甘蔗褐锈病菌巢式PCR分子检测方法的建立

为建立甘蔗褐锈病菌巢式PCR分子检测方法,本研究利用真菌DNA内源转录间隔区通用引物ITS1/ITS4扩增甘蔗黑顶柄锈菌DNA,并对其扩增产物进行克隆测序,获得序列于NCBI网站进行比对分析,并于该序列多态性丰富区域设计了2对引物PM2F/R、PM3F/R。通过对同寄主不同病原菌、以及不同属的锈菌DNA进行PCR检测以验证引物的特异性。结果表明,在优化的单一PCR反应体系与程序条件下,2对引物均仅能从甘蔗黑顶柄锈菌中扩增出约474 bp和363 bp的特异条带,而从其它真菌DNA中均扩增不出任何条带。进一步将引物PM2F/R作为第一轮扩增引物、PM3F/R作为第二轮扩增引物进行巢式PCR扩增后,其检测灵敏度在DNA水平上可达0.001 ng/μL,较常规PCR提高100倍。由此表明,依据本研究所设计的2对引物而建立的快速、灵敏、准确的甘蔗黑顶柄锈菌的检测技术,对病原菌的早期诊断、快速检测及病害流行学研究具有重要意义。     

利用多重PCR技术快速鉴定番木瓜性别

利用鉴定番木瓜雄性性别的特异基因片段(1 001 bp)的引物和鉴定番木瓜雄性、两性性别的特异基因片段(225 bp)的引物,分别以5个品种番木瓜的3种性别植株的总DNA为模板进行多重PCR扩增,结果表明:以雄株总DNA为模板得到1个1 001 bp和1个225 bp的扩增产物,以雌株总DNA为模板没有得到扩增产物,以两性株总DNA为模板得到1个225bp的扩增产物,根据多重PCR扩增结果,可以将番木瓜3种性别植株一次性鉴定出来.     

利用RAPD-BSA法筛选亚麻耐渍基因的分子标记

本研究以耐渍型亚麻品种Y4F082和非耐渍型品种Agatha及其杂交F2代为材料,采用分离群体分组分析(Bulked Segregate Analysis,BSA)法,对亚麻耐渍基因进行RAPD分析。在500个随机引物中筛选出一个引物S1377在两亲本及抗、感基因池中均能扩增出一条大小为800bp稳定的差异条带,命名为S1377-800,通过F2代个体验证,耐渍型个体均能扩增出此差异条带而非耐渍型个体中不能扩增出此差异条带,证明S1377-800是与亚麻耐渍基因紧密连锁的RAPD标记。     

利用RAPD-BSA法筛选亚麻耐渍基因的分子标记

本研究以耐渍型亚麻品种Y4F082和非耐渍型品种Agatha及其杂交F2代为材料，采用分离群体分组分析（Bulked Segregate Analysis，BSA）法，对亚麻耐渍基因进行RAPD分析。在500个随机引物中筛选出一个引物S1377在两亲本及抗、感基因池中均能扩增出一条大小为800bp稳定的差异条带，命名为S1377—800，通过F2代个体验证，耐渍型个体均能扩增出此差异条带而非耐渍型个体中不能扩增出此差异条带，证明S1377—800是与亚麻耐渍基因紧密连锁的RAPD标记。     

黑麦通用特异性DNA探针的筛选

为了筛选出鉴定小麦背景下黑麦成分的通用特异性引物,选用胜利黑麦、八倍体小黑麦新麦73、六倍体小黑麦哈师209、普通小麦s165、中国春为试验材料,利用国内外发表的黑麦特异性DNA探针引物进行PCR扩增并进行了电泳检测.结果表明,在选用的6对引物(NOR-R1、AF1/AF4、PASW、pSC19.1、pSC20H、pSC10C)中只有4对引物即pSC20H、pSC119.1、AF1/AF4、NOR-1 R在黑麦和小黑麦DNA中扩增出了特异性条带,扩增片段大小依次为1 490、750、1 500、300 bp左右,说明这4对引物是黑麦通用特异性DNA探针引物,可以用于在小麦背景下进行黑麦外源种质的鉴定.     

南洋楹溃疡病菌巢式PCR快速检测

由可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）引致的溃疡病是目前威胁南洋楹健康生产和品质的重要病害。快速、准确检测病原菌是进行病害有效防控的基础。本研究用南洋楹溃疡病菌翻译延伸因子（EF 1-α）编码基因上保守靶基因区域的序列设计特异性引物EF-AF/AR。利用EF 1-α编码基因通用引物EF-688F/986R和特异性引物EF-AF/AR组合进行巢式PCR扩增,获得264 bp的单一条带,灵敏度检测最低限度为1 fg/μL。利用建立的巢式PCR方法对林间疑似溃疡病的病样进行检测,能够特异性地检测到L. theobromae。本研究建立的巢式PCR检测方法准确、特异且灵敏性高,可为南洋楹溃疡病的早期诊断和及时防控提供基础的理论和实践依据。     

甘蓝型油菜核不育材料Shaan-GMS不育基因的RAPD标记

以825条10碱基随机引物对甘蓝型油菜Shaan-GMS转育的杂合近等基因系220AB的可育群体和不育群体进行PCR扩增，其中632条引物共扩增出2043条带，引物BAll02在220AB的可育群体及不育群体间扩增出2条多态性条带，BAll02．500只在220AB的不育群体中出现，BAll02．1000在220AB的不育群体中缺失。进一步对单株PCR分析表明，15株不育株都扩增出了BAll02．500条带，未扩增出BAll02．1000条带，而15株可育株的扩增结果相反，说明BAll02．500是与Shaan-GMS的显性核不育基因Ms相连锁的阳性带。在恢保关系相同的双显性核不育材料6CA的F1可育和不育群体中，BAll02未获得多态性。     

番茄抗病基因Ty-3的SCAR标记及检测

[目的]通过建立与番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-3紧密连锁的SCAR标记,以提高抗病材料选育效率与准确性。[方法]设计特异引物对相关材料进行PCR扩增,获得与抗病基因Ty-3连锁的SCAR分子标记。[结果]利用该标记检测抗病纯合材料(Ty-3/Ty-3)、感病材料(ty-3/ty-3)分别产生600 bp、320 bp片段,抗病杂合材料(Ty-3/ty-3)产生600 bp与320 bp 2条片段;利用该标记对7份田间表现抗病的番茄F1代杂交种进行检测,有4份含有抗病基因Ty-3,3份未检出;选择经济性状优良、含有抗病基因Ty-3的F1代杂交种自交得到F2群体28个单株,利用该标记对单株进行检测,得到抗病纯合单株7个,抗病杂合单株13个,感病单株8个。[结论]该标记是与抗病基因Ty-3紧密连锁的共显性标记,可用于番茄抗病基因Ty-3的鉴定与抗病材料的筛选。     

甜菜DAMD引物筛选及品种快速鉴定

为了筛选适用于甜菜品种鉴定的DAMD分子标记,建立高效的甜菜品种鉴定方法,利用从文献中获得的29条DAMD引物对40个甜菜品种进行PCR扩增。结果表明:URP1F、OGRB01、URP4R、URP2R、URP6R、URP13R、URP32F、URP17R具有高多态性,8条引物总计可以扩增101条带,其中99条为多态性条带,多态性百分比为97.22%,可确定为鉴定甜菜品种的核心引物。根据扩增产物,可采用特征谱带法,单独使用引物URP6R或引物URP1F和引物URP17R共同使用鉴别40个甜菜品种。同时根据扩增产物建立0、1数据库计算出品种间遗传距离范围为0.01～0.25,在遗传距离为0.25时,可将40个甜菜品种分为2个类群。类群之下可分成多个亚群,通过遗传距离建立的聚类图也可将甜菜品种逐一鉴别。研究表明基于DAMD引物建立的高多态性指纹图谱对今后鉴别甜菜品种的真实性提供了高效快捷的方法。     

稻螟赤眼蜂rDNA特异引物设计及诊断引物在赤眼蜂分子鉴定中的应用

 根据稻螟赤眼蜂(Trichogramma japonicum)的rDNA ITS2序列,利用软件Primer Premier 5.0设计出该寄生蜂的特异引物。通过PCR条件的优化,设计的引物能稳定地扩增出稻螟赤眼蜂的特异性条带,大小为256 bp。应用设计的稻螟赤眼蜂特异引物以及报道的松毛虫赤眼蜂(T. dendrolimi)、玉米螟赤眼蜂(T. ostriniae)和螟黄赤眼蜂(T. chilonis)特异引物对赤眼蜂样品进行PCR扩增分析。结果表明,4对特异引物可从单头蜂稳定地扩增出各自蜂种的目的DNA条带,并且分子鉴定结果与形态学鉴定结果完全一致。     

应用单管巢式和半巢式PCR检测转基因玉米MON89034

根据MON89034玉米的5’端和3’端边界序列分别设计1组转化体特异性的巢式PCR引物,采用中途进退式PCR策略建立MON89034玉米的转化体特异性检测方法,扩增产物分别为491 bp和188 bp。以转基因玉米MON89034及8种其他转基因作物为材料,证明此方法对MON89034玉米具有高度特异性。灵敏度测试结果表明,此方法的相对检出限达到0.01%,绝对检出限为4个单倍体基因组拷贝数,比普通PCR提高了5倍。建立的单管巢式和半巢式PCR方法可准确、高效地检测转基因玉米MON89034及其产品。     

橡胶丛枝病分子检测研究

感染橡胶丛枝病的长春花（菟丝子桥接），通过提取其总DNA，以植原体（phytoplasma）特异引物，进行PCR扩增，结果得到860bp的DNA片断，片断的大小与设计的相符。而健康长春花扩增得不到此片断。同样，将感染丛枝病的橡胶树总DNA，进行PCR扩增，结果与上述相同。该860bp片断经地高辛标记，核酸杂交结果显示，感染丛枝病的橡胶树阳性反应强烈，健康橡胶树仅有微弱反应。     

基于SSR标记的橡胶树无性系鉴定方法的建立

从88对橡胶树SSR引物中筛选出5对产物清晰、扩增稳定的引物.采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合快速银染检测的方法,构建了87份橡胶树的DNA指纹图谱.5对引物共扩增出16条带,平均每对引物可扩增出3.2条带,多态性条带为15条,扩增条带分布在148～342 bp,无性系之间只存在1～2个片段差异,说明遗传差异小;根据建立的无性系数字指纹图谱,能逐一区分65个无性系,表明应用SSR分子标记技术进行橡胶树无性系的鉴定是可行的.     

拟南芥春化基因vrn2的克隆及相关分析

进行了拟南芥春化基因vrn2(Vernalization2)在拟南芥和唐菖蒲基因组DNA分子上的定位研究。以拟南芥(Arabidopsis thaliana L．)为材料，根据已报道的vrn2基因序列，设计并合成一对特异引物，通过PCR方法扩增出全长3154bp的特异片段。Southern杂交结果表明，在拟南芥基因组中，用HindⅢ酶切消化的DNA在约9．0Kb处有一条杂交带，用BamHI酶切消化的DNA在约2．5Kb处有杂交信号，在唐菖蒲基因组中，用HindⅢ酶切消化的DNA在约2．7Kb处有杂交信号出现。杂交结果说明vrn2在拟南芥基因组中是单拷贝基因，在唐菖蒲基因组中也含有此基因或是具有与vrn2同源的序列。     

爱玉子性别与品系的SRAP分析

爱玉子雌、雄异株,其性别以及品系在结果前难以通过枝叶等形态特征进行辨别.作者将序列相关扩增多态性(SRAP)标记应用于爱玉子性别及品系鉴别研究,建立了完整的PCR反应体系,扩增效果好,结果稳定可靠,可重复性强.在153对SRAP引物中,只有引物me_5-em_4在爱玉子雌株上扩增出约220 bp的特异条带,将其命名为FA me_5-em_(14)-220,该标记与雄株没有关联,可作为爱玉子性别鉴别的SRAP标记.从153对引物中筛选出8对多态性好、分辨率高的引物组合,在24个爱玉子雌性品系和16个雄性品系的DNA样品中扩增出171条多态性带,并获得爱玉子雌、雄各品系独特的核酸指纹,其中em_6-me_6引物与me_3-em_2、me_1-em_8、me_2-em_9中的任何一对引物进行组合,都能鉴别24个爱玉子雌性品系;me_3-em_2与me_9-em_(14)2对引物组合也能鉴别24个爱玉子雌性品系;me_1-em_8单独一对引物,以及me_1-em_9与me_3-em_2(或me_6-em_6)2对引物组合能鉴别16个爱玉子雄性品系,并获得2个雄性品系的特异性片段,即片段me_1-em_8-350 bp为大洋57特有,me_1-em_8-240bp为大洋241特有.研究结果对爱玉子种质资源遗传多样性的分析、品种和品系的鉴定、以及种苗质量仲裁检验等具有重要的理论意义和实践价值.     

甘蓝型油菜杂交种亲本指纹图谱分析

用140个随机引物对39份甘蓝型双低油菜杂交种亲本进行RAPD分析，选出40个能产生清晰多态性主带的引物重复扩增，以筛选出的9个引的扩增出重复性好的多态性主带构建39份亲本材料的DNA指纹图谱。结果表明，DNA指纹图谱可将27份亲本材料一一区分，其余12份材料可合并为4组，组内材料均为来源相同的姊妹系。指纹图谱鉴定结果与材料实际来源相吻合。     

香蕉ACC合成酶含3''''末端的cDNA克隆

采用 ３＇ＲＡＣＥ方法对香蕉（Ｍｕｓａ ＡＡＡ Ｃａｖｅｎｄｉｓｈ Ｓｕｂｇｒｏｕｐ）ＡＣＣ合成酸含 ３＇末端的 ｃＤＮＡ进行扩增，扩增产物被克隆到ｐＣＲ■２．１载体上，转化大肠杆菌ＤＨ５ α，筛选到重组质粒（ｐＡＣＳ２），并对插入片段进行序列测定。结果表明，３＇ＲＡＣＥ产物长 １６８０ ｂｐ，其中一个 开放读框内的核苷酸序列编码４４４个氨基酸，氨基酸序列包括了ＡＣＣ合成酶中所应具有的７个高度保守区。同时该产物还有长２６９ ｂｐ的３＇末端，并具有完整的 Ｐｏｌｙ（Ａ）尾（２４ｍｅｒ）。     

甜椒脉斑驳病毒（PVMV）在海南的发现与检测

2014年在海南辣椒病毒病调查过程中发现了一种疑似病毒感染的辣椒样品,主要表现为叶片黄化、绿斑驳、叶脆易折断,且在田间发生较多。利用马铃薯Y病毒属的简并引物对其叶片总RNA进行RT-PCR检测,并将约1 700 bp目的片段克隆到pMD18-T载体上进行测序和BLAST分析。结果表明：该条带序列（包含部分NIb和部分cp基因）与已收录的甜椒脉斑驳病毒（Pepper veinal mottle virus,PVMV）（GenBank登录号：FM202327）序列相似性最高,达99％。设计cp基因的特异引物,对上述样品进行cp基因扩增并构建以cp基因序列为基础的系统进化树,发现海南辣椒上的PVMV与台湾的PVMV分离物ns1株同源性最高。田间检测结果表明：海南黄灯笼辣椒上PVMV的检出率高达74.07％,说明PVMV可能成为海南辣椒生产上的潜在威胁。     

康乃馨ACC氧化酶cDNA的克隆及其序列分析

以康乃馨(DianthuscaryophyllusL.)花瓣为材料,用改进的异硫氰酸胍一步法提取总RNA,根据已报道的康乃馨ACC氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylicacidoxidase,ACO)基因的序列设计并合成一对引物,通过RT-PCR方法获得一约1.2kb特异片段,把该片段连接到PGEM-Teasyvector上进行测序,其全长共1156bp,编码区915bp,共编码304个氨基酸残基。序列分析结果表明该序列与国外SavinKw报道的康乃馨ACC氧化酶基因的cDNA序列完全相符。推断该基因在康乃馨种内可能是完全或高度保守的。