甘薯病毒病害(SPVD)的多重RT-PCR检测方法及其应用

根据甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)热激蛋白(Hsp70)基因和甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)外壳蛋白(CP)基因核苷酸序列的保守区域设计了4对引物,以单-RT-PCR反应体系为基础,分别对影响多重RT-PCR扩增的退火温度、Taq DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度、引物浓度等条件进行了优化,建立了能同时检测SPVD两种病原的多重RT-PCR方法.该方法能有效区分SPFMV的主要株系类型.灵敏性试验表明,建立的多重RT-PCR方法对SPFMV-CH2、SPFMV-CH和SPCSV的最低检测浓度分别为1.42×104、1.32×104拷贝/μL和2.47×104拷贝/μL.该方法可用于甘薯叶片和薯块中病毒的检测,为SPVD的监测预警提供了一个有用的工具.     

中国甘薯病毒种类的血清学和分子检测

 2009～2010年,从我国18个省（市）采集了176份表现病毒病症状的甘薯样品。利用血清学、PCR和核苷酸序列测定的方法,对上述样品中的病毒种类进行了鉴定。血清学检测结果表明,供试样品中甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）的阳性率最高,达56.3%,其次为甘薯G病毒（SPVG）和甘薯类花椰菜花叶病毒(SPCaLV),阳性率分别为34.1%和33.5%。PCR和核苷酸序列测定结果表明,我国甘薯上至少存在SPFMV、SPVG、甘薯潜隐病毒（SPLV）、甘薯褪绿斑病毒（SPCFV）、甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、甘薯脉花叶病毒（SPVMV）和甘薯卷叶病毒（SPLCV）8种病毒。此外,供试样品中没有检测出甘薯轻斑驳病毒（SPMMV）,是否存在甘薯轻斑点病毒(SPMSV)、SPCaLV和C 6病毒尚不能确定。     

利用小RNA测序技术鉴定吉林省甘薯病毒

在吉林省7个主要甘薯种植区共采集85份甘薯叶片样品,利用小RNA深度测序技术对混合样品进行检测,经RT-PCR和测序验证,鉴定出样品中存在10种病毒,包括6种RNA病毒和4种DNA病毒。分别是马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属的甘薯羽状斑驳病毒Sweet potato feathery mottle virus (SPFMV)、甘薯潜隐病毒Sweet potato latent virus (SPLV)、甘薯G病毒Sweet potato virus G (SPVG)、甘薯C病毒Sweet potato virus C (SPVC)、甘薯2号病毒Sweet potato virus 2 (SPV2);长线形病毒科毛形病毒属的甘薯褪绿矮化病毒Sweet potato chlorotic stunt virus (SPCSV);双生病毒科菜豆金色花叶病毒属的甘薯曲叶病毒Sweet potato leaf curl virus(SPLCV);玉米线条病毒属的甘薯无症状1号病毒Sweet potato symptomless virus 1 (SPSMV1);花椰菜花叶病毒科杆状DNA病毒属的甘薯杆状DNA病毒B Sweet potato badnavirus B (SPBV-B)和甘薯隐症病毒Sweet potato pakakuy virus (SPPV)。     

五种烟草病毒TMV、CMV、TEV、PVY及TVBMV的多重RT-PCR同步检测

 我国烟草病毒主要有烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草蚀纹病毒(TEV)、马铃薯Y病毒(PVY)和烟草脉带花叶病毒(TVBMV),通常发生复合侵染。本研究对我国5种烟草病毒的外壳蛋白基因部分序列设计引物,通过优化引物和模板浓度,摸索扩增参数,在一个体系中成功对5种病毒复合侵染的烟草材料进行多重RT-PCR扩增,得到237、273、347、456和547 bp共5条特异性条带,建立了能同时检测TMV、CMV、TEV、PVY和TVBMV的多重RT-PCR检测体系。对田间样品检测结果证明,多重RT-PCR体系能够同时检测5种病毒,并且灵敏度高。     

应用特异引物和简并引物检测百合斑驳病毒

应用特异引物和简并引物对百合斑驳病毒(LMoV)进行RT-PCR检测.结果表明,特异引物和简并引物均能从LMoV感病百合组织中扩增出与预期大小一致的目标片段,而健康组织无此扩增产物,简并引物还能从感染TBV的郁金香病叶中扩增出目标片段.将感染LMoV组织总RNA以10倍梯度稀释成不同浓度检测,特异引物检测的灵敏度为10-4,简并引物的灵敏度为10-3.对特异引物的PCR产物进行克隆和测序,序列分析表明与LMoV不同分离物的序列同源性为90%～99%,说明采用本研究确定的方法检测百合斑驳病毒结果准确可靠.     

湖北甘薯病毒病的检测与鉴定

2013—2015年采集了湖北黄冈、鄂州、武汉、荆州以及宜昌等5个地区的甘薯病毒病样品,通过双生病毒通用引物PCR扩增、ds RNA技术和序列分析等方法,鉴定了这5个地区甘薯病毒病的病原。结果显示,甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)、甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)和甘薯卷叶病毒(Sweet potato leaf curl Georgia virus,SPLCGV)等4种病毒被检出。其中,SPFMV SPLCGV这两种病毒在湖北皆为首次报道。     

侵染西瓜的5种病毒ZYMV、WMV、TMV、SqMV和CMV的多重RT-PCR检测体系的建立与检测应用

 根据5种病毒小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus,SqMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的核苷酸保守区序列,设计特异性引物对,从影响多重RT-PCR (mRT-PCR)扩增的引物浓度、Mg²⁺浓度、Taq DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、退火温度等方面进行反应体系的优化,建立了一种能够同时检测ZYMV、WMV、TMV、SqMV和CMV的多重RT-PCR技术体系,并进行了实际应用。在一个体系中对上述5种病毒复合侵染的西瓜材料进行多重RT-PCR扩增,得到与试验设计相符的5条特异性条带,依次是542、485、410、354和293bp。该体系实现了对侵染西瓜的5种病毒的同时检测,极大地提高了检测效率,降低了检测成本,体现了多重RT-PCR的优越性。     

4种葡萄卷叶伴随病毒多重RT-PCR检测

 葡萄受卷叶伴随病毒侵染后,树势减弱,抗逆性变差,果穗着色不良,成熟期推迟,含糖量降低。目前已报道11种葡萄卷叶伴随病毒(Grapevine leafroll-associated virus,GLRaV)。为提高检测效率,降低检测费用,本文在研究单个卷叶伴随病毒RT-PCR检测技术基础上,对4种葡萄卷叶伴随病毒的多重RT-PCR模板浓度、引物浓度和退火温度进行优化,建立了同时检测葡萄卷叶伴随病毒-1(GLRaV-1)、葡萄卷叶伴随病毒-3(GLRaV-3)、葡萄卷叶伴随病毒-4(GLRaV-4)和葡萄卷叶伴随病毒-5(GLRaV-5)的多重RT-PCR技术体系。模板浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、退火温度和循环次数对多重RT-PCR检测结果均有较大影响,而在一定范围内改变延伸时间和dNTP浓度对检测结果影响较小。对4种葡萄卷叶伴随病毒的PCR产物进行克隆和测序,扩增基因片段与GenBank中登录的基因序列同源性为95%~99%。所建立的多重RT-PCR技术检测田间样品效果良好。     

4种大豆种传病毒多重RT-PCR检测

进境大豆携带的病毒主要有菜豆荚斑驳病毒(BPMV)、烟草环斑病毒(TRSV)、烟草条纹病毒(TSV)和南方菜豆花叶病毒(SBMV)等,均为大豆种传病毒,可随大豆种子实现远距离传播。本研究对这4种大豆病毒的外壳蛋白基因部分序列设计引物,并通过优化引物、模板浓度和扩增参数,在一个体系中成功对4种病毒进行了多重RT-PCR扩增,得到307bp、206bp7、17bp5、18bp共4条特异性条带,建立了能同时检测BPMV、TRSV、TSV和SBMV的多重RT-PCR检测体系。该方法快速、灵敏、简便,同时特异性强,在出入境检疫中具有广泛的应用前景。     

马铃薯4种病毒多重PCR检测体系的建立

我国马铃薯病毒主要有马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯卷叶病毒(PLRV),常发生复合侵染。根据GenBank中4种马铃薯病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)基因全长设计引物,通过RT-PCR扩增得到4种病毒CP基因全长片段,测序结果显示序列同源性96%以上;针对4种病毒CP基因的保守序列分别设计引物,在一个PCR体系中同步对4种病毒进行扩增,得到421、202、516、330bp的特异性条带,优化建立了能同步检测PVY、PVX、PVS和PLRV的多重RT-PCR检测体系。检测结果证明优化后的多重RT-PCR体系能在田间样品中快速、高效地检测出4种病毒。     

翅果油树叶片中生物碱抑菌活性研究

采用酸性乙醇浸提翅果油树叶片中的生物碱,经硅胶柱层析纯化,所得生物碱对7种细菌和3种真菌进行抑菌作用试验。结果表明：翅果油树叶片中生物碱对细菌和真菌均有一定的抑制作用,对青枯菌的抑制作用明显强于对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制作用;对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和4种青枯菌（OD1、DB1、DC1和M5）的最低抑菌浓度分别为0.016、0.032、0.016、0.016、0.032、0.016 g/mL和0.016 g/mL;对根霉和青霉表现出较强的抑制作用,而对曲霉的抑制作用较弱。     

硬毛棘豆根的抑菌活性成分研究

为明确硬毛棘豆Oxytropis hirta Bunge根的农用抑菌活性成分,用75％乙醇浸提硬毛棘豆根,得到粗提物;再分别以石油醚、乙酸乙酯与正丁醇为溶剂对粗提物进行萃取,得到不同溶剂萃取相;通过活性追踪法对抑菌活性好的乙酸乙酯相运用现代柱层析与波谱学技术进行了分离与结构鉴定,并对所分离的化合物进行了抑菌活性评价.结...     

抑制植物病原细菌的植物筛选

以3种重要的植物病原细菌—辣椒青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri)和大白菜软腐病菌(Erwinia carotovorapv.carotovora)为供试菌,对43种植物甲醇提取物进行离体抑菌活性测定。研究结果表明,漆树对辣椒青枯病菌抑菌活性最强,其次是金秀清明茶;抑制柑橘溃疡病菌活性最高的植物有漆树和十大功劳;对大白菜软腐病菌没有筛选到抑菌活性较好的植物;垫状卷柏、七叶一枝花、少花龙葵、水半夏和豆瓣菜粗提物对3种植物病原细菌均无抑制作用。     

扁茎黄芪植株中化学成分的分离鉴定及其抑菌活性

为综合开发利用药用植物扁茎黄芪Astragalus complanatus,对其非药用部位的化学成分及抑菌活性进行了初步研究。采用硅胶柱层析和LH-20凝胶层析技术从扁茎黄芪植株中分离鉴定了7个化合物,并测定了各化合物对8种细菌的抑菌活性。根据波谱分析结果,7个化合物分别被鉴定为β-谷甾醇 (1) 、β-sitostenone (2) 、lawsaritol A (3) 、3β-羟基-5α,8α-桥二氧麦角甾-6,22-二烯 (4) 、3′,7-二羟基-2′,4′-二甲氧基异黄烷 (5) 、D-1-O-甲基肌醇 (6) 和沙苑子苷 (7) ,所有化合物均为首次从扁茎黄芪植株中分离得到。抑菌活性测定结果表明:化合物 5 对蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus、大肠杆菌Escherichia coli、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、白菜软腐病菌Erwinia carotovora、猕猴桃溃疡病菌Pseudomonas syringaepv.actinidiae和烟草青枯病菌Ralstonia solanacearum均有不同程度的抑制作用,其中对猕猴桃溃疡病菌、烟草青枯病菌和白菜软腐病菌的最低抑制浓度(MIC)分别为37.5、18.8和75.0 μg/mL。3′,7-二羟基-2′,4′-二甲氧基异黄烷 (5) 的农用抑菌活性为首次报道。     

链格孢菌抗植物病原真菌活性筛选

活性筛选是开发利用微生物资源的第一步,在生物农药、抗菌素及天然药物开发颇为急切的今天,对微生物抑菌活性的研究具有重要的理论和现实意义。本研究以水稻稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）、小麦雪腐病菌（Typhula incarnate）等10种重要植物病原真菌为研究对象,采用滤纸片法对云南西双版纳地区分离得到的20株链格孢菌（Alternariaspp．）进行抗菌活性筛选,获得对10种植物病原菌有广谱抗性的链格孢菌4株,编号分别为SWFC0364,10102,0845,5828,其中菌株0364的抑菌活性最强,对小麦雪腐、梨黑星、三七丝核的抑菌圈直径均达到2cm以上,该研究结果为活性物质的分离奠定了基础。     

1-酰基苯并咪唑酮酰胺衍生物的合成及其抗菌活性

以邻苯二胺和乙酰乙酸乙酯为起始原料制得异丙烯基苯并咪唑酮(Ⅲ),再经N-酰化反应得到13个苯并咪唑酮酰胺衍生物(Ⅳ-01～Ⅳ-13)以及由Ⅳ-02脱异丙烯基的产物Ⅳ-02a,其中9个为未见文献报道的新化合物。通过核磁共振氢谱和碳谱、质谱以及元素分析对其结构进行了表征。抑菌活性测定结果表明,化合物Ⅳ-01～Ⅳ-03、Ⅳ-11及Ⅳ-02a对供试病原细菌和真菌均表现出明显的抑菌活性,其中化合物Ⅳ-02和Ⅳ-02a尤为突出,且二者活性相近,其中Ⅳ-02对蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus(1.184 6)、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(1.88)、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus(1.89)和大肠杆菌Escherichia coil(1.157 4)的MIC(抑制生长的最低浓度)值分别为0.78、12.5、1.56和1.56 μg/mL,对番茄灰霉病菌Botrytis cinerea的有效抑制中浓度(EC50)为7.02 μg/mL。     

7种杀菌剂对姜瘟病菌Z-AQ-2菌株的抑菌活性

青枯菌4号生理小种引起的姜瘟病是我国生姜生产上的巨大障碍。本研究以分离自5种不同寄主的8株青枯菌为研究对象,采用最小抑制浓度法(MIC)评价了它们的铜抗性水平,发现分离于山东安丘的4号小种Z-AQ-2菌株的铜抗性水平最高,为1.6mmol/L;采用生长速率法测定了7种常用杀菌剂对Z-AQ-2菌株的室内毒力,结果表明:3%中生菌素可湿性粉剂对姜瘟病菌的抑菌活性最高,其EC50为5.2mg/L,其次为6%寡糖·链蛋白可湿性粉剂,EC50为21.2mg/L,20%叶枯唑可湿性粉剂在3种不含铜的农药中EC50值最高,为58.7mg/L,4种铜制剂抑菌效果相对较差,EC50为51.5~148.7mg/L;进一步采用Colby法评价了叶枯唑与氢氧化铜、叶枯唑与中生菌素以及中生菌素与氨基寡糖素的混用效果,结果表明:三组药剂的混用均可产生增效或加成效果。     

油茶炭疽病拮抗细菌Y13主要抑菌物质分离纯化及作用方式

油茶内生拮抗细菌Y13是一株对油茶炭疽病菌有较强抑制作用的枯草芽胞杆菌。为了确定其抑菌物质的成分组成及其对油茶炭疽病菌的作用方式,本文通过乙醇沉淀、固相萃取、反相高效液相色谱法及LC MS对抑菌物质进行分离鉴定。一共分离纯化出16个活性组分,保留时间在10.5~26.0 min的8个组分对于油茶炭疽病菌产生明显的抑菌圈,其中保留时间为11.0 min处的色谱峰抑菌效果最强,经质谱初步鉴定确定该化合物的分子量为1 042.56 u;保留时间在27.5~39.5 min的8个组分导致油茶炭疽病病原菌菌丝颜色加深,其中以保留时间37.5 min处的色谱峰效果最为明显,质谱鉴定该化合物的分子量为1 480.85 u。显微观察发现它们通过导致菌丝断裂、畸形、原生质凝集的方式抑制菌丝生长;通过使孢子畸形、膨大、消融而抑制孢子萌发。     

Identification and use of a wild plant with antimicrobial activity against Ralstonia solanacearum, the cause of bacterial wilt of potato

Fresh aerial tissue and roots of 14 wild plants in Okinawa prefecture were investigated for their antimicrobial activity against Ralstonia solanacearum , which causes bacterial wilt of potato. A 70% aqueous ethanol extract of fresh aerial tissue of Geranium carolinianum L. showed strong antimicrobial activity against R. solanacearum . This extract also showed antimicrobial activity against the pathogens causing common scab of potato and soil rot of sweet potato. The antimicrobial substance could be extracted with hot water, and was effective against R. solanacearum in soil. In the field test, a treatment combining incorporation of dried aerial tissue into the soil and solarization was highly effective for control of bacterial wilt of potato. These findings suggest that G. carolinianum L. could be used as a biological agent for the control of bacterial wilt of potato.     

杜仲内生真菌中抗玉米纹枯病活性菌株的筛选

对杜仲植物中的内生真菌进行分离纯化, 共得到 32株菌株。以玉米纹枯病菌为指示菌, 对杜仲内生真菌进行对峙培养法、菌丝生长速率法以及盆栽控病试验等研究。研究结果显示, 内生真菌DZGS08对玉米纹枯病菌具有较好的拮抗作用, 抑菌带宽度大于10 mm; 其菌丝生长速率试验显示DZGS08的发酵液抑菌率达到50.44 %; 且玉米盆栽试验结果表明, 菌株DZGS08发酵液对玉米纹枯病的防治效果为34.03%。显微观察结果表明, 拮抗菌株DZGS08能造成病原菌菌丝扭曲、畸形等现象。随后, 对该菌株的ITS 序列进行测定分析, 序列分析和聚类结果表明该菌株为梭孢壳属( Thielavia )的真菌。