水稻植株再生与农杆菌介导的遗传转化研究

本研究以不同籼稻品种的成熟胚为材料，研究了不同培养基对愈伤组织诱导、分化和植株再生的影响，并研究了利用农杆菌介导bar基因和ipt基因的遗传转化技术。结果表明，采用NBD(N6salts B5Vitamin casamino acids 500mg／L proline 500mg／L glutamine 300mg／L mannitol 36．4g／L sucrose 30g／L 2，4-D 2mg／L 6-BA 0．2mg／L phytagel 2．5g／L，pH 5．8)为诱导培养基，MSD(MS casamino acids 500mg／L proline 500mg／L glutamine 300mg／L mannitol 36．4g／L sucrose 30g/L 2，4-D 2mg／L 6-BA 0．2mg／L phytagel 2．5g／L，pH 5．8)与NBD培养基交替继代培养，籼稻愈伤组织诱导率高、质量较好；采用MSR3^e(MS casamino acids 500mg／L glutamine 300mg／L proline 500mg／L mannitol 36．4g／L maltose 30g／L TDZ 0．2mg／L phytagel 5g／L pH 5．8)为分化培养基，愈伤组织分化率均在90％以上。本研究利用农杆菌介导，将Act启动子驱动的抗除草剂基因(bar)和异戊烯基转移酶基因(ipt)构建的融合基因表达载体对水稻进行遗传转化。初步确定了愈伤组织筛选及分化培养基附加除草剂(glufosinate ammoniun)4mg／L、头孢霉素300mg／L，愈伤组织预培养2-3天，共培养基中加入乙酰丁香酮浓度为39mg／L，共培养2-3天。通过上述培养条件，已获得移栽成活的水稻转基因植株。     

小对叶植株再生及遗传转化体系构建

为了利用生物技术方法开发及改良水生植物小对叶,以小对叶（Bacopa monnieri）叶片为外植体,建立其组织培养再生体系及根癌农杆菌介导的遗传转化体系。结果表明：小对叶叶盘最佳愈伤组织诱导培养基是MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.02 mg/L;最佳分化培养基是MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L;最佳生根培养基是1/2MS+IBA 0.1 mg/L。最佳的根癌农杆菌介导的小对叶遗传转化条件是：外植体预培养2天,侵染菌液OD600为0.5,侵染时间7 min、共培养4天和延迟筛选4天,可获得最高转化率21.4%。     

西瓜‘SM1’高效遗传转化体系的构建

为构建高效的西瓜再生和遗传转化体系,本研究以西瓜‘SM1’材料子叶节为外植体,研究不同激素配比对子叶节再生的影响。在此基础上,通过农杆菌介导法导入外源基因,研究潮霉素浓度、农杆菌侵染时间、共培养时间等因素对遗传转化效率的影响,建立遗传转化体系。结果表明,‘SM1’不定芽分化最佳培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L,不定芽分化率为91.7%。最优遗传转化组合为农杆菌侵染时间15 min,共培养3 d,之后进行选择培养。外植体不定芽分化潮霉素最适浓度为10 mg/L,最适生根培养基为1/2MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.01 mg/L。通过潮霉素筛选和PCR鉴定,获得12株阳性转化株系,转化率为6.5%。本研究建立了高效西瓜‘SM1’再生及遗传转化体系,为进一步开展基因功能研究及西瓜遗传改良提供了技术支撑。     

农杆菌介导的ICE1基因转化番茄的研究

以番茄品种组培大黄为试验材料,通过农杆菌介导法,将来自拟南芥的抗寒基因ICE1导入番茄,并对影响遗传转化的因素进行了优化。结果表明,高效稳定的遗传转化体系培养基为MS+6-BA2.0mg/L+IAA0.2mg/L;子叶预培养2d,农杆菌菌液浓度OD600=0.4,侵染10min,共培养36h,抑菌抗生素300mg/L。获得抗性植株5株,PCR扩增和RT-PCR检测表明有3株阳性植株,转化率为60%,初步表明ICE1基因已导入到番茄中。     

根癌农杆菌介导的番茄高效遗传转化体系的研究

以番茄无菌苗的子叶和下胚轴为外植体,通过农杆菌介导法,对其遗传转化条件进行了优化,建立了高效番茄子叶和下胚轴农杆菌介导的遗传转化体系.结果表明:在农杆菌浸染前(浸染浓度为OD600=0.3)进行2 d的预培养浸染6 min的外植体在MS+2.0 mg/L6-BA+0.5 mg/L IAA的培养基上转化效率最高.PCR检测初步证明,NPTII基因已整合到番茄再生植株中.     

农杆菌介导的高羊茅遗传转化体系的优化

以高羊茅品种猎狗5号的胚性愈伤组织作为受体材料,通过gus基因瞬时表达检测,探讨预培养培养基、预培养时间、菌液浓度、感染时间、乙酰丁香酮浓度、共培养条件等不同因素对农杆菌介导转化的影响,结果表明,高羊茅品种猎狗5号遗传转化优化条件为胚性愈伤组织先在预培养培养基(MS 6-BA0．5mg／L NAA0．5mg／L)预培养5d;然后用农杆菌菌液(OD600=0．5),感染时间10-20min,在23-25℃的温度下,共培养基(MS 蔗糖30g／L 葡萄糖10g／L CA0．5g／L Glu0．5g／L 2,4-D1．5mg／L AS 150μmol／L agar 8g／L,pH5．2～5．6)上共培养3d。在共培养基中添加AS 150μmol／L有助于提高gus基因瞬时表达率。     

根癌农杆菌介导番茄‘白果强丰’遗传转化体系优化

以番茄无菌苗的子叶为外植体,通过农杆菌介导法对其遗传转化体系进行了优化,结果表明：外植体在MS+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA的进行2天的预培养后,用农杆菌EHA105（浸染浓度为OD600=0.6）浸染6 min,转化效率最高,经过PCR检测初步证明NPTII基因已整合到番茄再生植株中,本研究建立了高效番茄‘白果强丰’子叶农杆菌介导的遗传转化体系。     

辣椒农杆菌介导转化体系的建立及外源基因的转化

辣椒农杆菌介导转化体系主要包括无菌苗制备、菌株培养、农杆菌介导转化、芽诱导、芽伸长、生根及移栽等6个步骤。芽诱导培养基以MS 4．0—6．0mg/L 6—BA 0．5mg/L NAA 2．0mg/L AgNO3较好，诱芽分化率因品种不同而异，高的可达70％以上，子叶的分化率明显高于下胚轴；诱芽伸长培养基以MS 3．0mg/L 6—BA 0．3mg/L NAA 1．0mg/L GA3较好，伸长率达40％；生根培养基以1/2MS 0．3mg/L NAA(或0．5mg/L LAA)较好，平均生根率达65％。经过对3个品种的抗虫基因转化研究，均获得了转抗虫基因再生株。     

百脉根高频再生体系的建立及兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因的转化

以MS为基本培养基,通过调整激素种类与浓度等培养条件,按正交试验设计的原则,建立了百脉根高频再生体系.结果表明MS 2,4-D 2.0 mg/L KT 2.0 mg/L 培养基可高效诱导愈伤组织的形成,MS 6-BA 1.0 mg/L NAA 0.1 mg/L 培养基可高效诱导芽的分化,MS NAA 0.1 mg/L 培养基可快速诱导根的生成,形成再生植株.通过构建植物表达载体VP60-pBI121,研究了根癌农杆菌介导的兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60基因对百脉根遗传转化的影响因素,建立了百脉根快速高效遗传转化体系,结果表明,以农杆菌LBA4404为介导菌株、以下胚轴为外植体,预培养3 d,在OD600为0.6的菌夜中浸染20 min,共培养3 d,以及300 mg/L 羧苄青霉素脱菌浓度和50 mg/L 卡那霉素筛选浓度为最佳转化条件.为利用百脉根生产动物口服型疫苗建立了技术基础.     

苜蓿愈伤组织高频再生遗传和转化体系的建立

本研究以MS为基本培养基,在不同浓度的2,4-D与6-BA联合使用的诱导培养基上,以苜蓿子叶为外植体,诱导愈伤组织,诱导率为55%～90.6%,其中2mg/L2,4-D 1mg/L6-BA诱导率最高,达90.6%;浅黄色至淡绿色的愈伤组织在MS 2mg/LKT 0.15mg/L6-BA 0.3mg/LNAA分化培养基的分化率最高并且植株颜色深绿。丛生芽在1/2MS 2mg/L酵母提取物的生根培养基上再生成完整的苜蓿植株。以建立的苜蓿高频再生体系为基础,愈伤组织为转化的受体,用根癌农杆菌介导苜蓿,利用GUS组织化学染色法,研究影响遗传转化的若干因素,获得了100株转基因植株。乙酰丁香酮的浓度为100!mol/L,菌液浓度OD600为0.3～0.5,最佳的侵染时间为15min,共培养时间为4d,卡那霉素浓度为50mg/L时转化频率最合适。最高转化频率可达80%,Kana抗性植株Northernblotting检测表明,目的基因已整合进苜蓿基因组中。建立了苜蓿快速有效的遗传转化体系,为获得其它基因转化苜蓿,奠定基础。     

务川几种野生百合的组织培养

采用正交试验的方法,在MS固体培养基上研究不同浓度蔗糖、6-BA及NAA对淡黄花百合、文山百合及野百合等3种务川野生百合芽增殖的影响,结果表明:淡黄花百合芽增殖的最佳培养基应为:MS +0.5 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA+4％蔗糖,文山百合的最佳培养基应为:MS +0.5～1.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA +3％蔗糖;野百合芽增殖的最佳培养基应为:MS+ 0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+(2％ ～3％)蔗糖.     

青岛百合组织培养研究

以青岛百合叶片为外植体,研究了消毒时间、培养基、生长调节物质对青岛百合叶片不定芽发生、增殖和生根的影响。结果表明：用0.1%氯化汞对青岛百合叶片消毒5 min时效果最好,污染率为31%,萌动率为79%,诱导率为65.2%。青岛百合最佳叶片不定芽分化培养基为MS+6-BA2.0 mg/L+NAA 0.2mg/L;最佳不定芽增殖培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2mg/L;最佳生根的培养基为1/2MS+NAA 0.2 mg/L,形成了较为完善的组织培养再生体系。     

诱导百合鳞片芽的影响因子研究

采用正交试验的方法,在MS固体培养基上研究鳞片位置和不同浓度蔗糖、6-BA(6-苄基腺嘌呤)及NAA(α-奈乙酸)对诱导淡黄花百合不定芽的影响.结果表明:最佳外植体为中层鳞片,最佳培养基为MS 0.5mg/L 6-BA 0.5mg/L～1 mg/L NAA 3%～5%蔗糖.     

农杆菌介导柱型苹果“鲁加6号”遗传转化体系的建立

本研究以柱型苹果"鲁加6号"试管苗叶片外植体为转化材料,以卡那霉素抗性基凶为选择标记,建立了根癌农杆菌介导的柱型苹果"鲁加6号"苹果的遗传转化体系.研究结果表明:在MS+6-BA 4.0mg,/L+NAA 0.05 mg/L培养基上,叶片不定芽分化阶段Km的选择压力为20 mg/L,不定芽生根阶段Km的选择压力为15 mg/L,脱菌培养阶段头孢霉素的适宜浓度为300 mg/L.在农杆菌介导的遗传转化过程中,外植体经过36 h预培养,侵染10 min,共培养48 h时,有利于提高遗传转化效率,获得的抗性愈伤组织和抗性芽数均最高.获得的Km抗性植株经PCR检测,扩增出特异条带,初步证明目的基因已整合到苹果基因组DNA中.     

碗莲组培快繁技术初探

以碗莲‘案头春’茎尖为实验材料,对诱导培养基成份、培养基状态、最佳取材时期以及增殖培养基筛选等方面进行了研究。结果表明：最佳取材季节为10~12月份;碗莲茎尖分化最适宜培养基为MS + 1.0 mg/L 6-BA +0.25 mg/L NAA +1.0 mg/LGA3;适宜的增殖培养基为MS +2.0 mg/L 6-BA +0.25 mg/L NAA;固液培养状态：上层为5mm厚的MS + 1.0 mg/L 6-BA + 0.25 mg/L NAA + 1.0 mg/L GA3液态培养基,下层为1cm厚的MS + 1.0 mg/L 6-BA +0.25 mg/L NAA + 1.0 mg/L GA3固态培养基,更有利于芽诱导;培养过程中污染的芽苗用75%酒精1min、0.1%HgCl210min灭菌效果最好。     

栎叶绣球‘雪花’再生体系的建立

为获得大量栎叶绣球的无菌苗,本研究以栎叶绣球‘雪花’(Hydrangea quercifolia’Snow Flake’)的叶片为试验材料,通过不同浓度的激素组合处理。结果表明,最适宜的愈伤组织诱导培养基为:MS+1.5 mg/L6-BA+0.2 mg/L NAA,出愈率约为80.7%;最适宜的不定芽分化培养基为:MS+2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA,诱导率约为90.3%;最佳的增殖培养基为:MS+2.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA,增殖率约为5.2;最佳的壮苗培养基为:MS+0.5 mg/L 6-BA+0.15/0.2 mg/L IBA,幼苗平均高度约为4.57 cm;最佳的生根培养基为:1/2 MS+0.4 mg/L IBA,平均生根率约为88.3%,平均根长约为6.5 cm。本研究初步建立了栎叶绣球‘雪花’的再生体系,为其扩大繁殖和之后的遗传转化研究提供了帮助。     

金鱼藤的组织培养和快速繁殖体系的建立

以金鱼藤(Asarina procumbens)叶柄为外植体,MS为基础培养基,进行组织培养和快速繁殖,研究不同浓度的植物生长调节剂对金鱼藤快繁体系建立的影响,建立了金鱼藤无性繁殖体系。结果表明,金鱼藤愈伤诱导的最佳培养基为MS+2.0mg/L6-BA+1.0mg/L NAA;不定芽分化最佳培养基为MS+1.5mg/L6-BA+(0.3~0.5)mg/LNAA+0.3mg/L KT;丛生芽诱导的最适培养基为MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/L NAA,最佳生根培养基为MS培养基。     

降香黄檀愈伤组织培养与植株再生研究

为了实现降香黄檀工厂化快速繁殖和扩大栽培,并为降香黄檀抗寒基因导入打下一定的基础,以降香黄檀无菌实生苗茎段、叶片、根尖为外植体,MS为基本培养基,对各器官愈伤组织诱导与分化的最适培养基成分进行了研究。结果表明,可从降香黄檀无菌实生苗茎段、叶片、根尖成功地进行愈伤组织培养和植株再生。茎段、叶片、根尖诱导愈伤组织的最适培养基分别为1/2MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.10 mg/L、1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.10 mg/L和1/4MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L;茎段、叶片、根尖的愈伤组织诱导丛生芽最适培养基分别为1/2MS+6-BA 1.5 mg/L+2,4-D 4.0 mg/L、1/2MS+6-BA 1.5 mg/L+2,4-D 3.5 mg/L和1/2MS+6-BA 1.5 mg/L+2,4-D 3.5 mg/L;茎段、叶片、根尖来源的单芽,其最佳生根培养基分别为MS+NAA 1.5 mg/L、MS+NAA 1.0 mg/L和MS+NAA 2.0 mg/L。比较茎段、叶片与根尖的愈伤组织诱导率、丛生芽诱导率和单芽生根率,得出以无菌实生苗根尖作为外植体是降香黄檀愈伤组织培养和植株再生的最佳选择。