京津冀部分地区致犊牛腹泻大肠杆菌毒力基因、耐药基因检测及药物敏感性分析

【目的】探明京津冀地区犊牛腹泻大肠杆菌毒力基因与耐药基因流行情况,筛选敏感药物。【方法】于2020年12月至2021年7月从京津冀地区部分牛场采集146份犊牛腹泻样本,通过细菌分离纯化、革兰氏染色镜检及16S rRNA测序进行大肠杆菌分离鉴定;采用PCR方法对分离菌进行毒力基因（F17、K99、F41、STa、stx1、irp2和fyuA基因）和耐药基因（aac（6'）-Ⅰb、bla_CTX-M、bla_TEM、OqxB、tetA和sul1基因）检测;采用K-B纸片法进行药物敏感性试验。【结果】分离菌在鉴别培养基上的生长形态及革兰氏染色镜检结果均符合大肠杆菌生理生化特性,分离菌16S rRNA测序结果呈单一峰值,对拼接序列在NCBI中进行BLAST比对后发现,与大肠杆菌相似性均>96%,确定分离菌为大肠杆菌。试验共分离鉴定大肠杆菌142株,其中有88株携带毒力基因,占61.97%（88/142）,毒力基因F17、K99、F41、STa、stx1、irp2、fyuA阳性率分别为24.65%、0.70%、0、2.11%、1.41%、45.07%和21.83%,其中F17、irp2、fyuA为优势毒力因子,同时携带多重毒力因子的大肠杆菌检出率较低。aac（6'）-Ⅰb、bla_CTX-M、bla_TEM、OqxB、tetA和sul1 6种耐药基因皆被检出,bla_TEM基因检出率最高,为45.77%,aac（6'）-Ⅰb和OqxB基因检出率最低,均为9.15%,分离菌株主要携带1~3种耐药基因。药物敏感性试验结果显示,142株分离菌对诺氟沙星敏感率最高,其次为环丙沙星,对青霉素敏感率为0,耐药现象严重,耐2种以上抗菌药物的菌株达86.62%。【结论】京津冀地区犊牛腹泻大肠杆菌毒力基因与耐药基因流行广泛,耐药普遍,多重耐药现象严重。本研究可为京津冀地区犊牛腹泻的防治提供理论依据。     

屠宰场沙门氏菌耐药性分析和毒力基因检测

【目的】研究广东省茂名地区屠宰环节猪肉中携带的沙门氏菌的耐药性和毒力特征,为该地区食源性沙门氏菌的危害评估和防控措施制定提供依据。【方法】从广东省茂名地区屠宰场采集的猪肉、脾脏、肝脏样本中分离到19株沙门氏菌,采用K-B药敏纸片法检测其对β-内酰胺类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类、酰胺醇类和磺胺类抗菌药物的耐药性,用PCR方法检测β-内酰胺类耐药基因(bla_TEM、bla_OXA-1、bla_SHV)、氟喹诺酮类耐药基因(qnrA、qnrS、qnrB)、氨基糖苷类耐药基因(aadA1、aac(6')-Ⅰb、rmtB)、四环素类耐药基因(tetA、tetB、tetC)、酰胺醇类耐药基因(Cat1、floR)、磺胺类耐药基因(SulⅠ、SulⅡ、SulⅢ)和10种毒力基因(mogA、sseL、mgtC、bcfA、araB、spvR、spvA、spvB、spvC、spvD)的携带情况。【结果】19株沙门氏菌耐药严重,对四环素、多西环素、氯霉素、氟苯尼考、磺胺异噁唑的耐药率均＞50％,对四环素、多西环素和氯霉素的耐药率最高,均为89.5%(17/19),对3种及其以上抗菌药物耐药率为89.5%,最高对11种抗菌药物均有耐药性;bla_TEM、qnrA、aadA1、aac(6')-Ⅰb、Cat1、floR、SulⅠ、SulⅢ耐药基因的检出率较高(≥50.0%),bla_TEM耐药基因检出率最高为84.2％,同时携带5个及以上耐药基因的菌株占73.7%,最高携带12个耐药基因;mogA、mgtC、bcfA、araB毒力基因均有检出,且检出率均在70％以上,其中mogA基因的检出率高达100%,其余6种毒力基因均未检出。【结论】广东省茂名地区屠宰场猪肉中沙门氏菌多重耐药严重,携带多种耐药基因且具有复杂的基因组合类型,同时携带多种毒力基因。     

羊源沙门氏菌的分离鉴定及致病性和耐药性分析

【目的】 分离张家口某地区羊源沙门氏菌并检测其血清型、毒力基因、耐药性及耐药基因，分析分离株表型和基因的相关性和差异性。【方法】 将样品用选择培养基增菌并纯化培养，挑选疑似的沙门氏菌单菌落进行革兰氏染色、镜检和生化鉴定。根据沙门氏菌属特异性基因invA的核苷酸序列进行PCR和血清型鉴定。利用SPF昆明小鼠对分离株进行致病性试验并测定其半数致死量。PCR扩增毒力岛基因hilA、avrA、sseL、ssaQ、mgtC、siiD和sopB，肠毒素基因stn，质粒毒力基因spvR。采用Kirby-Bauer纸片扩散法进行药敏试验，PCR扩增β-内酰胺酶耐药基因bla_TEM、bla_CMY和bla_OXA，氟喹诺酮耐药基因qnrS、oqxA和oqxB，磺胺类耐药基因sul1、sul2和sul3，四环素类耐药基因tetB及氨基糖苷类耐药基因aadA1。根据PCR检测结果，将扩增的毒力基因和耐药基因进行测序，并与NCBI中相应的参照基因进行BLAST比对分析。【结果】 分离得到4株羊源沙门氏菌，血清型鉴定均为鼠伤寒沙门氏菌。分离株对小鼠具有致病性，4株分离株的半数致死量为5.67×10⁷~6.45×10⁷ CFU。分离株可检出毒力岛基因hilA、avrA、sseL、ssaQ、mgtC、siiD和sopB，肠毒素基因stn及质粒毒力基因spvR，检出率均在50%以上。分离株对复方新诺明、利福平、林可霉素、青霉素、氨苄西林耐药，对庆大霉素、环丙沙星敏感。分离株可检出β-内酰胺类耐药基因bla_TEM、氟喹诺酮耐药基因qnrS、磺胺类耐药基因sul1和sul2。【结论】 本研究分离的羊源沙门氏菌的毒力表型与染色体和质粒携带的毒力基因有关。分离菌株携带β-内酰胺类、磺胺类耐药基因，与耐药表型相符，临床上可将庆大霉素和环丙沙星作为首选药。     

水貂肺炎克雷伯菌的分离鉴定及耐药性分析

【目的】 肺炎克雷伯菌是人畜共患的条件致病菌, 是引起水貂肺炎的常见病原菌之一。试验主要对吉林省某水貂养殖场送检的6只患有肺炎的病死水貂进行细菌分离鉴定及耐药性分析, 为指导临床合理用药提供依据。【方法】 通过分离纯化方法从样品中分离菌株并进行PCR鉴定, 应用多位点序列分型技术(MLST)进行菌株ST分型。通过感染小鼠了解菌株的致病性, PCR检测血清型及毒力基因的携带情况; 运用琼脂稀释法检测分离菌株对18种药物的敏感性, 并通过PCR检测分离菌株耐药基因的携带情况。【结果】 分离得到的6株菌株经PCR鉴定为肺炎克雷伯菌; MLST分析结果表明6株菌株分别有6种ST型, 分别为: ST2594、ST1782、ST2844、ST2330、ST86和ST661。致病性分析结果显示, 6株菌株均可引起小鼠死亡, 共检测出6种毒力基因, 未检测到毒力较强的血清型。药敏试验结果显示, 6株肺炎克雷伯菌对头孢他啶、头孢曲松、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星较敏感, 对链霉素、庆大霉素、卡那霉素、青霉素、氨苄西林、环丙沙星、恩诺沙星、左氧氟沙星、多西环素和氟苯尼考较耐药。耐药基因检测结果显示, 6株菌株共检测出bla_SHV、bla_TEM-1、bla_CTX-M-1G、aadA1、aac(3’)-Ⅳ、aac(3’)-Ⅱc、aph(4’)-Ⅰa、aph(3’)-Ⅶ、aph(3’)-Ⅳ、aph(2’)-Ⅰb、rmtB、qnrB、qnrD、qnrS、qepA、oqxAB、floR和mcr-1 18种耐药基因。【结论】 分离到的6株肺炎克雷伯菌株为不同的种系进化, 并具有较强的致病性和耐药性, 为临床用药治疗带来困难。     

山东地区乳房炎牛奶中大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析

试验旨在了解山东地区乳房炎牛奶中大肠杆菌的污染状况及耐药情况。选择山东省3个地区的规模化奶牛场共采集227份牛奶样品，采用细菌学方法对大肠杆菌进行分离鉴定，用微量肉汤稀释法检测分离菌对11种常规抗菌药物的敏感性，采用PCR方法对常见的13种耐药基因、8种毒力基因和Ⅰ类整合子基因盒结构进行分析。结果显示，从227份牛奶样品中共分离出71株大肠杆菌；大肠杆菌对1种及1种以上抗菌药耐药的菌株达到77.5%，多重耐药率为15.5%，其中对多黏菌素耐药率为52.2%，对阿莫西林-克拉维酸耐药率为39.4%，而所有菌株均对新霉素表现为敏感。PCR检测耐药基因、毒力基因和Ⅰ类整合子结果显示，β-内酰胺类耐药基因中bla_TEM基因携带率为100%，其中全部为bla_TEM-1基因，bla_CTX-M基因携带率为32.4%，其中主要为bla_CTX-M-15基因，没有检测到bla_SHV、bla_OXA基因；多黏菌素的耐药基因mcr-1携带率为29.6%；喹诺酮类耐药基因中aac（6'）-Ⅰb-cr基因携带率为29.6%，qnrB基因携带率为20.8%，没有检测到qnrA和qnrC耐药基因；对8种毒力基因检测分析结果显示，仅Hly毒力基因没有被检出，Ecs3703、Irp2基因的检出率较高，分别为90.1%和63.4%，71株大肠杆菌中共有11株携带Ⅰ类整合子，检出率为15.5%，11株大肠杆菌携带6种耐药基因盒结构，最主要的耐药基因盒排列为dfr17-aadA5。本研究结果表明，山东地区乳房炎牛奶中大肠杆菌的耐药现象严重，携带毒力基因Ecs3703、Irp2的大肠杆菌可能是引起奶牛乳房炎的致病菌，Ⅰ类整合子的检测在细菌耐药性与基因携带率方面发挥着关键作用，可为临床预防和治疗奶牛乳房炎大肠杆菌病提供理论依据。     

猪源奇异变形杆菌的分离鉴定及特征分析

为探究广西地区猪源奇异变形杆菌的毒力和耐药情况,本研究从不同规模养殖场收集病死猪病料98份,通过分离培养、形态学观察、染色镜检、16S rRNA测序对分离菌进行鉴定;采用微量肉汤稀释法进行药敏试验;PCR检测毒力基因、耐药基因和整合子及其可变区;可变区扩增产物克隆至pMD^TM19-T载体进行测序。鉴定结果显示,22株细菌在TSA培养基上弥漫性生长,在SS培养基上形成中心黑色边缘白色的单菌落,镜检为革兰氏阴性短杆菌,变形杆菌属特异性基因（TUF）阳性。16S rRNA测序结果显示,21株分离菌与奇异变形杆菌同源性达99%,1株分离菌与彭氏变形杆菌同源性达99%。药敏结果显示,21株奇异变形杆菌对四环素、多西环素、氨苄西林、磺胺甲噁唑耐药率均为100%,对头孢氨苄、头孢呋辛、头孢噻肟、亚胺培南、卡那霉素耐药率在57.1%以上,所有分离株均为多重耐药菌。PCR结果显示,21株分离菌毒力基因atfA、hpmA、ireA、mrpA、pmfA、rsb、ureC、zapA、ptA检出率均为100%,ucaA检出率为95.2%;ESBLs菌株为bla_TEM型、bla_CTX型或bla_TEM型和bla_CTX型,AmpC菌株均为bla_DHA型,携带ESBLs或AmpC基因的菌株比例为57.1%、14.3%,同时携带ESBLs和AmpC基因的菌株比例为14.3%;qnrA、qnrB、qnrS和aac（6’）-Ⅰb-cr检出率分别为9.5%、0、4.8%和80.1%。21株分离菌Ⅰ类整合子（intⅠ1）阳性率61.9%,检测到9种基因盒阵列（aadA2-linF、estX、dfrA32-ereA-aadA2、drfA5、drfA12-orfF-aadA2、arr3-aac （6’）Ⅰb-cr5、aac （6’）Ⅰb-cr5-bla_OXA-1-catB3-aar3、drfA1-orfC和aadA2）;Ⅱ类整合子（intⅠ2）阳性率76.2%,检测到1种基因盒阵列（drfA1-sat1-aadA1）。本研究结果表明,广西地区猪源奇异变形杆菌毒力高且耐药严重,为后期针对奇异变形杆菌的防治和研究提供数据支持。     

肉鸡养殖场中耐药相关基因散播情况的调查研究

为研究耐药相关基因在肉鸡养殖场中的分布流行情况，本研究以河北省肉鸡养殖场待出栏肉鸡为研究对象，采用随机抽样方式采集肉鸡泄殖腔拭子样品264份，粪便污染地面样品9份，进行bla_NDM、bla_OXA、bla_CTX-M、armA、fexA、cfr、mcr-1、qnrS 8种耐药基因和int1、ISCR1 2种与耐药基因散布密切相关基因的实时荧光定量PCR检测。结果显示，10种基因在273份样品中均有不同程度检出，检出率在4.03%~97.07%之间，检出率最低的为armA基因，最高的为int1基因；样品中有基因共存情况，并以3种耐药基因共存的情况最多，有4份样品存在1种耐药基因，6份样品未检出任何耐药基因，没有样品共存8种耐药基因；通过数据分析，共得到41种不同的耐药基因谱型，其中常见的耐药基因谱型为bla_CTX-M-fexA-mcr-1和bla_OXA-bla_CTX-M-fexA-cfr-mcr-1-qnrS；分析发现样品携带两种及以上耐药基因时，与耐药基因散布相关的int1和ISCR1元件检出率越高，耐药基因在样品中检出的种类越多；耐药基因bla_OXA、bla_CTX-M、fexA、cfr、mcr-1、qnrS与int1基因的共存有统计学意义（P<0.05）；耐药基因bla_NDM、bla_OXA、bla_CTX-M、fexA、cfr、qnrS与ISCR1元件的共存有统计学意义（P<0.05）。本研究为畜牧兽医养殖行业耐药性监测工作提供了基于样品的新型实时荧光定量PCR检测方法，为有效预防耐药菌、耐药基因产生、控制耐药性的快速传播提供了可靠的数据支持。     

猪链球菌14型的分离鉴定及生物学特性研究

为了检测确定2019年5月河南某规模化猪场一栋保育仔猪发病猪群的病原,本研究从送检的发病猪关节液中分离获得1株细菌。通过细菌纯化培养、革兰氏染色、形态学观察及猪链球菌gdh基因PCR扩增,确定该分离菌株为猪链球菌。用猪链球菌分型引物对该菌株进行PCR扩增分型鉴定及软件比对分析,结果表明该分离菌株为猪链球菌14型,与猪链球菌JS14株（GenBank登录号：CP002465.1）同源性为100%。毒力基因检测结果表明,该菌株的同时携带有epf、mrp、sly、fbps、orf2毒力基因,属于高致病性菌株。小鼠致病性试验结果也证明该菌株是一株高致病性猪链球菌。药物敏感性试验结果显示,该菌株对β内酰胺类和喹诺酮类药物敏感,对氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类和磺胺类高度耐药,表现出多重耐药现象。对该菌株进行5大类24种耐药基因检测,该菌株同时携带有bla_TEM、aadA1、strA、strB、aacC2、aphA1、tet（B）、gyrA、parC、sul2耐药基因。该研究为后续进一步开展猪链球菌14型流行特点和致病机制研究奠定了基础,为猪链球菌14型临床防控提供了理论依据,同时具有重要的公共卫生意义。     

福建省漳州市罗非鱼无乳链球菌分离鉴定及毒力基因和耐药性研究

【目的】 明确福建漳州地区罗非鱼无乳链球菌临床分离株的血清型、毒力基因携带情况与耐药特性,为鱼源无乳链球菌研究提供新的数据。【方法】 于福建省漳州市部分罗非鱼养殖场采集疑似无乳链球菌感染的病鱼样品,通过分离培养、形态观察及生化试验初步分离鉴定病原菌。经由16S rDNA特异性片段引物、16S rDNA通用引物进行PCR鉴定及测序比对鉴定分离株。用PCR方法检测分离株血清型及4个主要毒力基因（cylE、sodA、gapC和scpB基因）分布情况。通过纸片扩散法对分离菌株进行11大类共29种抗菌药物的药敏试验,并进行多重耐药分析。【结果】 分离株菌落呈白色圆形、边缘整齐、表面光滑湿润,呈β溶血;革兰染色阳性,菌体排列为长短不一的链状,单个或成对存在;VP试验、CAMP均为阳性,触酶试验阴性,能发酵海藻糖,均符合无乳链球菌的典型特征,经鉴定共分离获得14株鱼源无乳链球菌。14株分离菌株的血清型均为Ⅰa型。分离株毒力基因cylE、sodA、gapC的检出率均为100%,而毒力基因scpB均未检出。分离菌株对磺胺异噁唑、庆大霉素、卡那霉素耐药率均为100%,对链霉素、新霉素、甲氧胺嘧啶耐药率均>70%。分离株均为多重耐药菌株,6重及以上耐药的菌株占总分离菌株数的78.57%。【结论】 本研究明确了当前福建漳州地区罗非鱼源无乳链球菌的血清型、毒力基因和耐药特性,为进一步研究鱼源无乳链球菌的致病机理和临床有效防控措施提供参考。     

广东鹅场大肠杆菌耐药状况及blaCTX-M基因的传播特征

为揭示广东地区鹅场动物和环境源大肠杆菌的耐药情况及超广谱β-内酰胺酶CTX-M的流行与传播特征,本研究从广东省江门及阳江市共10处鹅场采集鹅及环境样品199份,采用MALDI-TOF-MS法分离鉴定大肠杆菌。采用琼脂稀释法对菌株进行耐药性分析,采用PCR法检测头孢噻肟耐药菌中bla_CTX-M基因及其基因环境,采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）、接合转移和质粒复制子分型等方法探究bla_CTX-M基因的传播特征。结果显示,共获得196株大肠杆菌,对氨苄西林、多西环素、氟苯尼考和链霉素耐药率均超过50%,第三代头孢菌素耐药率为10%~25%,其中头孢噻肟耐药菌有49株（24.6%）。阳江地区大肠杆菌对受试药物的耐药率高于江门,且动物源高于环境源,尤其是头孢噻肟和头孢噻呋均存在显著差异（P<0.05）。头孢噻肟耐药菌中共检出19株携带bla_CTX-M基因,包括bla_CTX-M-55（n=17）、bla_CTX-M-27（n=1）和bla_CTX-M-65（n=1）,且bla_CTX-M基因阳性菌均可对5~11种药物耐药,呈现多重耐药的表型。bla_CTX-M-55基因环境均为ISEcp1-bla_CTX-M-55-orf477,且在ISEcp1与bla_CTX-M基因之间有3种长度的间隔序列;而bla_CTX-M-27和bla_CTX-M-65的基因环境均为ISEcp1-bla_CTX-M-27/65-IS903。19株bla_CTX-M基因阳性菌呈现10种PFGE谱型,存在一种主要流行的谱型（47.4%）,其包括多种来源菌株,暗示存在克隆传播现象。12株（63.2%）bla_CTX-M基因阳性大肠杆菌中bla_CTX-M基因转移成功,bla_CTX-M基因阳性接合子携带的复制子型为IncFⅡ（n=10）和IncHⅠ2（n=2）,且存在多西环素和氟苯尼考耐药表型与bla_CTX-M基因共转移现象。研究发现,阳江鹅场大肠杆菌耐药情况较为严重,bla_CTX-M基因存在一定的流行性且以bla_CTX-M-55亚型为主,bla_CTX-M基因阳性菌的克隆传播和质粒及插入序列ISEcp1介导的水平传播是导致该基因在鹅场大肠杆菌中扩散的主要原因,应引起高度重视。     

抗马链球菌马亚种组方加味优选及其体内抑菌作用研究

【目的】筛选可抑制马腺疫主要致病菌——马链球菌马亚种的最优中药组方,为临床马腺疫的防治提供参考。【方法】选用赤芍、大黄、山豆根等27种中药,首先通过体外抑菌试验(牛津杯法、最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC)、联合药敏试验)结合L₈(2⁶)正交试验初步筛选抗马链球菌马亚种中药组方的最佳优选因素,再通过L₁₈(3⁶)正交试验进一步筛选基础组方最佳配比;最后在基础组方的基础上,根据中兽医方剂配伍理论,添加黄芪和当归2味补虚药,通过马腺疫小鼠模型体内抑菌试验筛选加味组方配比,结合组方保护率结果及组织脏器病理变化验证加味组方的体内抑菌作用。【结果】试验筛选出了马链球菌马亚种超敏和高敏的7味中药:浙贝母、赤芍、甘草、大黄、雪白睡莲、山豆根和苦参。大黄、雪白睡莲、山豆根、甘草、苦参和浙贝母的MIC分别为0.078、0.078、0.125、0.156、0.156和0.250 mg/mL。雪白睡莲、赤芍、山豆根、甘草、大黄、苦参和浙贝母的MBC分别为0.078、0.125、0.125、0.156、0.156、0.156和0.250 g/mL。根据各单味药物的MIC和两两联合后的MIC计算得出浙贝母与雪白睡莲联合药敏指数＞2,二者存在颉颃作用,故剔删浙贝母。通过2次正交试验得出基础组方最佳配比为:赤芍∶甘草∶大黄∶雪白睡莲∶山豆根∶苦参＝4∶2∶2∶4∶4∶1;结合加味组方体内抑菌试验可知,黄芪∶当归=1∶1、配伍浓度为0.5 g/mL时,保护率可达87.5%,且中药组方对马链球菌马亚种所致的小鼠肺脏炎性损伤修复良好。【结论】本试验成功优选出1种对马腺疫主要致病菌——马链球菌马亚种具有良好抑菌、组织保护作用的中药组方,配比为:赤芍∶甘草∶大黄∶雪白睡莲∶山豆根∶苦参∶黄芪当归(1∶1)=4∶2∶2∶4∶4∶1∶1。     

复方双黄连制剂体外抗菌抗病毒活性研究

【目的】探究复方双黄连制剂体外抗菌抗病毒活性,为复方双黄连的深度开发及家禽、家畜合理选择用药提供科学依据。【方法】将金银花、黄芩、连翘颗粒分别制成浸膏,再将药物浸膏及穿心莲颗粒按照比例制成穿心莲、双黄连（金银花：黄芩：连翘=1：1：2）和复方双黄连（金银花：黄芩：连翘：穿心莲=1：1：2：2）口服液,调节pH为7.0,生药浓度为100%。用大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的12个菌株进行细菌敏感性检测,采用牛津杯结合试管二倍稀释法筛选出敏感菌株,根据药物的最小抑菌浓度（MIC）探讨其体外抗菌活性;采用二倍稀释法稀释药物,培养恒河猴胚肾细胞（MA-104）、鸡胚成纤维细胞（DF-1）,用CCK-8法检测细胞活力,结合细胞病变（CPE）情况确定3种药物安全浓度,将最大药物安全浓度以二倍稀释法稀释3个梯度,用新城疫病毒、轮状病毒对MA-104和DF-1进行药物+病毒互作、先加药后攻毒和先攻毒后加药3种方式的处理,用CCK-8法检测细胞活力,并结合CPE探讨药物的体外抗病毒活性。【结果】复方双黄连的抗菌效果优于穿心莲和双黄连,其对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的MIC分别为0.20~1.56、0.20~1.56和0.78~1.56 mg/mL。CPE和细胞活力的测定结果表明,双黄连、穿心莲、复方双黄连对DF-1细胞的安全浓度范围分别为0~6.25、0~0.78和0~0.78 mg/mL,对MA-104细胞的安全浓度范围分别为0~3.13、0~0.78和0~0.78 mg/mL。新城疫病毒17E株对DF-1细胞的TCID₅₀为10^-6.19/100 μL;牦牛轮状病毒G6P[1]型SDA2株对MA-104细胞的TCID₅₀为10^-6.24/100 μL。复方双黄连通过直接灭活病毒（药物+病毒互作）、阻断病毒吸附（先加药后攻毒）及干扰病毒复制（先攻毒后加药）途径对新城疫病毒的有效抑制率分别为28.82%、55.92%、42.45%,对轮状病毒的有效抑制率分别为48.84%、26.52%、15.40%。【结论】复方双黄连的抗菌抗病毒作用均强于双黄连和穿心莲,且其对大肠杆菌、沙门氏菌的抗菌效果优于金黄色葡萄球菌,研究结果可为复方双黄连在兽医临床应用和深入开发提供科学依据。     

副猪嗜血杆菌血清7型菌株毒力及耐药性分析

【目的】了解河南地区副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)血清7型流行菌株的毒力及耐药情况。【方法】以Hps血清7型参考菌株为对照,对6株Hps血清7型临床分离菌株进行16S rRNA基因扩增、序列分析、毒力基因检测、致病性试验和药敏试验研究。【结果】16S rRNA基因测序及相似性比对结果显示,菌株1436与参考菌株0007相似性为100%,菌株1565、1624与参考菌株0007相似性均为98.6%。系统发育树分析表明,菌株1436与参考菌株0007亲缘关系最近;菌株1624与参考菌株0007亲缘关系最远。6株临床菌株与参考菌株表现为2种毒力基因型,菌株均携带有vta1、vta2、vta3、wza、nanH、cdtA、cdtB、cdtC和espP2毒力基因,其中5株临床菌株还携带ompP2毒力基因。豚鼠致病性试验结果显示,临床菌株毒力较参考菌株表现出不同程度的增强,参考菌株不能感染豚鼠发病,未表现任何临床症状;临床菌株可感染豚鼠发病,表现出一定的临床症状,发病率为20%~40%,死亡率为0。参考菌株和临床菌株均对头孢他啶和头孢噻呋敏感,对强力霉素、氟苯尼考中介,对新霉素、卡那霉素、阿米卡星、红霉素、替米考星等耐药,且均表现出多重耐药现象。【结论】Hps血清7型临床菌株有一定的致病性,但毒力较弱,对头孢类药物敏感,有明显的多重耐药现象,临床上应注意对该血清型的防控。本研究为Hps血清7型流行病学、致病机制研究奠定了基础,为Hps血清7型的临床防控提供了参考依据。     

鸭源致病性大肠杆菌O抗原与毒力基因检测及药敏试验

【目的】探究荣昌、大足和隆昌三地鸭大肠杆菌分离株的O抗原、毒力基因及耐药性。【方法】将2014年—2021年鸭病料中分离得到的107株细菌在无菌条件下接种于麦康凯培养基中划线进行培养纯化,通过16S rDNA基因扩增测序和生化试验进行细菌鉴定,采用PCR技术对O抗原和16种毒力基因进行检测,采用Kirby-Bauer纸片扩散法进行药敏试验。【结果】107株分离株鉴定为大肠杆菌;O抗原鉴定试验鉴定出9种O抗原,其中优势抗原为O78(37.00%)、O7(25.00%),O121和O145(均为15.00%),并检测到5株O78+O145和O7+O145融合株;共检测出11种毒力因子,其中强致病性毒力基因有Tsh基因(检出率为25.23%)、fyuA基因(检出率为31.78%)、estB基因(检出率为31.78%)、Vat基因(检出率为2.80%)、iucA基因(检出率为44.56%)。3种毒力基因ompA、yijP和ibeB的携带率最高,分别为100.00%、96.26%和85.98%;药敏试验结果表明分离株对氨基糖苷类药物、米诺环素和多黏菌素最为敏感,对大环内酯类药物和克林霉素耐药,分...     

单增李斯特菌inlK基因缺失株的构建及其生物被膜与消毒剂抗力分析

【目的】 研究inlK基因对Lm90SB2菌株生物被膜形成能力的影响及其生物被膜与消毒剂抗力的关系,以期为有效防控单增李斯特菌污染提供参考。【方法】 以单增李斯特菌Lm90SB2为试验菌,根据GenBank中公布的单增李斯特菌F2365 inlK基因序列(登录号:AE017262),应用Primer Premier 5.0软件设计用于扩增inlK基因上、下游同源臂片段及验证缺失株的特异性引物,以同源重组技术构建inlK基因缺失株,并通过旁外侧引物运用PCR方法进行缺失株检测。将标准菌株Lm90SB2和构建的缺失株分别培养8、12、24、48 h后进行结晶紫染色,在倒置显微镜下观察形态变化,并用酶标仪测定生物被膜形成能力;用含3 g/L卵磷脂+3 g/L吐温80的PBS溶液和含10 g/L卵磷脂+20 g/L吐温80的PBS溶液作为新洁尔灭消毒剂的中和剂,含5 g/L硫代硫酸钠+5 g/L卵磷脂+20 g/L吐温80的PBS溶液和含10 g/L硫代硫酸钠+30 g/L卵磷脂+20 g/L吐温80的PBS溶液84消毒剂的中和剂,设消毒剂+菌悬液、消毒剂+菌悬液+中和剂、中和剂+菌悬液、消毒剂+中和剂+菌悬液、稀释液+菌悬液(阳性对照)、稀释液+中和剂+培养基(阴性对照)6个试验组,进行中和剂的筛选,并检测不同浓度新洁尔灭(1∶15、1∶30)和84消毒剂(1∶50、1∶100)分别作用1、5、10、20 min时对2株菌的灭菌率。【结果】 PCR结果表明,成功构建了缺失株Lm90SB2ΔinlK,且inlK基因的缺失导致Lm90SB2菌株生物被膜形成能力显著或极显著下降(P<0.05;P<0.01);含3 g/L卵磷脂+3 g/L吐温80的PBS溶液构成的中和剂可有效中和新洁尔灭消毒剂,5 g/L硫代硫酸钠+5 g/L卵磷脂+20 g/L吐温80的PBS溶液可有效中和84消毒剂。不同比例的新洁尔灭(1∶15、1∶30)和84消毒剂(1∶50、1∶100)消毒剂在1、5、10 min对Lm90SB2ΔinlK株的灭菌率均显著或极显著高于Lm90SB2株(P<0.05;P<0.01),且在20 min时灭菌率均为100%。【结论】 inlK基因的缺失导致Lm90SB2菌株生物被膜形成能力下降,且对消毒剂抗力减弱。     

鸡蛋壳蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及耐药性分析

【目的】 分析不同环境下鸡蛋外壳携带蜡样芽孢杆菌的情况和分离菌株的基本特征。【方法】 从养殖场和超市各采集9种新鲜鸡蛋,对鸡蛋表面携带的蜡样芽孢杆菌进行分离鉴定、基因分型、毒力基因筛查和耐药性分析。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术对分离菌株进行初步鉴定,全基因组测序后进行菌种鉴定并确定基因分型、筛选毒力基因和耐药基因,同时采用微量肉汤稀释法测定分离株对头孢曲松、红霉素、万古霉素等12种抗菌药物的耐药性。【结果】 经MALDI-TOF MS初步鉴定和基因组菌种鉴定,确定从养殖场3种未经清洁加工的鲜蛋中分离出的6个菌株为蜡样芽孢杆菌,其序列分型（ST）较为多样,其中有2株新的ST型。在毒力基因筛查方面,6株蜡样芽孢杆菌均检出了非溶血型肠毒素nheB基因、腹泻型毒力因子hlyⅡ基因和侵袭免疫系统的inhA基因;nheA和nheC基因携带率为83.3%,编码溶血型肠毒素HBL的hblA、hblC和hblD基因携带率均为66.7%;cytK和hlyⅢ基因携带率分别为33.3%和50.0%;肠毒素基因BceT、entFM和致吐毒素基因ces均未检出。耐药性方面,6株菌均对庆大霉素、四环素、氯霉素、利福平、利奈唑胺和环丙沙星敏感,对氨苄西林、头孢曲松和泰妙菌素耐药;对红霉素、克林霉素的中介率分别为83.3%和100%;33.3%的菌株对万古霉素耐药。6株菌均携带有磷霉素耐药基因FosB和万古霉素耐药基因簇vanA的部分基因vanRSYZ,其中5株菌携带大环内酯类药物耐药基因mphL,部分菌株携带β-内酰胺类药物耐药基因或核苷类药物耐药基因。【结论】 本试验从养殖场未经消毒处理的鸡蛋外壳上成功分离到了蜡样芽孢杆菌,并发现其携带有多种毒力基因,存在多重耐药性,有潜在致病性和公共安全风险。     

鸭源大肠杆菌的分离鉴定及致病性分析

【目的】 了解江苏、江西、安徽地区鸭源大肠杆菌的分布以及致病性情况。【方法】 本研究对江苏、江西、安徽地区的病死鸭进行了鸭源大肠杆菌的分离鉴定,运用PCR结合玻片凝集法测定鸭源大肠杆菌分离株的血清型,并进行了18种毒力基因的PCR检测,随后进行雏鸭致病性试验,并对毒力较强和毒力较弱的菌株进行生长曲线以及半数致死量(LD₅₀)测定。【结果】 本研究共分离鉴定获得鸭源大肠杆菌74株,鉴定为O1、O2、O18、O78血清型的分别有1、2、2和4株,其余均未定型;18种毒力基因鉴定结果表明,ibeB、yijp、OmpA和mat基因检出率分别为97.3%、97.3%、95.95%和90.54%。动物致病性试验结果表明,经10⁷ CFU/只攻毒后,74株分离株均引起雏鸭不同程度发病,但仅有2株对雏鸭致死率≥50%。生长曲线测定结果表明,2株强毒株与2株弱毒株的生长速度无显著差异(P>0.05),2株强毒株的LD₅₀分别为10^4.75和10^7.375 CFU。【结论】 本研究分离的74株鸭源大肠杆菌O1、O2、O18和O78型仅占12.16%,毒力基因谱分布广泛,但仅有2株毒力较强,该研究为鸭源大肠杆菌病的预防控制以及研究血清型、毒力基因与致病性之间的相互关系奠定基础。