莲草直胸跳甲小分子热激蛋白sHsp20.8基因的克隆及生物信息学分析

[目的]小分子热激蛋白基因对昆虫的生长发育和抵御环境胁迫具有重要作用,本研究在PacBio SMRT测序的基础上,进一步克隆鉴定莲草直胸跳甲(Agasicles hygrophila)小分子热激蛋白sHsp20.8基因并进行生物信息学分析。[方法]采用RT-PCR技术克隆鉴定了莲草直胸跳甲sHsp20.8基因的完整CDS;利用各种生物信息学方法对该热激蛋白的理化性质、保守结构域、亲水/疏水性、信号肽、亚细胞定位、跨膜区进行分析,并进行了二、三级结构的预测和系统发育分析。[结果]莲草直胸跳甲sHsp20.8基因完整CDS为543bp,编码180个氨基酸,分子量为20.8kDa,等电点为6.45。编码蛋白含有小分子热激蛋白保守结构域和特征基序,不含跨膜区和信号肽,定位于细胞核。系统发育分析表明小分子热激蛋白基因可以作为昆虫系统进化分析的标志基因。[结论]获得的sHsp20.8基因是sHsps家族成员,结果将为深入研究小分子热激蛋白的功能奠定理论基础。     

莲草直胸跳甲跗节对寄主选择及产卵的影响

[目的]昆虫的嗅觉感器主要分布在触角和跗节上,对昆虫的寄主定位及产卵有重要作用。为了解专食性昆虫莲草直胸跳甲Agasicles hygrophila寄主识别机制和昆虫跗节作用,本文研究了莲草直胸跳甲跗节对其寄主植物的选择及产卵的影响。[方法]利用Y-型嗅觉仪测定切除触角、切除触角+前足跗节、切除触角+中足跗节、切除触角+后足跗节和切除触角+前中后全部跗节5种处理莲草直胸跳甲对健康植物、机械损伤植物和虫害损伤植物的趋性行为,并观察其产卵情况。[结果]不同切除处理的莲草直胸跳甲对3种状态的寄主植物选择数目趋势为:切除触角切除触角+前足跗节切除触角+中足跗节≈切除触角+后足跗节切除触角+全部跗节;不同切除处理的莲草直胸跳甲总落卵量及在寄主植物上的落卵量排序为:切除触角切除触角+中足跗节切除触角+前足跗节切除触角+后足跗节切除触角+全部跗节。其中,只切除触角的跳甲总落卵量最高,为1 397. 83粒,切除触角和中足跗节(1 000. 00粒)次之,切除触角和全部跗节的跳甲最低,为353. 17粒。[结论]在莲草直胸跳甲的3对足跗节中,中后足跗节对莲草直胸跳甲的趋性作用影响最大,后足跗节对莲草直胸跳甲的产卵影响最大。     

莲草直胸跳甲茎外化蛹条件的优化

[目的]优化莲草直胸跳甲茎外化蛹条件,为发挥莲草直胸跳甲在防治喜旱莲子草中的控制效能提供参考。[方法]通过调查化蛹率和羽化率对莲草直胸跳甲的茎外化蛹基质(湿润砂壤土、花泥、琼脂)进行了筛选。[结果]莲草直胸跳甲在花泥上的化蛹率和羽化率与茎秆无显著差异,但均高于砂壤土和琼脂等基质,表明花泥可作为该虫的适宜的茎外化蛹基质;以花泥作为化蛹基质,密度在30~40头/盒(约2 700 cm3)可保证较高的化蛹率和羽化率。[结论]研究结果为莲草直胸跳甲人工饲养的条件优化提供了新思路。     

莲草直胸跳甲OBP51的克隆及表达分析

莲草直胸跳甲在防治入侵性杂草喜旱莲子草中发挥重要作用。莲草直胸跳甲主要通过气味寻找宿主植物;气味结合蛋白是昆虫气味反应的第一步。研究克隆得到莲草直胸跳甲OBP51的全长序列,进行生物信息学分析,并分析其在不同组织中的相对表达量。结果表明,OBP51的c DNA全长为489 bp,ORF为411 bp,编码136个氨基酸,具有18个氨基酸残基的信号肽;AhygOBP51编码的成熟蛋白为脂溶性蛋白,主要为α-螺旋结构,占68.6%,无规则卷曲占28.8%。定量PCR分析表明,其在触角、后足中高表达,且雄虫后足高于雌虫后足,提示AhygOBP51在触角和后足气味识别过程中发挥重要作用。     

莲草直胸跳甲对多种植物取食及产卵研究

[目的]为减少经济损失,全面生物防治喜旱莲子草。[方法]本文在室外非选择条件下研究了莲草直胸跳甲对12种植物的取食和产卵行为。[结果]非选择条件下,莲草直胸跳甲在靶标植物喜旱莲子草上取食和产卵最多;其次,非靶标植物取食量为莲子草甜菜莙荙。除了以上植物,莲草直胸跳甲成虫还会取食极少量黄瓜、苋菜和豇豆。莲草直胸跳甲在非靶标植物莲子草上产卵最多,其次是甜菜,在莙荙、豇豆上无产卵现象,而在其他植物上产卵较少,差异显著(P0.05)。[结论]综合分析认为:莲草直胸跳甲是安全的,这为大面积生物防治喜旱莲子草提供了理论依据。     

莲草直胸跳甲Hsp70蛋白的生物信息学分析

根据莲草直胸跳甲Hsp70基因的EST序列,利用电子克隆的方法获得莲草直胸跳甲Hsp70基因,通过生物信息学方法对该基因编码蛋白进行了保守结构域、疏水/亲水性、亚细胞定位、信号肽等理化性质和分子特性分析。结果表明,莲草直胸跳甲Hsp70基因全长2 216 bp,完整读码框1 899 bp,编码632个氨基酸残基,分子量为69.45 k Da,等电点为6.00;编码蛋白含有Hsp70的完整保守结构域和典型签名序列;具有的典型细胞质基序和亚细胞定位分别表明Hsp70位于细胞质中。研究结果可为深入研究该基因的生物学功能奠定基础。     

空心莲子草叶片特征及生长期对莲草直胸跳甲产卵选择的影响

[目的]明确空心莲子草叶片特征及生长期对莲草直胸跳甲产卵选择的影响,为莲草直胸跳甲的大量繁殖及空心莲子草的生物防治提供指导.[方法]采用选择性试验,接虫后24 h测定莲草直胸跳甲对空心莲子草的叶位、叶片性状(长宽比和表皮毛密度)的产卵选择情况;采用笼罩试验,测定空心莲子草生长期(苗期、生长期和老叶期)以及原有落卵量(0、1、2和4块/株)对莲草直胸跳甲产卵选择的影响.[结果]莲草直胸跳甲成虫喜好产卵在叶位3和叶位4上,在叶位3和叶位4上的卵块数和卵粒数分别占总数的81.52%和81.10%,显著高于叶位1和叶位2(P<0.05,下同),且这2个叶位的平均叶片长宽比显著大于叶位1和叶位2;偏好在叶背表皮毛密度适中的叶片产卵.莲草直胸跳甲对空心莲子草叶片背面(95.65%)和靠近叶片端部(61.96%)位置的产卵选择率显著高于叶片正面(4.35%)和叶片基部(38.04%)位置.莲草直胸跳甲对生长期植株和未被产卵的空心莲子草叶片的产卵选择率分别为55.09%和45.26%,显著高于其他处理.[结论]莲草直胸跳甲喜好将卵产在叶片长宽比较大的空心莲子草的叶位3和叶位4,被产卵叶片表皮毛密度适中;莲草直胸跳甲对空心莲子草叶片背面和靠近叶片端部的位置产卵选择率高,且偏好在生长期植株和未被产卵的空心莲子草叶片上产卵.     

高CO_2浓度对莲草直胸跳甲幼虫取食量及其体内生化物质的影响

在实验室条件下,分别测定了高CO2浓度(750μL·L-1)和对照CO2浓度(370μL·L-1)2个不同CO2浓度下莲草直胸跳甲幼虫取食量的变化,比较3龄幼虫体内营养物质含量和消化酶活性等指标的变化。结果表明,高CO2浓度处理下,莲草直胸跳甲幼虫取食量显著增加;3龄幼虫体内蛋白含量较对照CO2浓度处理幼虫的蛋白显著增加,总氨基酸含量差异不显著;莲草直胸跳甲3龄幼虫体内消化酶(淀粉酶和胃蛋白酶)的酶活力显著降低。高CO2浓度影响莲草直胸跳甲幼虫的取食量、营养物质含量和消化酶活性,对其生长发育有一定的影响。     

莲草直胸跳甲Halloween基因家族鉴定及表达分析

【背景】 莲草直胸跳甲（Agasicles hygrophila）是世界恶性入侵杂草空心莲子草（Alternanthera philoxeroides）的专一性生防天敌;莲草直胸跳甲种群动态呈季节性波动趋势,在我国湖南地区其夏季种群数量骤减,导致对空心莲子草的防控效果大大降低。而Halloween基因家族参与昆虫蜕皮激素的合成,影响昆虫生长和繁殖,进而对昆虫种群动态具有一定影响。【目的】 揭示Halloween基因家族在莲草直胸跳甲不同发育时期和不同组织中的表达模式,为进一步探究Halloween基因家族在莲草直胸跳甲中的功能打下基础,进而为生防天敌的扩繁提供新思路。【方法】 通过筛选莲草直胸跳甲卵巢转录组数据并结合生物信息学分析,找到并克隆其体内Halloween基因家族成员;使用NCBI在线分析其保守结构域,利用MEGA6.0对Halloween家族基因进行多序列比对并构建系统发育树;通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测各基因在莲草直胸跳甲不同发育时期（卵、幼虫、蛹、雌成虫）和雌成虫不同组织（头、胸、中肠、卵巢、脂肪体）中的表达水平。【结果】 莲草直胸跳甲中存在6个Halloween基因家族成员,分别为AhCYP302A1、AhCYP306A1、AhCYP307A1、AhCYP307A2、AhCYP314A1和AhCYP315A1;分析发现其均属于P450超家族且具有一定保守性,其中AhCYP306A1、AhCYP307A1、AhCYP307A2聚为一支,属于P450超家族中CYP2集团,AhCYP302A1、AhCYP314A1、AhCYP315A1聚为一支,属于线粒体集团;同时,AhCYP306A1、AhCYP314A1、AhCYP315A1在5′端存在跨膜区域。6个Halloween基因在莲草直胸跳甲整个生活史及各个组织中均有不同程度的表达。其中,AhCYP302A1在蛹期第6、7天表达量最高,成虫期表达量整体较低;AhCYP306A1在整个生活史中波动表达,以幼虫期第10天表达量最高;AhCYP307A2在末龄幼虫和化蛹初期的表达量较高;以上3个基因在幼虫期和蛹期的表达量较高。AhCYP307A1在卵期高表达,此后各个时期呈波动下降;AhCYP314A1、AhCYP315A1在成虫期和卵期的表达量相对高于其他两个时期。在头、胸、中肠、卵巢、脂肪体5种组织中,除AhCYP307A1外,Halloween家族其他基因在卵巢中表达量均较高;AhCYP307A1在雌成虫头部显著性高表达。【结论】 克隆并鉴定得到6个莲草直胸跳甲Halloween基因家族成员,其在不同发育时期及不同组织中的表达具有一定差异。通过其表达模式推测Halloween基因家族在莲草直胸跳甲幼虫发育及成虫繁殖过程中可能发挥重要作用,对其幼虫蜕皮与成虫卵巢发育均有一定影响。     

莲草直胸跳甲不同发育阶段内参基因的筛选与验证

[目的]实时定量PCR(qPCR)是基因表达研究的重要技术手段,但其结果的准确性取决于内参基因,本研究筛选莲草直胸跳甲不同发育阶段稳定表达的内参基因,为后续基因表达研究奠定基础。[方法]使用qPCR测定了9个昆虫常见的候选内参基因(β-actin、RPL13a、RPS18、UBC、EF-1α、RPS6、GAPDH、α-Tubulin和β-Tubulin)在莲草直胸跳甲不同发育阶段的表达,利用ΔCt、geNorm、NormFinder和BestKeeper 4种程序综合评估了9个内参基因的表达稳定性,并用小分子热激蛋白基因(shsp20. 8)对内参基因的稳定性进行了验证。[结果]莲草直胸跳甲不同发育阶段的最适内参基因为RPS18和RPL13a,shsp20. 8在使用最稳定和最不稳定的内参基因用于数据标准化时,结果差异显著,表达量最高的虫态分别为卵和蛹期。[结论]本文证实了稳定的内参基因对qPCR试验结果准确性至关重要。