外源钙对低温胁迫下西藏野生垂穗披碱草生理及相关基因表达的影响

为探究Ca²⁺调控西藏野生垂穗披碱草（Elymus nutans）适应低温的生理和分子响应机制,本研究采用叶面喷施外源CaCl₂的方法,研究其对当雄野生垂穗披碱草表型,生物量,电解质渗透率、活性氧、丙二醛、渗透调节物质含量以及抗氧化酶活性的影响。结果表明,喷施15 mM CaCl₂有效地缓解低温对垂穗披碱草幼苗的生长抑制;CaCl₂处理显著提高低温胁迫下垂穗披碱草地上/地下生物量,降低丙二醛和活性氧的积累,提高可溶性糖和游离脯氨酸的含量及过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化氢酶等抗氧化酶活性。RT-qPCR结果表明,外源CaCl₂能上调EnAPX,EnCAT2,EnGPX,EnGST4,EnMDAR,EnPER1,EnCu/ZnSOD,EnFeSOD,EnMnSOD抗氧化酶基因的表达水平,同时上调胁迫相关基因EnCOR410,EnCS120,EnDHN5和EnMYB4的表达。综上,低温胁迫下适宜浓度的Ca²⁺能够激活抗氧化酶活性,及时清除过量积累的活性氧,缓解低温对西藏野生垂穗披碱草细胞膜系统造成的氧化伤害,提高细胞渗透调节能力,并且能够诱导胁迫相关基因的表达,从而提高垂穗披碱草的抗寒性。     

外源脯氨酸对低温胁迫下西藏野生垂穗披碱草幼苗生长和抗氧化酶相关基因表达的影响

本试验以西藏野生垂穗披碱草（Elymus nutans Griseb.）为研究对象,采用盆栽试验,研究叶面喷施外源脯氨酸（10 mM）对低温胁迫（4℃）下垂穗披碱草幼苗生长及抗氧化酶活性及其基因表达的影响。结果表明：低温胁迫下脯氨酸处理能够显著提高垂穗披碱草幼苗的根长、地上和地下鲜重、地上和地下干重,与低温胁迫相比分别增加27.11%,48.80%,48.83%,51.74%,38.87%;外源脯氨酸增加了低温胁迫下内源脯氨酸和可溶性糖的积累,分别增加42.96%和22.98%（P<0.05）;而且脯氨酸处理提高了APX、CAT、ChICu/ZnSOD、CytCu/ZnSOD基因的表达水平以及过氧化物酶（Peroxidase,POD）、过氧化氢酶（Catalase,CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）和抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate peroxidase,APX）活性,降低了丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量和相对电导率水平（P<0.05）。综上所述,脯氨酸能够增强低温胁迫下垂穗披碱草幼苗的渗透调节能力及抗氧化酶活性,维持细胞膜的稳定性,缓解其生长抑制,从而提高垂穗披碱草的抗寒性。     

2,4表-油菜素内酯对低温胁迫下西藏野生垂穗披碱草幼苗抗氧化保护和渗透调节的影响

本研究以西藏野生垂穗披碱草（Elymus nutans Griseb.）为试材,采用叶面喷施2,4-表油菜素内酯（Epibrassinolide,EBR）的方法,探讨EBR对低温胁迫下西藏野生垂穗披碱草幼苗抗氧化保护和渗透调节的影响。结果表明,喷施不同浓度EBR导致垂穗披碱草幼苗生物量随浓度增加而升高,但高浓度下又有降低的趋势,而叶片相对电导率则呈相反变化趋势,其中1 μmol·L^-1的EBR处理抗寒效果最好。低温胁迫下,抗氧化酶（抗坏血酸过氧化物酶,谷胱甘肽还原酶,超氧化物歧化酶）活性显著高于CK,而过氧化氢酶和过氧化物酶活性低于CK,EBR处理后抗氧化酶活性进一步增加,同时叶面喷施EBR提高了低温胁迫下垂穗披碱草幼苗抗坏血酸、谷胱甘肽和游离脯氨酸含量,降低了丙二醛和超氧阴离子自由基的积累。因此,低温胁迫下喷施EBR能显著提高抗氧化系统活性和渗透调节物质脯氨酸的积累,增加活性氧的清除能力,减轻低温引起的膜脂过氧化,从而增强垂穗披碱草的耐寒性。     

西藏野生垂穗披碱草EnCBL10基因的克隆与功能研究

钙调磷酸酶B类蛋白（Calcineurin B-Like Proteins，CBLs）是钙信号通路中重要成员，在植物应答多种非生物胁迫中具有重要的作用。本研究基于前期转录组数据，在西藏野生垂穗披碱草（Elymus nutans Griseb.）中筛选EnCBL10基因，将其异源表达于烟草（Nicotiana tabacum）中，分析转基因植株EnCBL10在低温和干旱胁迫下的生长及生理响应。结果表明：EnCBL10开放阅读框为792 bp，编码263个氨基酸。EnCBL10蛋白的理论等电点为5.17，为疏水蛋白和非分泌蛋白。低温和干旱胁迫下，对比于野生型烟草，转基因烟草叶片的细胞膜稳定性显著增加，过氧化物酶（Peroxidase，POD），抗坏血酸过氧化物酶（Aseorbateperoxidase，APX）和谷胱甘肽还原酶（Gluathione reductase，GR）活性显著升高。低温胁迫下，两个转基因株系的脯氨酸含量分别提高了79.7%和70.8%（P<0.05）；在干旱胁迫下，野生型植株（WT）和过表达植株中脯氨酸含量均有所降低，但转基因植株比WT的下降幅度小。因此，EnCBL10基因可能在垂穗披碱草的耐寒和耐旱调控中发挥重要功能。     

紫花苜蓿atpA基因的克隆及表达模式分析

叶绿体atpA基因位于ATP合酶的CF₁上，编码α亚基，是光合作用不可缺少的关键基因。本研究利用RT-PCR技术，从‘新疆大叶’苜蓿（Medicago sativa L.‘Xinjiang Daye’）中克隆出atpA基因，并进行生物信息学分析，采用实时荧光定量PCR技术进行基因表达模式检测。结果显示，MsatpA基因编码510个氨基酸，相对分子质量为55.71 KD，等电点为5.22。MsAtpA蛋白含有多个磷酸化位点且无跨膜结构和信号肽，二级结构中α-螺旋占比最高；亚细胞定位预测该基因编码的蛋白位于叶绿体中，与同为豆科苜蓿属的黄花苜蓿（Medicago falcata）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）的AtpA氨基酸序列同源性较高。表达模式检测结果显示，MsatpA基因在叶中的表达量最高，根中最少；结荚期的基因表达量显著高于其他发育时期；MsatpA基因响应低温、高温、盐和渗透胁迫应答，且呈现出不同的表达特点。研究结果为紫花苜蓿atpA基因功能研究奠定基础。     

冷胁迫对2种垂穗披碱草生长和生理特性的影响

低温是影响植物生长的外界限制因子之一。采用沙培法研究了冷胁迫对2种垂穗披碱草（Elymus nutans）（当雄垂穗披碱草（西藏野生）和甘南垂穗披碱草）生长与生理特性的影响。结果表明：冷胁迫处理5d显著抑制2种垂穗披碱草的生长和叶绿素的合成,特别是甘南垂穗披碱草发生严重氧化损伤,电解质渗透率和丙二醛（MDA）含量分别比对照增加114.7%和124.6%,而当雄垂穗披碱草受伤害较轻,分别比对照增加18.2%和10.8%。冷胁迫也显著增加了甘南垂穗披碱草中H₂O₂和自由基的积累,而当雄垂穗披碱草与对照相比差异不显著。冷胁迫处理5d后,当雄垂穗披碱草的类胡萝卜素含量较甘南增加72.3%,超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）的活性分别较对照增加80.3%,27.3%和65.9%;甘南垂穗披碱草的SOD和POD活性分别较对照增加11.4%和28.9%,而其CAT活性下降25.5%。相关分析表明,垂穗披碱草在冷胁迫下细胞膜受损伤程度与抗氧化酶活性负相关。当雄垂穗披碱草通过提高抗氧化酶活性,可有效清除体内积累的活性氧,减轻细胞膜系统受损伤的程度从而提高其抗寒性。     

Mn2+、Pb2+对野生垂穗披碱草种子萌发与幼苗生长的影响

研究了西藏巴青县野生垂穗披碱草种子萌发与幼苗生长对重金属Mn²⁺、Pb²⁺胁迫的生理响应机制,为西藏矿区周边污染土壤和植被修复提供依据。选取西藏巴青县野生垂穗披碱草为试验材料,采用纸上发芽法研究了重金属Mn²⁺、Pb²⁺对其种子萌发和幼苗生长的影响。结果表明,Mn²⁺、Pb²⁺离子胁迫对垂穗披碱草种子萌发和幼苗生长具有极显著的影响(P<0.01);随着Mn²⁺、Pb²⁺浓度的增大,垂穗披碱草种子发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数及胚芽长表现为下降的趋势;在200 mg·L^-1 Mn²⁺、Pb²⁺溶液浓度培养下垂穗披碱草种子根较对照略长;随着Mn²⁺、Pb²⁺溶液浓度的升高,垂穗披碱草幼苗叶片叶绿素a和叶绿素b含量持续降低而电导率和MDA含量呈上升趋势。垂穗披碱草对Mn²⁺、Pb²⁺具有一定的耐受性,可适用于Mn²⁺、Pb²⁺轻度污染土壤。     

4种禾本科牧草苗期抗寒性综合评价

为了探究西藏野生禾本科牧草对低温胁迫的适应性,本研究以西藏野生垂穗披碱草（Elymus nutans Griseb）、赖草（Leymus secalinus Tzvel）、紫花针茅（Stipa purpurea）和栽培品种黑麦草（Lolium perenne）为试验材料,比较分析其幼苗在—10℃～5℃低温条件下叶片丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量、可溶性糖（Soluble sugar,SS）含量、游离脯氨酸（Free proline,Pro）含量、过氧化物酶（Peroxidase,POD）活性和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活性的变化。结果表明：随着低温胁迫的加剧,所有供试材料叶片MDA含量呈上升趋势,SS含量、Pro含量、POD活性和SOD活性呈先升高后降低趋势,其中黑麦草Pro含量在0℃达到峰值,其他3种指标在—5℃达到峰值,3种野生禾草的各指标均在—5℃达到峰值。采用隶属函数法对各材料进行综合评价并分级,结果表明垂穗披碱草和紫花针茅抗寒性最强,划分为Ⅰ级,赖草抗寒性中等,划分为Ⅱ级,黑麦草抗寒性最弱,划分为Ⅲ级。     

柳枝稷PvbZIP8基因的克隆与表达分析

bZIP转录因子在植物非生物逆境胁迫的响应中发挥着重要作用,本研究通过同源克隆在柳枝稷（Panicum virgatum L.）中获得PvbZIP8基因,并对该基因进行了初步的生物信息学分析,同时利用荧光定量PCR技术进行了非生物胁迫下基因表达模式分析以及组织特异性表达分析。结果显示：基因的开放阅读框长度为468 bp,编码155个氨基酸,分子式为C₇₆₁H₁₂₄₈N₂₄O₂₃S₈,分子量为17.81 kDa,为亲水性蛋白。系统进化分析表明该蛋白与哈氏黍（Panicum hallii）、谷子（Setaria italica）和糜子（Panicum miliaceum）相似性较高,并且具有典型的bZIP保守结构域,属于bZIP转录因子家族成员。定量PCR结果显示,PvbZIP8基因在盐、干旱、高温和低温胁迫下上调表达,在柳枝稷抗逆过程中发生作用。组织特异性表达分析表明,PvbZIP8在多个组织或器官均有表达,其中在根、茎、叶中表达量较高。本研究初步确定柳枝稷PvbZIP8基因响应抗逆性反应,并为进一步研究柳枝稷PvbZIP8基因的生物学功能奠定基础。     

垂穗披碱草MADS-box基因WM8克隆及分析

通过同源克隆从垂穗披碱草中获得了MADS-box基因家族WM8基因的全长cDNA序列,命名为 EnWM8(Genbank登录号为 JF683846)。序列分析表明,该cDNA全长1 196 bp,开放阅读框共编码275个氨基酸,具有典型的MADS-box结构域以及半保守的K区,是MIKC型MADS-box基因,分析认为其与花发育和果实成熟等有关。EnWM8与小麦的WM8、AGL29和fruitful-like基因氨基酸的推导序列的相似性分别高达95.62%,96.72%和96.28%。采用DNAMAN 软件进行系统进化树分析显示,EnWM8基因与小麦的TaWM8进化关系最近,与拟南芥的AtWM8、AtAGL29进化关系较远。垂穗披碱草WM8蛋白分子量为13 726.7 Da,理论等电点为9.14,为亲水性的碱性蛋白,无跨膜结构域,定位于细胞核中,其空间结构主要由α-螺旋、无规则卷曲和延伸链构成。研究结果可为进一步从分子水平探明垂穗披碱草花发育、种子成熟等机制提供参考。     

多年生黑麦草LpPIL5基因特征分析及转录调控

光敏色素互作因子（PIFs）属于bHLH家族的一个亚家族,在植物光信号、激素信号传导和调控植物耐逆性等方面发挥重要作用。本研究从多年生黑麦草中克隆出一个PIF基因,其与拟南芥AtPIF5的亲缘关系最近,因此命名为LpPIL5-like（LpPIL5）。LpPIL5基因编码区序列（CDS）全长为1410 bp,具有5个外显子,编码470个氨基酸,具有典型的bHLH结构域和APB功能域,且其蛋白定位于细胞核。LpPIL5的启动子区域（1500 bp）具有ABRE、MBS和G-box等多种光、激素和逆境响应顺式作用元件。表达模式分析结果显示LpPIL5在叶片中表达量较高,而在根、茎、叶鞘等部位表达量较低。LpPIL5基因的表达受昼夜节律调控,且在光下的表达量显著高于黑暗。此外,聚乙二醇（PEG）、NaCl、CdCl₂和高温逆境及6-苄基腺嘌呤（6-BA）和脱落酸（ABA）等激素处理显著抑制了叶片中LpPIL5基因表达,而在根中,LpPIL5基因的相对表达量在处理的12 h后明显增加,处理24 h时,显著高于对照。     

蒺藜苜蓿MtDWF1基因克隆、亚细胞定位及表达特征分析

Delta24-甾醇还原酶(Delta24-sterol reductase, DWF1)是油菜素内酯(Brassinosteroide, BR)合成途径中的关键酶，在植物生长发育中起着关键性的作用。为了研究DWF1基因在蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中的功能，本试验从蒺藜苜蓿R108中克隆MtDWF1基因全长序列，该基因开放阅读框(ORF)1 704 bp,编码567个氨基酸，分子量65.911 kD,理论等电点为8.53。亚细胞定位显示，该蛋白定位于细胞质内。进化分析表明，蒺藜苜蓿MtDWF1蛋白与鹰嘴豆(Cicer arietinum)、红三叶(Trifolium pratense)及豌豆(Pisum sativum)亲缘关系较为接近。MtDWF1基因在蒺藜苜蓿根、茎、叶中均有表达，在茎和叶中的表达水平较高。外源激素脱落酸(Abscisic acid, ABA)能够明显提高MtDWF1表达，水杨酸(Salicylic acid, SA)能够显著降低MtDWF1表达水平。同时，经油菜素内酯诱导后，MtDWF1表达水平整体呈现增加趋势。本研究为进一步探索MtDWF...     

紫花苜蓿与垂穗披碱草混播比例对其抗寒生长生理特征的影响

为探究混播群落中紫花苜蓿（MS）抗寒生长表型及对低温的响应特征,设置紫花苜蓿与垂穗披碱草4个混播比例（紫花苜蓿占比分别为100%、70%、50%和30%,即MS_100%、MS_70%、MS_50%和MS_30%）。在温室条件下,播种定苗经25 ℃育苗45 d后,转入15 ℃培养10 d,再转入5 ℃培养10 d,测定分析2个低温阶段混播群落中紫花苜蓿的生长抗寒生理指标。结果表明：从生长特征看,15 ℃阶段,MS_70%紫花苜蓿叶宽长比最小,MS_50%紫花苜蓿地上、地下和群落生物量最高,且紫花苜蓿根颈直径最大,分别较MS_100%和MS_70%高42.8%和46.8%;5 ℃阶段,紫花苜蓿地上、地下及群落生物量仍以MS_50%最高,MS_50%和MS_30%下紫花苜蓿的株高、分枝数、根颈直径、主根长度等表现较佳。从生理特征看,紫花苜蓿的根系较叶片对低温敏感,15 ℃阶段,MS_70%、MS_50%和MS_30%紫花苜蓿根系可溶性糖含量较MS_100%提高13.1%、25.2%和14.0%,MS_30%的根系脯氨酸含量比MS_100%高32.9%;5 ℃阶段,MS_50%紫花苜蓿根系可溶性糖含量最高,MS_50%和MS_30%可溶性蛋白及脯氨酸含量均高于MS_100%和MS_70%。基于紫花苜蓿生长生理特征综合评价及最优混播比例筛选得知,混播能提升紫花苜蓿生长生理特征对低温的适应,30%~50%的紫花苜蓿混播占比为研究区紫花苜蓿-禾草混播草地建植的适宜比例。     

解淀粉芽孢杆菌DGL1促燕麦生长分子机制及代谢通路探究

分离自青海大格勒干旱沙地的解淀粉芽孢杆菌DGL1(Bacillus.amyloliquefaciens)被证实能够促进青海本地燕麦(Avena sativa)品种‘青燕1号’的生长。为了揭示DGL1促进燕麦生长的分子机制,本研究通过Illumina高通量转录组测序技术分析燕麦根部与菌株DGL1菌悬液分别互作2h,4h,8h,12h的处理组与对照组(CK)间的转录组差异表达基因,并通过GO富集、KEGG Pathway富集分析燕麦地上部分差异表达基因的相关代谢通路及关键基因。结果表明：燕麦根部与DGL1菌悬液互作2h,4h,8h和12h,燕麦叶部分别有1894,6130,8033和12215个差异表达基因,显著富集在氨基酸代谢、植物光合作用、次级产物代谢通路和与燕麦生长发育调控等相关代谢途径;通过KEGG富集分析发现IAA合成的色氨酸代谢途径中生长素早期响应蛋白编码基因AUXI、茉莉酸信号途径中核心受体编码基因COI1,铵转运蛋白编码基因AMT等基因显著上调,推测菌株DGL1对燕麦的促生机制是通过促进燕麦光合作用、激素代谢、次生代谢物合成、氨基酸代谢等多个途径相互协调的结果。     

紫花苜蓿MsCCD4基因克隆及耐盐功能鉴定

为验证紫花苜蓿(Medicago sativa L.)胡萝卜素裂解双加氧酶(Carotenoid cleavage dioxygenase，CCD)基因的耐盐功能，本试验克隆了紫花苜蓿MsCCD4的CDS全长序列，并以其叶片为试验材料，通过发根农杆菌介导的毛状根诱导法获得过表达MsCCD4的转基因毛状根，验证过表达MsCCD4对紫花苜蓿耐盐性的影响。结果表明：MsCCD4为稳定的酸性亲水蛋白质，二级结构以无规则卷曲为主，C-端含有RPE65保守结构域；MsCCD4启动子区含有光响应、激素应答和非生物胁迫响应结合元件；盐胁迫可诱导MsCCD4表达量升高；盐胁迫生理实验证明，过表达MsCCD4可以增强毛状根的耐盐性。本研究为紫花苜蓿耐盐遗传改良提供基因资源及耐盐基因快速鉴定方法。     

无芒隐子草SAMS1基因的克隆及干旱胁迫下的表达分析

以无芒隐子草干旱诱导的cDNA文库中获得的一个与S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因同源性较高的EST序列为基础,采用RT-PCR技术克隆该基因全长序列(命名为CsSAMS1),该序列全长1 399 bp,编码397个氨基酸,具有SAMS基因的典型结构特征。无芒隐子草SAMS1蛋白为亲水性蛋白,无跨膜结构域,其空间结构主要由α-螺旋和无规则卷曲结构构成。与近缘植物SAMS的氨基酸序列多重比较分析表明,不同植物的SAMS的氨基酸相似程度非常高(92%~100%), 其中无芒隐子草与水稻的相似性最高(99%), 说明SAMS基因在植物进化中非常保守。CsSAMS1基因在无芒隐子草幼苗干旱过程中的半定量和实时定量RT-PCR表达模式分析均表明,干旱胁迫诱导该基因在根中大量表达, 叶中表达量变化不明显。CsSAMS1基因受干旱胁迫的诱导表达,为进一步探讨其应用于草类作物抗旱性的遗传改良奠定了基础。     

越冬时葎草雌雄株生理反应和再生策略的差异分析

以野生雌雄葎草为材料,通过测定越冬前(12月1日)、越冬中(1月15日)和越冬后(4月15日)雌雄株构件中可溶性糖(SS)、淀粉(ST)、丙酮酸(PA)含量和硝酸还原酶(NR)活性,测定越冬后构件存活率和再生率及再生构件性状与生物量分配比,分析雌雄株越冬时生理反应和再生策略的差异。结果表明:1)越冬前雄株叶片中ST含量小于雌株而SS含量大于雌株,其成熟茎和根的SS和ST含量均小于雌株(P<0.05),雄株通过提高叶中SS含量抵御寒冷,雌株通过转移糖分到茎和根应对寒冷;2)越冬前雄株叶和茎的PA含量显著大于雌株,根中含量显著小于雌株(P<0.05),构件中NR活性无性别差异(P>0.05),雄株通过增强茎和叶的呼吸抵御寒冷,雌株通过根储备营养应对寒冷;3)越冬后雌株再生叶的SS和ST含量大于雄株(P<0.05),PA含量和NR活性小于雄株,其再生代谢基础高于雄株;4)越冬时雄株植株存活率为26.67%,为雌株植株存活率的34.78%,雄株存活植株的茎存活率仅为雌株的32.24%,越冬后雌株茎、叶再生率仅为雄株的21.03%和23.82%,而花序再生率高达74.40%;5)雌株再生叶数和叶面积及再生茎长小于雄株(P<0.05),其再生茎和叶生物量分配比仅0.59%和1.31%,再生花序分配达98.09%,其再生花序柄和花序轴长及小花数大于越冬前正常花序,且萼片面积增大且生物量分配比占31.26%,总面积达624.92 cm²·株^-1,为再生叶总面积的24.50倍。越冬时雄株通过生理反应抵御寒冷,使茎和根贮藏物质低于雌株,故其存活率和再生率低于雌株。越冬后雄株再生生物量仅1.57 g·株^-1全部分配到营养器官,雌株再生总生物量达32.05 g·株^-1,且98.09%分配到花序,萼片代替叶片为主要光合器官,为花序形成和开花就近提供养分。