUSP1基因表达量极显著高于腹部皮下脂肪组织(P<0.01),PLIN5基因表达量显著高于腹部皮下脂肪组织(P<0.05)。在背部皮下脂肪组织中,NR4A1、DUSP1和PLIN5基因在大白猪中的表达量极显著高于马身猪(P<0.01);在腹部皮下脂肪组织中,NR4A1和DUSP1基因在大白猪中的表达量显著高于马身猪(P<0.05),PLIN5基因表达量在2个品种间无显著差异(P>0.05)。体外培养的猪肌内脂肪细胞分析表明,随着成脂天数的增加,NR4A1基因表达量呈下降趋势,DUSP1和PLIN5基因表达量均呈上升趋势。【结论】 本研究获得了NR4A1、DUSP1、PLIN5 3个与猪肌内脂肪沉积相关的候选基因,可为后续进一步探讨猪肌内脂肪沉积调控机制提供一定的参考。     

豫西黑猪不同屠宰体重肌纤维组织学及成肌调控基因发育性变化

【目的】试验旨在揭示豫西黑猪背最长肌肌纤维组织学、肌纤维类型和成肌调控相关基因发育性变化及其相互之间的关系。【方法】选取平均体重约为60、75、90、105和120 kg共5个体重阶段的豫西黑猪，每个体重屠宰3头，共15头，公母随机。采用HE染色和免疫荧光染色分析快慢肌类型组成和纤维组织学特性，利用实时荧光定量PCR方法测定成肌调控相关基因生肌决定因子（myogenic differentiation，MyoD）、配对盒7（paired-box 7，Pax7）、肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN）、肌细胞生成素（myogenin，MyoG）、肌细胞增强因子2C （myocyte enhancer factor 2C，MEF2C）和肌纤维肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MyHC）亚型的mRNA表达量。【结果】随着豫西黑猪体重的增加，肌纤维密度整体呈下降趋势，在75 kg时极显著高于其他体重阶段（P<0.01），肌纤维面积和肌纤维直径整体呈上升趋势；慢肌面积占比在60和105 kg时显著或极显著低于其他体重阶段（P<0.05；P<0.01），快慢肌所占面积总百分比在90 kg时极显著低于其他体重阶段（P<0.01）。实时荧光定量PCR检测结果发现，MyHCⅠ基因mRNA表达量在75和105 kg时极显著高于其他体重阶段（P<0.01），MyHCⅡA基因mRNA表达量整体呈下降趋势，MyHCⅡX基因mRNA表达量在60 kg时达到最高，而MyHCⅡB基因mRNA表达量在75 kg时极显著低于其他体重阶段（P<0.01）；MyoD、Pax7、MSTN、MyoG、MEF2C基因mRNA表达量分别于60、75、90、120、120 kg时达到最大值。相关性分析结果表明，除MSTN基因外，MyoG、MyoD、Pax7和MEF2C基因均与肌纤维形态和MyHC基因各亚型之间有显著或极显著的相关性（P<0.05；P<0.01）；通过对120 kg的豫西黑猪和杜洛克猪比较发现，两者间肌纤维直径、肌纤维面积、肌纤维密度，以及MyHC和相关成肌调控基因mRNA表达量均有极显著差异（P<0.01）。【结论】在豫西黑猪60~120 kg生长阶段，肌纤维面积、肌纤维直径整体呈上升趋势，肌纤维密度呈下降趋势；在肌肉发育过程中，纤维类型组成的变化主要是Ⅰ、ⅡA、ⅡX型肌纤维向ⅡB型肌纤维的转化；与杜洛克猪相比，豫西黑猪肌纤维面积和肌纤维直径较大，肌纤维密度较低，MyHCⅠ与MyHCⅡA基因mRNA表达量较高。     

猪骨骼肌纤维类型和能量代谢相关基因的表达特性研究

【目的】研究马身猪、晋汾白猪和杜长大猪骨骼肌肌纤维类型和能量代谢相关基因的表达特性。【方法】选取6月龄马身猪、晋汾白猪和杜长大猪,屠宰后采集背最长肌和趾长伸肌,采用HE染色检测肌纤维的直径、密度和横截面积,通过实时荧光定量PCR分别检测Ⅰ型、Ⅱa型、Ⅱb型和Ⅱx型肌纤维的标记基因(MYH7、MYH2、MYH4和MYH1),线粒体活性相关基因(ATP5A1、PGC1-α和PPARβ),电子传递链活性相关基因(UQCRC2、SDHA、NDUFA9),以及糖酵解活性相关基因(LDHA、LDHB和GK)的表达量。【结果】马身猪背最长肌肌纤维直径和横截面积均显著低于晋汾白猪和杜长大猪,而密度显著高于晋汾白猪和杜长大猪(P<0.05);马身猪和晋汾白猪趾长伸肌肌纤维直径和横截面积均显著低于杜长大猪,而密度显著高于杜长大猪(P<0.05)。马身猪背最长肌MYH7基因的表达量最高,晋汾白猪最低;马身猪和晋汾白猪趾长伸肌MYH7基因的表达量显著高于杜长大猪(P<0.05)。马身猪背最长肌和趾长伸肌MYH2基因的表达量显著高于晋汾白猪和杜长大猪,晋汾白猪趾长伸肌MYH2基因的表达量显著高于杜长大猪(P<0.05)。马身猪背最长肌MYH4基因的表达量显著低于晋汾白猪和杜长大猪,马身猪和晋汾白猪趾长伸肌MYH4基因的表达量显著低于杜长大猪(P<0.05)。马身猪背最长肌中ATP5A1和PGC1-α基因的表达量均显著低于晋汾白猪和杜长大猪,晋汾白猪PGC1-α和PPARβ基因的表达量均显著低于杜长大猪(P<0.05);马身猪和晋汾白猪趾长伸肌中ATP5A1、PGC1-α和PPARβ基因的表达量均显著低于杜长大猪(P<0.05)。晋汾白猪背最长肌中UQCRC2、SDHA和NDUFA9基因的表达量均显著低于杜长大猪和马身猪(P<0.05);晋汾白猪和马身猪趾长伸肌中UQCRC2、SDHA和NDUFA9基因的表达量均显著低于杜长大猪,马身猪UQCRC2和SDHA基因的表达量均显著低于晋汾白猪(P<0.05)。晋汾白猪和马身猪背最长肌和趾长伸肌中LDHA、LDHB和GK基因的表达量均显著低于杜长大猪(P<0.05)。【结论】马身猪骨骼肌肌纤维直径和横截面积都较小,Ⅰ型和Ⅱa型肌纤维标记基因的表达量较高;杜长大猪骨骼肌Ⅱb型肌纤维标记基因的表达量较高,氧化磷酸化和糖酵解相关基因的表达量均较高。     

干扰HSD17B4基因对水牛乳腺上皮细胞乳脂和酪蛋白的影响

通过将小干扰-17β-羟基固醇脱氢酶Ⅳ（si-HSD17B4）基因转染水牛乳腺上皮细胞,检测酪蛋白、甘油三酯含量及脂肪酸相关基因的表达变化,从而揭示干扰HSD17B4基因对水牛乳腺上皮细胞中乳脂和酪蛋白的影响。采用实时荧光定量PCR检测HSD17B4 mRNA在水牛各个组织中的相对表达量。合成3条水牛HSD17B4小干扰RNA （siRNA）和1条对照si-HSD17B4-nc （si-nc）,并筛选干扰效果最佳的片段和时间。si-HSD17B4转染水牛乳腺上皮细胞后,通过酪蛋白试剂盒检测酪蛋白的表达情况,通过甘油三酯测定和油红O染色检测甘油三酯含量,通过实时荧光定量PCR检测干扰HSD17B4基因对甘油三酯、脂肪酸合成以及氧化相关基因表达的影响。结果表明,HSD17B4基因在水牛心脏和卵巢中相对高表达,且显著高于其他组织（P<0.05）。3条HSD17B4 siRNA片段均能有效地抑制HSD17B4基因的表达,其中si-HSD17B4-1干扰效果最佳,HSD17B4 mRNA表达量极显著低于对照组（P<0.01）;最佳干扰时间为24 h。酪蛋白检测结果显示,干扰HSD17B4基因对水牛乳腺上皮细胞中酪蛋白合成无影响。甘油三酯测定结果显示,干扰HSD17B4基因后细胞中甘油三酯含量上升,差异显著（P<0.05）。油红O染色结果显示,干扰HSD17B4基因后细胞中的脂滴明显增多。实时荧光定量PCR检测结果显示,干扰HSD17B4基因会使FABP3、ACSL1、DGAT1、DGAT2、PLIN2、BTN1A1基因表达量上调,分别上调9.28（P<0.01）、1.36（P<0.05）、1.17（P<0.05）、1.83（P<0.01）、1.60（P<0.01）和2.17（P<0.01）倍;同时使PPARA、SREBP1C、SCD、ACSS2、ACACA、AGPAT6、LPIN1、XDH、ABCD1、ACOX2、EHHADH、SCP2基因表达量下降,分别下调至50.55%（P>0.05）、61.15%（P<0.01）、84.91%（P<0.01）、89.34%（P<0.01）、21.88%（P<0.01）、86.48%（P<0.01）、25.35%（P<0.01）、27.24%（P<0.01）、41.74%（P<0.01）、22.17%（P<0.01）、62.70%（P<0.01）和70.33%（P<0.01）。结果表明,HSD17B4基因在水牛组织中广泛表达;si-HSD17B4高效抑制HSD17B4基因在水牛乳腺上皮细胞中的表达,未检测到干扰HSD17B4基因对乳腺上皮细胞酪蛋白的影响,干扰HSD17B4基因上调了FABP3、ACSL1、DGAT1、DGAT2基因的表达,从而促进甘油三酯的合成,同时降低ABCD1、ACOX2、EHHADH、SCP2基因的表达,减少脂肪酸β-氧化。     

Glut4突变调控脂肪重分布及肌纤维重塑的机制研究

旨在探讨Glut4基因突变后骨骼肌能量代谢及肌纤维转化的分子机制。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建Glut4^Q177L突变鼠。选取22周龄健康的野生雄鼠和Glut4^Q177L突变雄鼠,即试验分为两组,每组3只,3个重复,进行表型评价和糖耐量、胰岛素耐量试验;荧光定量检测两组小鼠腓肠肌葡萄糖转运蛋白、脂代谢、肌纤维类型相关调控基因的表达差异;Western blot测定腓肠肌AMPK及其磷酸化蛋白含量。结果表明,突变鼠皮下脂肪和附睾脂重量显著低于对照组（P<0.05）;突变鼠糖耐量曲线下面积极显著增加（P<0.01）,表明其糖耐量受损;突变鼠血清中甘油三酯的含量显著下降（P<0.05）。相较于野生型小鼠,Glut4^Q177L突变鼠腓肠肌中Glut4、Glut1和Glut12等多个葡萄糖转运蛋白表达量显著升高（P<0.05）;葡萄糖摄取受限导致调控能量代谢关键基因AMPK在mRNA、蛋白和磷酸化修饰水平均显著升高（P<0.05）,同时促进与脂肪酸摄取与合成代谢相关的CD36和ATGL等基因表达上调（P<0.05）;慢速氧化型肌纤维（I型）和快速氧化型肌纤维（IIa型）相关基因表达极显著升高（P<0.01）,而快速酵解型纤维（IIb型）相关基因表达显著降低（P<0.05）。本研究结果显示,Glut4葡萄糖结合关键位点突变降低了骨骼肌和脂肪葡萄糖摄取能力,通过上调其它转运蛋白增加葡萄糖摄取;激活AMPK信号通路及分泌肌细胞因子调控脂肪分解以满足能量需求;促进线粒体丰富的氧化型肌纤维生成以提高能量利用效率。Glut4突变不仅可以为骨骼肌胰岛素抵抗提供有效的动物模型,还可以为家畜生物育种提供基因编辑参考位点。     

猪舍细颗粒物促进猪原代肺泡巨噬细胞向M1极化

旨在研究猪舍细颗粒物（PM_2.5）对猪原代肺泡巨噬细胞（PAMs）精氨酸代谢、炎症因子表达和极化标志物表达的影响。利用支气管肺泡灌洗方法,体外分离PAMs,细胞纯化后,利用Diff-quik染色和F4/80标记鉴定PAMs,并测定细胞活力。将纯化培养的PAMs分为对照组和PM_2.5处理组（50 μg·mL^-1）,继续培养4、8和12 h,测定细胞活力,收集细胞上清测定一氧化氮（NO）的含量,裂解PAMs测定精氨酸酶的活性,并采用RT-PCR检测PAMs炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-10以及M1、M2型巨噬细胞标志物CD80和CD206的表达水平。结果显示,通过支气管肺泡灌洗方法成功分离培养了PAMs,并发现PAMs的细胞活力随着培养时间的延长逐渐降低（P<0.05）。PM_2.5处理PAMs,显著提高了细胞上清中NO含量（P<0.05）,显著降低了细胞精氨酸酶的活性（P<0.01）,并显著提高了细胞炎症因子IL-1β和TNF-α mRNA表达水平（P<0.01）,降低了IL-10 mRNA表达水平（P<0.05）。另外,PM_2.5处理PAMs早期,显著提高了CD80 mRNA表达水平（P<0.01）,在后期显著降低CD206 mRNA表达水平（P<0.01）。综上表明,猪舍PM_2.5促进了PAMs向M1表型极化,促进了炎症的发展。     

民猪脂肪细胞分化过程中抗寒相关基因表达规律研究

旨在探究民猪脂肪细胞分化过程中产热基因和米色脂肪标记基因的表达变化规律，为进一步研究民猪脂肪细胞向米色脂肪细胞分化的分子机制提供依据。本研究采集1月龄民猪的背部脂肪组织，分离前体脂肪细胞进行培养及成脂诱导，观察分化过程中细胞形态并进行油红O染色鉴定；检测产热基因UCP3、PGC-1α、PPARα和米色脂肪标记基因EBF2、CD81、PDGFRα在诱导分化第0、2、4、6、8天的表达量。结果表明，随着诱导分化的时间增加，细胞中的脂滴逐渐增多，在分化第8天时进行油红O染色，多数细胞达到成熟脂肪细胞阶段。以第0天为对照，PGC-1α、EBF2、PDGFRα在第2天时表达量极显著升高（P<0.01），且达到最高，第4、6、8天呈下降趋势。UCP3在第4、6、8天表达量极显著升高（P<0.01），第8天有所下降。PPARα和CD81在第2天时表达量极显著升高（P<0.01），且在第4和6天表达量与第2天相比变化不大。综上表明，本研究成功进行了民猪前体脂肪细胞的成脂诱导分化，揭示了分化过程中产热和米色脂肪标记基因的表达规律，为进一步研究民猪前体脂肪细胞向米色脂肪细胞分化的分子机制和民猪抗寒能力奠定基础。