桃EXPANSIN基因家族序列特征及其在根结线虫侵染后的诱导表达分析

【目的】探索扩张蛋白(EXPANSIN)基因家族在桃抗南方根结线虫过程中的作用。【方法】首先对桃基因组中的EXPANSIN基因家族进行生物信息学分析,然后利用转录组测序对EXPANSIN基因在南方根结线虫侵染免疫型(‘红根甘肃桃1号’)和高感型(‘贝蕾’)桃种质根系后的不同时期的表达丰度进行分析。【结果】桃EXPANSIN基因家族有27个成员,这些成员分布在8条染色体上,以第2和第5号染色体上最多,均为5个。基因结构分析显示,这些基因包含1~5个外显子,大部分EXPANSIN基因包含DPBB_1和Pollen_allerg_1保守结构域,聚类分析将这27个成员分为2大类,其中有8个与拟南芥中已注释的与线虫侵染过程中巨细胞形成有关的蛋白质聚在一起,均属于EXPA亚类。转录组分析表明,这8个EXPANSIN基因在对南方根结线虫免疫和高感2种种质不同时期的表达趋势存在明显差异,其中ppa010314m、ppa010226m在‘贝蕾’中表达量随侵染上调,而在‘红根甘肃桃1号’中上调不明显,这2个基因可能是参与南方根结线虫侵染过程中巨细胞形成的关键基因。【结论】桃EXPANSIN家族成员在结构上高度保守,其中多个成员可能参与调控桃抗南方根结线虫过程。     

‘粉寿星’对桃绿蚜抗性的遗传分析

【目的】桃绿蚜(即桃蚜)是影响桃树早春生长的主要害虫,发掘桃抗蚜资源,阐明其遗传规律,促进抗性品种培育,是应对蚜虫危害的重要途径。【方法】利用‘粉寿星’(Prunus persica var.densa)为亲本材料,构建了6代遗传群体,对‘粉寿星’抗蚜性的遗传及其稳定性进行了分析。【结果】在抗蚜性分离群体中,抗性呈不连续分布,且具有较明显的双峰特征,抗性单株(RR或Rr)与敏感单株(rr)杂交,出现1∶0或1∶1的抗/感分离比例,抗性单株与抗性单株杂交(RR×R_或Rr×Rr)出现1∶0或3∶1的抗/感分离比例,感病单株之间杂交不出现抗性单株,抗性遗传6代未发现明显变化;连锁遗传分析表明,‘粉寿星’的抗蚜性与矮生性状没有连锁关系,与果肉黄/白色位点较近,遗传距离约为27.5 c M。【结论】‘粉寿星’对桃绿蚜的抗性为单基因控制显性遗传,并与果肉黄/白色位于同一连锁群,与矮生性状无连锁关系。本研究结果为抗蚜桃育种及其他相关研究奠定了基础。     

梨CRK家族基因及其腐烂病菌侵染响应成员的鉴定

在植物响应逆境过程中，半胱氨酸富集类受体激酶（Cysteine-rich receptor like kinase，CRK）起重要的调控作用。本研究中以结构域Stress-antifung（Pfam：PF01657）和Pkinase（Pfam：PF00069）的保守序列为种子序列，在全基因组范围鉴定了梨（Pryus spp.）CRK家族成员。此外，对其蛋白理化性质、进化特征、基因在染色体上的位置、顺式作用元件（cis-acting regulatory element，cis-element）和表达模式进行了分析。共获得32个CRK家族成员，其氨基酸数、分子量和等电点分别介于440 ~ 1 217、48.90 ~ 137.02 kD和5.31 ~ 8.59，主要位于质膜。根据进化分析，将来自梨、拟南芥、苹果、番茄和水稻的156个CRK分为6个亚组，梨CRK主要分布于亚组Ⅳ，Ⅴ和Ⅵ。梨CRK中存在5个串联重复的基因簇，共包含了20个成员。此外，该基因家族所有成员的启动子区域都存在多个响应激素和逆境信号的cis-element。接种腐烂病菌Valsa pyri（Vp）后，杜梨（Pyrus betulifolia，抗病）和‘早酥’梨（Pyrus bretschneideri，感病）中分别发现8个和10个CRK发生了差异表达，6个基因在两种资源中都发生了差异表达。差异基因中，Pbr001477.1和Pbr000205.4在抗、感病资源中都显著上调，而其他基因的表达量在两种资源中呈现不同的变化趋势。     

桃漆酶家族基因鉴定及PpLAC21功能分析

利用生物信息技术鉴定了桃中漆酶（LAC）家族成员,分析其进化关系分析、基因结构、启动子区顺式作用元件以及表达模式。结果表明,在桃基因组中共鉴定出48个漆酶基因,通过在桃子叶愈伤组织中的表达模式分析,发现1个表达量很高的关键成员PpLAC21,在该基因沉默的桃愈伤组织中,木质素的含量下降,推测该基因可能参与桃愈伤组织的木质素合成。     

桃粉蚜在郑州春季发生规律与桃及其近缘种抗性鉴定

【目的】探究郑州地区春季桃粉蚜发生规律和危害特点,鉴定不同桃及其近缘种对粉蚜的抗性,旨在为桃粉蚜的科学预防和桃抗粉蚜育种奠定基础。【方法】从2月下旬开始,每隔5 d对种植在郑州果树研究所抗性鉴定圃内的桃种质及其近缘种进行粉蚜发生、发展和危害调查;同时于粉蚜发生期采集发生粉蚜的桃树新梢和叶片,对圃内各种质材料进行过量接种,7 d后评价不同种质的抗粉蚜特性。【结果】郑州地区桃粉蚜一般在每年3月上中旬出现,6月下旬以后开始大量减少,集中危害发生在4月下旬至6月上旬,有时持续到6月中下旬;桃粉蚜大发生时,新梢、幼叶及成熟叶片均受危害,被害叶失绿并向叶背对合纵卷,覆有白色蜡粉。27份不同来源桃种质均表现感蚜,抗性等级为4级或5级;18份桃及其近缘种质群体中‘榆叶梅1号’群体高抗粉蚜,‘蒙古扁桃1号’群体和‘四道岭野生李’抗粉蚜,‘贵州毛桃4号’群体中抗粉蚜,甘肃桃、山桃、光核桃、西康扁桃等其他群体易感粉蚜。【结论】明确了郑州地区春季桃粉蚜发生和危害特点,拓展了对桃粉蚜寄主范围的认识,鉴定到‘榆叶梅1号’‘蒙古扁桃1号’‘四道岭野生李’和‘贵州毛桃4号’等抗粉蚜种质。     

桃根系与南方根结线虫早期互作的组织病理学研究

为研究桃根系与根结线虫互作的组织结构变化及抗病机理,对抗病种质‘白根甘肃桃1号’（Prunus kansuensis‘Baigen Gansu Tao 1’）和感病种质‘贝蕾’（P. persica‘Bailey’）实生幼苗进行室内人工接种南方根结线虫（Meloidogyne incognita）,并对接种后6、12、18、24、30、36、42和48 h的根尖进行染色观察及接种后0、6、12、36、60和84 h的根尖组织结构变化进行石蜡切片观察。染色结果表明,根结线虫侵染‘白根甘肃桃1号’和‘贝蕾’的规律基本一致：在接种12 h后开始侵入,接种12 ~ 30 h线虫数量逐渐增加,然后线虫沿维管束向上移动,根尖线虫数量趋于减少。但与‘贝蕾’相比,‘白根甘肃桃1号’的根结线虫侵染数量显著降低,在接种30 h时仅为‘贝蕾’线虫侵染数的28%。石蜡切片结果显示‘白根甘肃桃1号’根结构受破坏程度明显较低,侵入的线虫主要聚集在一定区域,且在侵染84 h时线虫聚集区域周围的细胞出现坏死反应。     

辣椒种质资源对桃蚜的抗性鉴定初报

温室苗期接蚜鉴定与田间鉴定结果表明，24个参试辣椒品种对桃蚜的反应不同，其中凉椒一号等4个品种对桃蚜表现为高抗；苗丰三号等4个品种对桃蚜表现为抗；超丰五号等8个品种对桃蚜表现为中抗；大羊角椒等4个品种对桃蚜表现为高感；保椒二号等4个品种对桃蚜表现为感。以高抗品种猪大肠和高感品种大羊角椒为亲本进行杂交，其杂交F1代对桃 蚜的反应表现为高抗（HR），F2代的抗虫与感虫植株分离符合3：1的比率，表明辣椒抗蚜性能够稳定遗传，其遗传方式为显性单基因控制的质量遗传。     

葡萄LIM家族基因特征及表达模式分析

为了明确LIM家族基因在葡萄非生物胁迫下的表达特性，在生物信息分析的基础上，以‘黑比诺’葡萄（Vitis vinifera‘Pinot Noir’）试管苗为试验材料，利用qRT-PCR技术检测了不同逆境处理对葡萄LIM家族基因成员表达的影响。结果显示，葡萄LIM基因家族有14个成员，可分为4个亚族，各亚族编码蛋白氨基酸数量差异较大，但亚族内差异较小；分析葡萄基因和拟南芥基因间的选择压发现，二者存在钝化选择关系；多序列比对发现，该家族基因成员含有1或2个锌指结构的保守结构域；保守基序分析结果表明，所有基因均包含motif2；基因结构显示VvLIM含有4 ~ 15个外显子；14个基因中有11个编码蛋白存在互作关系。该家族基因存在大量的光诱导元件和水杨酸等逆境胁迫相关元件。基因芯片表达数据表明，高表达的基因主要存在生长旺盛的组织中。qRT-PCR分析发现，VvLIM1在100 mmol ? L-1 NaCl、10% PEG和50 mg ? L-1 SA胁迫下表达量与对照相比显著上调，且随处理时间的延长表达量显著增加。     

响应葡萄根瘤蚜侵染的扩展蛋白基因筛选及其多克隆抗体的制备

以对葡萄根瘤蚜敏感的‘克瑞森无核’葡萄(Vitis vinifera ‘Crimson Seedless’)组培苗和抗性砧木‘1103P’组培苗为试材,通过荧光定量PCR技术从扩展蛋白基因家族中筛选到经根瘤蚜侵染后表达上调的扩展蛋白基因家族成员VvEXPA1。采用RT-PCR方法克隆到VvEXPA1基因片段,连接至原核表达载体pET-32a中,转化大肠杆菌DE3菌株,测序确定构建的重组载体pET32a-VvEXPA1开放阅读框正确,并经IPTG诱导表达了融合蛋白。该蛋白以包涵体的形式存在,纯化后免疫新西兰兔,制备扩展蛋白多克隆抗体,通过Western-blot和ELISA检测抗体的特异性及效价。结果显示制备的抗体具有较高的特异性,ELISA显示效价为1:51 200。     

桃生长素酰胺水解酶基因家族序列特征及其表达分析

生长素酰胺水解酶（IAA-Leucine Resistant1-like Hydrolase,ILL）可催化生长素结合态释放游离态生长素（IAA）。为了深入研究桃ILL基因家族的功能,对桃基因组中ILL基因家族成员的数量、在染色体骨架的分布、编码蛋白质的结构、基因表达模式和编码氨基酸的进化树分类等方面进行了研究。桃基因组中共鉴定出了9个ILL基因,它们分布在4个染色体骨架上（scaffold 1、2、3和7）。在桃中编码ILL蛋白家族的基因成员分别为：PpILR1、PpILR2、PpILR3、PpILR4、PpILL1、PpILL2、PpILL3、PpILL4和PpILL5,所有这些预测的蛋白都含有M20结构域和M20二聚化结构域。运用荧光定量实时PCR技术对该基因家族在桃果实生长发育各阶段的表达水平进行了分析,结果显示：ILL 基因家族中的数个成员在果实不同发育阶段表达水平有变化,其中PpILR1的表达量在果实生理成熟期明显上调。     

月季花瓣特异表达启动子的筛选和鉴定

以月季品种‘萨曼莎’（Rosa hybrida‘Samantha’）为试验材料，选取了13个花色、花香相关的基因，研究其在根、茎、叶和花等器官中的表达规律及其启动子活性。结果表明，RhOOMT2（Rosa hybrida orcinol o-methyltransferase 2）和RhCCD4（Rosa hybrida carotenoid cleavage dioxygenase 4）在花瓣中具有相对较高的表达量，RhNUDX1（Rosa hybrida nudix hydrolase 1）在根部表达量最高，花瓣中其次，在茎和叶中几乎没有表达，另外10个类黄酮代谢途径相关基因在各器官中表达差异较小。使用FPNI-PCR的方法克隆到ATG上游1 601 bp的RhOOMT2启动子、1 539 bp的RhCCD4启动子和1 433 bp的RhNUDX1启动子。将携带RhOOMT2、RhCCD4和RhNUDX1启动子的PBI121载体通过农杆菌的介导，在月季‘Samantha’、洋桔梗（Eustoma grandiflorum‘Green Pelleted’）和百合（Lillium Oriental hybrida‘Siberia’）花瓣中进行瞬时表达，GUS染色结果表明，与阳性对照35S启动子相比，RhOOMT2启动子在月季、洋桔梗和百合花瓣中具有更强的活性，RhCCD4启动子在百合花瓣中具有较弱的活性，而在月季和洋桔梗中活性很弱，RhNUDX1启动子则在3种花中均无活性。进一步在4个月季品种‘萨曼莎’、‘戴安娜’、‘香槟月季’和‘雪山’中比较了RhOOMT2和35S的启动子活性，证实了在花瓣中RhOOMT2启动子具有比35S更高的活性。     

猕猴桃病毒A和B在陕西省的分布、分子变异与基因组研究

系统调查了中国陕西省猕猴桃主产区周至、眉县、杨凌和汉中‘徐香’、‘海沃德’、‘华优’和‘秦美’猕猴桃上猕猴桃病毒A（AcVA）和猕猴桃病毒B（AcVB）的带毒率和分布情况。结果表明，AcVA和AcVB在4个产区均有广泛地分布和较高的带毒率。其中，AcVA和AcVB分别在杨凌（36.7%）和眉县（36.9%）有最高的带毒率。按照品种划分，AcVA（32.3%）和AcVB（32.9%）均在‘徐香’品种上有最高的带毒率。通过高通量测序与分析获得了AcVA和AcVB的基因组序列，其分别由7 654和7 454个核苷酸组成，与之前报道的TP7-93A和TP7-93B分离物对应的同源率分别为82.7%和78.5%。AcVA和AcVB外壳蛋白基因系统发育树显示，2种病毒分成2个组，存在较大的分子变异。     

柑橘MAPK基因的生物信息及其响应溃疡病菌侵染的表达分析

为挖掘柑橘溃疡病抗性关键基因，对柑橘促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）基因家族进行注释和功能域分析，明确了CsMPK1、CsMPK3、CsMPK4、CsMPK6和CsMPK19的组织表达特异性和在抗病品种‘金弹’（Fortunella japonica Swingle）和感病品种‘晚锦橙’（Citrus sinensis Osbeck）中受病原菌（Xanthomonas citri subsp. citri，Xcc）诱导的表达情况；并对CsMPK19进行了生物信息分析。共注释出12个柑橘MAPK基因家族成员，根据系统发育树将其分为3个亚类，均含有促分裂原活化蛋白激酶（Pkinase）功能结构域。其中CsMPK1、CsMPK3、CsMPK4-1和CsMPK6在果实中表达水平较高，CsMPK19在叶片中表达量相对较高。CsMPK1的表达在溃疡病抗（感）品种中均受病原菌强烈诱导，且在感病品种中上调的幅度高于抗病品种；CsMPK3 和CsMPK6仅在感病品种中病原菌处理早期有较强烈的响应；CsMPK4-1和CsMPK4-2的表达在感病品种中受病原菌诱导上调，而在抗病品种中病原菌处理后低于水处理对照；CsMPK19的表达在抗（感）品种中均受病原菌强烈诱导，且在抗病品种中上调幅度更大。克隆了CsMPK19，其序列全长为1 824 bp，编码607个氨基酸，分子量为69 174.36 D，为非分泌性蛋白，其25 ~ 316 aa为典型的Pkinase功能域。晚锦橙和金弹MPK19启动子的顺式作用元件存在较大差异。结果表明柑橘MAPK基因强烈响应溃疡病菌侵染，推测CsMPK19在溃疡病抗性调节中有潜在应用价值。     

植物Gly-RLK基因家族鉴定及其在苹果中的表达分析

类受体激酶（receptor like kinase，RLK）在植物生长发育和环境适应中起重要作用。前期研究发现苹果（Malus  domestica）中存在一类具有Glyco_18胞外结构域（SM000636或SM000704）的RLK，命名为Glyco_18-RLK（Gly-RLK）。本试验中以Glyco_18和Pkinase（SM000220）保守域全蛋白序列为种子序列，对53种被子植物基因组中的Gly-RLK进行鉴定，并分析其进化特征；明确苹果Gly-RLK（MdGly-RLK）的理化性状、亚细胞定位，基因在染色体上的分布、启动子区域的顺式作用元件和表达模式。结果表明，仅19种植物中存在Gly-RLK，家族成员数介于1 ~ 20，单子叶植物中均未发现该家族成员。根据进化分析将其分为8个亚组，亚组Ⅲ、Ⅶ和Ⅷ分布基因数较多。共发现6个MdGly-RLK，其编码的氨基酸序列大小、分子量和等电点分别介于451 ~ 776、50.99 ~ 87.33 kD和5.95 ~ 8.21，主要位于质膜，4个为串联重复。MdGly-RLK在苹果各组织和品种间存在不同的表达模式；接种苹果腐烂病菌（Valsa mali）后，6个MdGly-RLK均差异表达，MdGly-RLK6（MD15G1156900）可上调至对照的16.33倍。综上，Gly-RLK仅在部分双子叶植物中存在，家族成员的扩增速度较快。MdGly-RLK响应苹果生长发育和黑腐皮壳菌信号，MdGly-RLK6可作为苹果抗腐烂病研究的候选基因。     

桃果实中miR160a与其靶基因ARF的鉴定及对IAA的响应分析

以水蜜桃品种‘小白凤’果实为试材,利用miR-RACE技术验证了桃mi R160a的精确序列,克隆了其3个ARF靶基因(PpARF18、PpARF17和PpARF18-like)的ORF序列。利用RLM-RACE技术以及qRT-PCR方法对Ppe-miR160a作用于3个靶基因的模式及频度进行了分析。结果表明,Ppe-miR160a的精确序列与预测序列在5′端和3′端均存在1个碱基的差异,其3个靶基因ARF均含有高度保守的B3和生长素响应DNA结合域。RLM-5′RACE结果显示,Ppe-miR160a以裂解的方式作用于3个ARF靶基因,且裂解位点均位于Ppe-miR160a5′端的第9和第10位碱基之间。IAA响应分析表明,与对照相比,IAA处理后的桃果实中Ppe-miR160a以及3个靶基因3′端裂解产物的表达量均显著升高。以上结果表明桃果实中的Ppe-miR160a通过介导其3个靶基因的裂解参与生长素信号途径调控。     

辣椒碱基–抗坏血酸转运蛋白（NAT）家族基因的鉴定和表达分析

利用生物信息学手段，在辣椒‘遵辣1号’中鉴定到12个碱基–抗坏血酸转运蛋白（NAT）基因，命名为CaNAT01 ~ CaNAT12，它们不均等的分布在7条染色体上，片段复制和串联复制是其扩增的原因。CaNATs包含多个跨膜结构域，等电点主要集中在8.39 ~ 10.15。系统进化分析发现植物中的NAT起源于D亚组基因，后经过分化，在双子叶植物中稳定存在4个亚组，C亚组基因间的核苷酸差异最小，在进化过程中最保守，CaNATs在这4个亚组均有不同分布。辣椒NAT家族基因具有明显的组织表达差异性，部分基因在根、茎以及果实发育过程中具有重要的调控作用。在低温、高温、干旱和盐胁迫下通过qRT-PCR分析发现CaNATs具有不同程度的响应，对低温和高温具有较强的响应。     

应用SSR标记进行部分黄肉桃种质鉴定和亲缘关系分析

以116份黄肉桃种质和19份其它桃或桃近缘种种质为试材,利用定位于李属参考图谱上的SSR标记,进行遗传多样性评价及亲缘关系分析。SSR扩增结果表明,筛选出的28对SSR引物共扩增出206个等位基因,其中多态性等位基因159个（占76.56%）。聚类结果表明,在相似系数为0.82时,黄肉桃资源在聚类图上呈两组：美洲、欧洲和亚洲育成黄桃品种聚为一组（Ⅰ）,中国地方黄桃品种中唯‘西安杏瓤桃’和‘天津黄肉’出现在这一组;来源于云南、华北、西北地区的中国地方黄桃品种聚为另一组（Ⅱ）。在相似系数为0.87时,育成黄桃品种（Ⅰ）分为8个亚组,美洲育成品种分布在所有8个亚组中,欧洲育成品种分布在Ⅰ-2、Ⅰ-3和Ⅰ-4亚组,而亚洲育成品种仅分布在Ⅰ-3和Ⅰ-4亚组;亲本相同的育成品种在聚类图中临接或出现在较近的位置,育成品种的聚类结果与品种的系谱关系基本吻合。在相似系数为0.87时,中国地方黄桃品种分为7个亚组,西南黄桃和西北黄桃存在一定的组群界限,来自西南的黄桃地方资源主要分布在Ⅱ-1和Ⅱ-5亚组,而来自西北的黄桃地方品种主要出现在Ⅱ-2、Ⅱ-4和Ⅱ-7亚组。品种群的聚类结果表明,亚洲育成品种与美洲育成品种间亲缘关系最近,其次为欧洲育成品种;中国地方黄桃品种与育成品种间亲缘关系较远。     

柑橘胼胝质合成酶基因家族的表达分析

胼胝质由胼胝质合成酶合成,胼胝质沉积是植物对入侵病原的防御反应。为了探索胼胝质合成酶(Callose synthase,CalS)基因在柑橘中对黄龙病的应答情况,从甜橙基因组中筛选并利用生物信息学分析了柑橘胼胝质合成酶(CsCalS)家族的12个基因。这些基因编码的氨基酸序列与拟南芥中的胼胝质合成酶具有较高的同源性。荧光实时定量PCR结果显示,CsCalS5和CsCalS12在柑橘健康叶片中的表达量高于其他胼胝质合成酶基因。比较黄龙病感病材料和健康对照材料,发现CsCalS5、CsCalS7和CsCalS8在感病的‘砂糖橘’和‘强德勒’柚中均上调表达,可能参与柑橘对黄龙病病原的应答反应。     

龙眼miR166家族的分子进化特性及时空表达分析

为了解miR166基因家族的分子进化特性及其在龙眼不同组织部位的表达规律,对龙眼miR166家族成员的成熟体和前体序列及其进化、前体二级结构预测、靶基因预测以及时空表达模式进行了分析。结果表明:龙眼miR166家族含有12条成熟体序列和7个前体序列(pre-miRNA)。Mfold预测显示pre-miR166家族7个成员的序列均能形成典型稳定的茎环二级结构,成熟序列的碱基保守性高,其他位置的则保守性减弱;它们的最小折叠自由能(ΔG)在–35.30~–83.30kal·mol~(-1)。系统发育进化树分析显示,龙眼pre-miR166家族与葡萄、碧桃的pre-miR166亲缘关系更为接近。靶基因预测显示,龙眼miR166基因家族靶基因包括同源异型域—亮氨酸拉链蛋白、三角状五肽重复结构蛋白、假定蛋白、DNA指导的RNA聚合酶Ⅲ亚单位RPC2、紫外线B受体等。实时荧光定量PCR显示,pre-miR166家族不同成员在龙眼生长发育进程中均有表达且表达模式不尽相同,提示其可能广泛参与龙眼各个器官的调控,且在功能上可能具有分工。