基于SNP标记的桃矮化基因精细定位

【目的】矮化型桃树体矮小、节间短,是盆栽观赏和砧木育种的重要遗传资源。明确矮化性状形成的遗传机制并对桃矮化基因进行精细定位,是建立目标性状分子辅助选种体系和遗传改良的前提,可为有目标的选育矮化观赏桃和砧木品种奠定基础。【方法】以‘05-2-144’(‘97矮’ב鸳鸯垂枝’桃)套袋自交获得的395个后代单株构建的分离群体为材料。参考桃基因组信息并基于Sanger技术开发的SNP标记对亲本和后代单株进行分析,在扩大群体单株中进行连锁关系分析,确定连锁的SNP标记,初步定位目标基因。在定位区域内基于二代测序技术开发更多的基因型和表型一致的SNP标记,对后代单株进行基因分型,完成目标性状的精细定位。然后在精细定位区域内开发SNP标记,即杂交群体双亲均为Aa杂合基因型,对‘10-7’ב96-5-1’杂交后代89个单株进行分子鉴定,以验证基因定位结果的准确性。【结果】通过对桃单株‘05-2-144’自交后代实生苗表型鉴定表明,普通型和矮化型单株数分别为300株和95株,性状分离比例接近3﹕1(P值为0.67;χ2为0.19),符合孟德尔遗传规律,桃矮化性状受隐性单基因控制。用于分子鉴定的单株来源于‘10-7’(普通型)ב96-5-1’(普通型)杂交组合,共获得89个后代单株,其中普通型66株;矮化型23株(P值为0.854;χ2为0.034)。基于Sanger测序技术开发了SNP标记,在桃基因组数据库Pp06上25 230 425 bp和27 191 090 bp处获得了连锁的SNP标记,且目标基因位于这两个标记的右侧,初步获得了连锁的SNP分子标记。在此基础上,对亲本进行66.89X深度测序,继续开发符合Aa杂合基因型的SNP标记位点。根据参考基因组和物理距离区间共设计了15对SNP引物,其中12对引物与重测序结果中SNP的类型一致,3对引物与重测序结果中SNP的类型不一致,连锁标记的基因分型成功率为80.0%。通过基于SNP基因分型分析,最终完成了目标性状的精细定位,位点位于Pp06的28 712165 bp(引物为JXSNP-5)和28 899 661 bp(引物为JXHRM-SNP-3)之间,遗传距离分别为0.38 c M和0.13 c M,物理距离约为277 kb,精细定位区域内有54个已知转录本。在定位区域内桃基因组Pp06的28 108 436 bp处和29 247 763 bp处开发SNP标记用于杂交后代表型的鉴定,结果表明所有后代单株基因型和表型鉴定结果完全一致,鉴定准确率为100%。【结论】本研究精细定位了桃矮化基因,物理距离约为277 kb,为基因克隆、亲本早期筛选以选育矮化观赏桃和砧木品种等奠定了基础。     

基于CAPS标记的西瓜果实与种子相关性状QTL分析

【目的】基于西瓜全基因组重测序数据,挖掘SNP位点并将其转变为CAPS标记,构建遗传连锁图谱,对西瓜果实与种子相关性状进行QTL分析,为西瓜果实与种子相关性状主效基因精细定位及克隆奠定理论基础。【方法】以普通栽培西瓜品系(Citrullus lanatus ssp.vulgaris)‘W1-1’和黏籽西瓜品系(Citrullus lanatus ssp.mucosospermus)‘PI186490’为亲本杂交获得F_1代,以‘W1-1’为轮回亲本,构建BC_1P_1群体。采摘成熟果实,对每个西瓜果实中心及边缘可溶性固形物、中心及边缘果肉硬度、种子百粒重、种皮底色进行调查及数据分析。对亲本材料进行覆盖度约为20×的全基因组重测序,用BWA、SAMTOOLS及VCFTOOLS等软件比对并检测亲本材料在全基因组范围内的SNP位点。运用SNP2CAPS软件选择7种在西瓜基因组上具有丰富酶切位点的限制性内切酶,对包含SNP位点的序列进行酶切位点分析,转化CAPS标记。选取全基因组范围内均匀分布的450个CAPS分子标记,筛选多态性CAPS标记,对BC_1P_1群体内225株分别进行基因分型,使用QTL Ici Mapping及Windows QTL Cartographer V2.5等软件进行遗传图谱的构建和西瓜果实与种子相关性状的QTL分析。【结果】在两亲本间共获得SNP位点751 532个,根据7种限制性内切酶位点信息共开发了450个CAPS分子标记,筛选出其中具有多态性的200个CAPS标记,在225株BC1P1群体构建一张包含11个连锁群(分别对应11条染色体)的遗传连锁图谱,覆盖长度1 376.95 c M,标记间的平均遗传距离为6.88 c M。QTL分析定位到与果实与种子相关性状QTL位点15个,其中包括中心可溶性固形物含量相关位点3个(CTSS2.1、CTSS2.2、CTSS8.1);边缘可溶性固形物含量相关位点1个(ETSS2.1);中心果实硬度相关位点3个(CFF6.1、CFF6.2、CFF8.1);边缘果实硬度相关位点2个(EFF6.1、EFF6.2);种皮底色相关位点4个(SCC8.1、SCC8.2、SCC8.3、SCC8.4);种子百粒重相关位点2个(SHW6.1、SHW9.1)。15个QTL位点的贡献率范围为5.25%—74.59%,贡献率大于15%的位点有5个(CTSS8.1、SCC8.1、SCC8.2、SCC8.3、SCC8.4)。【结论】共开发出SNP位点751 532个,QTL分析检测到西瓜果实与种子相关性状QTL位点15个,其中主效QTL位点5个,分别为果实中心可溶性固形物及种皮底色相关位点(CTSS8.1、SCC8.1、SCC8.2、SCC8.3、SCC8.4),为进一步精细定位及克隆西瓜果实与种子优良性状基因奠定了基础。     

‘鲁丽’ב红1#’苹果杂交群体全基因组KASP标记开发及验证

【目的】利用‘鲁丽’ב红1#’亲本及杂交后代,开发苹果叶片性状竞争性等位基因特异PCR(kompetitive allele-specific PCR,KASP)标记,为苹果光能高效利用育种提供参考。【方法】以‘鲁丽’和I型红肉苹果‘红1#’及其134个杂交后代的幼嫩叶片为材料,调查叶片性状表型（包括叶片长度、宽度、叶绿素含量、花青苷含量、光合参数和叶绿素荧光参数等）数据。采用Illumina HiSeq 2500测序平台进行全基因组重测序,通过短序列比对软件将测序序列（reads）回贴到苹果参考基因组,利用GATK软件工具包检测单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNP）标记。【结果】‘鲁丽’和‘红1#’及其134个杂交后代重测序得到有效reads数分别为164 776 660、149 482 876和3 927 370 200。与苹果参考基因组比对率分别为98.77%、98.89%和97.79%。共检测到6 445 766个SNP。经过滤后获得94 208个特异性强,准确性高的SNP位点。对每个SNP进行KASP引物设计,最终开发了5...     

基于SNP标记桃抗蚜性状的基因定位

【目的】挖掘与桃抗蚜性状紧密连锁的SNP位点及候选基因,为桃抗性分子标记辅助选择育种奠定基础,并为进一步揭示桃抗蚜性状的遗传基础和分子机制提供依据。【方法】以来源于‘粉寿星’的抗蚜桃‘01-77-3’为母本,栽培品种‘中油桃13号’为父本,杂交获得F1代分离群体进行基因定位。以‘96-5-1’(抗蚜)为母本,‘10-7’(感蚜)为父本杂交获得F1分离群体作为验证定位位点准确性的材料。参考桃基因组序列(Prunus persicaGenome v2.0.a1)开发基于Sanger测序的SNP标记,在亲本(‘01-77-3’‘中油桃13号’)及各4个子代中PCR扩增后进行Sanger测序,获得候选SNP后,扩大群体验证,实现对抗性基因的初步定位。对亲本(‘01-77-3’‘中油桃13号’‘96-5-1’‘10-7’)进行覆盖度约为70×的全基因组深度测序,并基于重测序数据,在初定位区间内开发基于Sanger测序与HRM分析的SNP标记,筛选多态性标记,对‘01-77-3’ב中油桃13号’杂交后代141株实生苗进行基因分型,以获得与桃抗蚜型基因紧密连锁的分子标记。通过双亲(‘96-5-1’‘10-7’)表型与基因型一致,在精细定位区间内开发与桃抗蚜性状紧密连锁的In Del位点,以验证In Del标记与抗蚜表型是否连锁。最后,参考桃基因组分析定位区间的候选基因。【结果】通过人工接种观察蚜虫对桃F1后代单株新梢危害表明,抗蚜与感蚜比例接近1﹕1(P值为0.556;χ~2为0.348),符合孟德尔遗传规律。基于Sanger测序结果,初步将抗蚜基因定位在桃基因组Pp01_38011783与Pp01_47231340之间,物理距离约为9.22 Mb。亲本全基因组深度测序分别产生Clean data 17.109 Gb,平均覆盖度为75.19×,在Pp01初定位区间内开发基于HRM与Sanger测序的SNP标记共29对,筛选后得到11对紧密连锁的标记。基因分型结果表明,与桃抗蚜基因紧密连锁的标记位于桃基因组Pp01的45.66 Mb和46.12 Mb处,Pp01_45.66处等位基因为T和C,Pp01_46.12处等位基因为G和C,遗传距离分别为1.4 c M、2.1 c M;与抗蚜基因完全连锁的标记SNP_Pp01_45712702,位于桃基因组Pp01_45.71处,等位基因为G和T。基于亲本(‘96-5-1’‘10-7’)重测序数据,在精细定位区间内开发紧密连锁的In Del标记KYYZ_Pp01_45799758,位于Pp01_45.79处。对验证群体92个单株进行PCR扩增,经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表明,仅1个单株基因型与表型不符,分子鉴定准确率为98.91%。【结论】利用亲本深度测序与SNP标记技术相结合的方法,精细定位了控制桃抗蚜性状的基因,将抗蚜基因缩小到物理区间460 Kb内,共包含56个转录本,包括52个候选基因。     

普通小麦籽粒过氧化物酶活性全基因组关联分析

【目的】小麦籽粒过氧化物酶(peroxidase,POD)活性对面制品加工品质有重要影响,发掘控制籽粒POD活性重要位点,并筛选其候选基因,为小麦品质的改良奠定基础。【方法】以151份黄淮冬麦区和82份北部冬麦区品种(系)为材料,分别利用来自于小麦90 K SNP芯片的18 189和18 417个高质量SNP标记,对POD活性进行全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS)。【结果】供试材料中POD活性表现出广泛的表型变异和多样性,黄淮麦区材料的POD活性变异系数为15.4%—21.8%,遗传力为0.79,北部麦区材料的POD活性变异系数为15.0%—19.9%,遗传力为0.82。相关性分析表明,不同环境之间材料的POD活性表现出显著的相关性,黄淮麦区相关系数为0.46—0.89(P0.0001),北部麦区相关系数为0.50—0.87(P0.0001)。多态性信息含量PIC值为0.09—0.38,最小等位基因频率MAF值为0.05—0.5。群体结构分析表明,黄淮麦区与北部麦区2个自然群体结构简单,均可分为3个亚群。GWAS分析结果表明,在黄淮冬麦区材料中共检测到20个与POD活性显著关联的位点(P0.001),分布在1A、2A、2B、2D、3A、3B、3D、4A、4B、5A、5B、6A、6D和7A染色体上,单个位点可解释7.8%—13.3%的表型变异。在北部冬麦区材料中共检测到20个与POD活性显著关联(P0.001)的位点,分布在1A、1B、1D、2A、2B、2D、3A、3B、4B、6A、6B、7A、7B和7D染色体上,单个位点可解释14.4%—23.2%的表型变异。加性回归分析表明,随着优异等位基因数量的增多,小麦籽粒POD活性越高。在发现的所有POD活性相关位点中,2个位点在黄淮麦区和北部麦区材料中均能检测到且稳定遗传,可将其转换为STARP(semi-thermal asymmetric reverse PCR)或CAPS标记,以应用于分子标记辅助育种。获得3个与POD活性有关的候选基因,分别编码磷酸甘露糖变位酶(PMM-D1)、辣根过氧化物酶(PER40)和烷基氢过氧化物还原酶(F775_31640)。【结论】黄淮麦区与北部冬麦区2个自然群体遗传多样性丰富,群体结构简单,适用于全基因组关联分析。在2个自然群体中分别发现20个POD活性位点,并在显著相关的位点区域内筛选到3个候选基因。含有越多优异等位变异的材料其POD活性越高。     

新疆褐牛基因外显子多态性及其与SCS和泌乳性状关联性分析

【目的】探索ERAP2,Cwc27,PPFIBP2,THADA,ZNF804B和AMHR2基因多态性与新疆褐牛体细胞评分及泌乳性状的相关性,旨在寻找与新疆褐牛体细胞评分及泌乳性状相关的分子标记。【方法】以新疆乌鲁木齐种牛场、新疆天山畜牧生物工程股份有限公司共169头新疆褐牛母牛为试验对象,以2008—2015年间的生产性能测定记录(包括乳脂率、乳蛋白率、总固体含量、乳糖率和体细胞计数等)和305 d产奶量为试验数据,基于课题组前期15头中国荷斯坦牛DNA混池重测序的结果筛选外显子区域10个SNPs,采用基质辅助激光电离飞行时间质谱法(sequenom mass Array genotype)分型技术验证10个SNP位点的遗传多态性,运用SAS8.1软件GLM过程对这10个SNP突变与新疆褐牛体细胞评分(SCS)、305 d产奶量、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率和总固体的关联程度进行统计分析。【结果】10个SNP位点均具有多态性,χ~2检验表明群体中9个SNP位点符合Hardy-Weinberg平衡状态。关联分析结果表明ERAP2基因两个位点(T98741711C和G98736141A)均与新疆褐牛305 d产奶量达到极显著关联(P0.001),其中TT型和GG型个体的产奶量最高;PPFIBP2(C45667492G)位点与新疆褐牛乳糖率达到显著关联(P0.005),其中GG型个体的乳糖率最高;Cwc27(T14533269A)位点与新疆褐牛乳脂率和总固体含量达到显著关联(P0.005),与SCS达到极显著关联(P0.001),其中TT型个体的乳脂率和总固体含量均最高,AA型个体的SCS极显著高于AT和TT型;AMHR2(C26758055G)位点与新疆褐牛乳蛋白率和总固体含量达到极显著关联(P0.001),其中GG型个体显著高于CC和GC型个体。连锁不平衡分析与单倍型构建的结果发现10个SNPs构建了两个单倍型模块,其中SNP1和SNP2位点之间处于连锁不平衡状态(r20.3),SNP4和SNP10位点之间处于强连锁不平衡状态(r20.6),随后分析了单倍型与SCS和泌乳性状之间的相关性,发现单倍型与新疆褐牛SCS和泌乳性状无显著关联(P0.001)。【结论】初步发现了ERAP2,Cwc27,PPFIBP2和AMHR2与新疆褐牛SCS和泌乳性能相关,结果可为新疆褐牛产奶性状的分子标记辅助选育提供参考和依据。     

玉米株型相关性状的全基因组关联分析

【目的】玉米株型性状与植株产量、光合效率、抗倒性等密切相关,是理想株型设计育种的基础,通过对玉米多个株型相关性状进行全基因组关联分析,构建玉米理想株型,为抗倒伏、耐密性的玉米新品种选育提供理论基础。【方法】以284份温带、亚热带和热带材料组成的关联群体为研究对象,在郑州与浚县2个环境下对玉米总叶片数（LN）、穗上叶片数（LNAN）、穗上叶片数与总叶片数比值（LNAN/LN）、株高（PH）、穗位高（EH）、穗位高与株高的比值（EH/PH）等6个玉米株型相关性状进行调查,借助覆盖玉米全基因组约56万个SNP标记,进行全基因组关联分析,以期为玉米新品种的选育提供理论依据。【结果】2个环境下,6个性状均表现为正态分布;大多数性状之间均存在高度正相关或负相关;方差分析表明这6个株型相关性状的基因型与环境以及基因型×环境的互作均达到显著水平。在选择最优关联分析模型时,发现Q模型假阳性较高,Q+K模型对假阳性的控制过于严格,而K模型的表现最好;在2个环境下,全基因组关联分析（K模型）共检测到56个显著SNP-性状关联（P≤3.99E-6）,这些SNPs共涉及5个性状的17个位点,每个位点解释的表型变异从7.97%-10.56%不等。同时发现有4个位点能够在2个环境中同时被检测到,表明这4个位点受环境影响较小,在不同环境下可以稳定存在。通过对显著关联的SNP上下游各50 kb范围内候选基因进行搜索,共发现80个候选基因,其中42个具有功能注释。例如,与株高和穗位高显著相关的基因GRMZM2G161293编码一个具有乙酰葡糖转移酶活性的蛋白,该酶催化UDP-N-乙酰氨基葡萄糖生成糖过程中的N-乙酰葡糖氨基残基的转移,可能通过影响玉米籽粒可溶性糖含量进而影响产量,推测其为最可能的候选基因。【结论】K模型对假阳性的控制效果最好,基于K模型的GWAS结果,一共检测到17个株型性状相关的位点。     

G.41×新疆野苹果树体生长性状的QTL精细定位及候选基因预测

【目的】矮化砧木可以诱导地上部接穗品种矮化,实现苹果的丰产和稳产。因此,深入挖掘调控苹果树体生长的基因,可以改善苹果树形,加强苹果园地的管理方便性。【方法】以矮化苹果砧木‘G.41’和乔化苹果砧木新疆野苹果(Malus sieversii)为亲本构建的188株F1代分离群体为试材,并于每个分离群体植株上嫁接‘富士冠军’。基于SSR标记技术,采用Join Map 4.0作图软件构建苹果遗传连锁图,应用Map QTL 5.0作图软件,结合后代群体的表型数据,对接穗高度和接穗横截面积生长性状进行初步QTL定位。结合苹果基因组序列信息,利用Primer5.0软件进行新SSR标记开发,并对初步定位区域进行精细定位及候选基因预测。【结果】该研究从361对SSR引物中筛选出108对在亲本之间表现出多态的SSR引物,多态率为29.9%。其中95对引物用于遗传连锁图谱构建,并在5号连锁群上初步检测出4个与植株生长性状相关的QTL位点,与接穗高度、接穗横截面积性状紧密连锁的两个标记,为L05024和Hi09b04。根据初步定位区域的序列信息,设计了新的SSR引物24对,其中在亲本间表现出多态的有10对,利用该10对引物对5号连锁群重新分析。构建了包含21个SSR标记、总长为86.0 c M的高密度遗传图谱,其平均遗传距离为7.52 c M。通过对接穗高度与接穗横截面积生长相关性状的QTL分析,在SSR标记L05024和Hi09b04之间找到与其相关的QTL位点,其表型贡献率分别为19.2%和51.7%。将该QTL位点与基因组序列对比,发现其物理距离为543 kb,并且该QTL区间包含16个候选基因。推测其中MDP0000323212为与植株生长密切相关的基因。【结论】本研究将砧木诱导矮化基因定位于苹果第5号染色体543 kb区段内,侧翼标记分别为L05024和Hi09b04,其物理距离为4.048—4.591 Mb,并筛选到可能参与调控植株生长的候选基因MDP0000323212。     

家兔XKR4基因遗传多态性及其与生长性能的相关性

【目的】研究家兔XKR4基因的遗传多态性,并分析其与家兔生长速度的相关性。【方法】以新西兰兔(184只)和伊拉兔(193只)为研究材料,取其耳部组织,提取DNA,PCR扩增XKR4基因,采用直接测序法寻找CDS区单核苷酸多态性(SNP)位点,利用HRM技术对突变位点进行分型,并分析其与生长性状的相关性。【结果】在家兔XKR4基因内检测到3个SNP位点(内含子1中的c.804-8CT及外显子3中的c.1668CT和c.1698CT)。针对外显子3中的2个SNP位点,对40个样本直接测序,结果发现仅存在CC和CT 2种基因型,且处于完全连锁状态。对2种兔突变位点的群体遗传参数分析发现其总杂合度为0.287 1,总有效等位基因数为1.402 7,多态性属于中等多态,表明该群体在该位点的遗传变异较高,有较大的选择潜力,可以利用该位点进行与生长性状相关的标记辅助选择。关联性分析发现,CTCT单倍型个体70日龄体质量显著高于CCCC单倍型个体(P0.05),且35到70日龄平均日增重极显著高于CCCC单倍型个体(P0.01)。【结论】XKR4基因可作为影响家兔生长性状的候选基因。     

乌珠穆沁绵羊RIPK2基因多态性与生长性状的关联

【目的】基于前期绵羊肉用性状GWAS研究结果,旨在探讨RIPK2基因对乌珠穆沁绵羊生长性状的影响,找到该基因中与绵羊生长性状相关的分子标记,同时对GWAS结果进行验证。【方法】在343只乌珠穆沁绵羊试验群体中,选取其中30个个体的血液DNA样本,以相同浓度组成池DNA,设计引物对RIPK2基因外显子及其上下游1 000bp的调控区进行PCR扩增,PCR产物检测为目的条带后测序。使用DNAMAN和Chromas2软件对测序峰图进行分析,采用飞行质谱方法对检测到的SNP位点及前期GWAS得到的SNP位点进行基因型分型。使用Haploview软件对多态位点构建单倍型及连锁不平衡分析。使用SPSS （22.0）软件进行RIPK2基因SNP位点与生长性状间的关联分析。【结果】共发现了4个多态位点,A5536G的同义突变rs01位于第四外显子内,在该位点检测到三种基因型,AA基因型频率为0.42,AG基因型频率为0.45,GG基因型频率为0.13,优势等位基因为A,其频率为0.65;在第七外显子上检测到T8952C错义突变rs02,在该突变位点检测到3种基因型,其中TT基因型频率为0.82,TC基因型频率为0.16,CC基因型频率为0.02,T为优势等位基因,基因频率为0.9;在第十外显子检测到 T2836C的突变rs05,在该位点检测到两种基因型TT和CC,没有检测到杂合子基因型,TT基因型频率为0.25,CC基因型频率为0.75;上游调控区发现一个G5181C的突变rs30,有3种基因型,其中GC基因型频率为0.50,CC基因型频率为0.18,GG基因型频率为0.32,G为优势等位基因,其频率为0.58; GWAS得到的SNP位点是T4456C,在本研究中被命名为rs34,在该位点有3种基因型,其中TT基因型频率为0.49,TC基因型频率为0.37,CC基因型频率为0.14,优势等位基因T的频率为0.68。χ²适合性检验发现,除rs34位点外,其余位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05)。rs02位点处于低度多态(PIC＜0.25),其余位点处于中度多态(0.25＜PIC＜0.5)。连锁不平衡分析发现,rs01和rs02位点强连锁,在群体中共构建了3种单倍型,AT 为优势单倍型,其频率为0.645,这两个位点共构建了6 种基因型组合,其中AATT为优势基因型组合,频率为0.425。单标记关联分析表明：rs01位点的AA、AG基因型的个体和GG基因型个体在4月龄体重、胸围上差异显著（P＜0.05）,在6月龄体高、胸围上差异显著(P＜0.05)。rs02位点CC基因型个体在4月龄体重、体高、胸围和6月龄胸宽上显著优于TT、TC基因型个体（P＜0.05),在4月龄体斜长、6月龄体高和体斜长上极显著优于TT、TC基因型的个体（P＜0.01）。rs30位点上,GG基因型的个体在4月龄体重、胸围与其他两种基因型个差异显著(P＜0.05),3个基因型的个体在6月龄胸围上均有显著差异（P＜0.05）。rs34位点的3个基因型的个体仅在4月龄体重上差异显著(P＜0.05)。rs01-rs02组合基因型关联分析发现：GGCC基因型组合的个体在4月龄体重、体高、体斜长、胸围上与其他基因型之间差异显著（P＜0.05）,GGCC基因型组合的个体在6月龄体高、体斜长、胸宽上与其他基因型组合的个体差异显著（P＜0.05）。【结论】RIPK2基因对绵羊生长性状具有较显著的影响,其SNPs作为分子标记对乌珠穆沁绵羊生长性状的选育具有一定的指导意义。     

葡萄无核性状的SSR新分子标记开发及应用

【目的】开发葡萄无核性状的SSR新分子标记,对葡萄杂种后代进行早期无核性状鉴定,为分子标记辅助育种奠定基础。【方法】对母本‘红地球’与父本‘森田尼无核’及F₁代杂交群体的133份葡萄材料进行RAD-seq,将测序结果比对到参考基因组上;运用SAMtools软件生成CaSFS软件所需的pileup和glf文件,过滤获得亲本之间的有效SNP集;采用窗口滑动的方法,确定每个窗口的基因型,选择以每15个SNP为一个窗口,每次滑动一个SNP,得到每个个体的基因型并生成bin图;对生成的bin图采用拟测交的方式利用Joinmap软件进行连锁分析,构建‘红地球’与‘森田尼无核’遗传连锁图谱;用WindowQTLCartographer2.0软件进行QTL定位,在定位区间通过Perl程序语言找到符合SSR特征序列的35个SSR分子标记,用Primer premier5.0软件设计35个SSR分子标记引物对,通过HRM技术筛选亲本之间在无核性状上存在差异的SSR分子标记,并在131株F₁代杂交群体及65个葡萄品种的自然群体中检测无核分型正确率、无核检测率、无核保持率。【结果】在‘红地球’与‘森田尼无核’构建的遗传连锁图谱上,将葡萄无核性状定位在chr18号染色体上,定位区间26 835 846-26 960 426,对无核的贡献率为77.9%,LOD阈值为26.3。亲本之间在无核性状上存在差异的SSR分子标记为VvSD10,其在111 bp等位点能对葡萄无核性状进行鉴定,利用分子标记VvSD10上的111 bp等位点通过HRM技术在葡萄F₁代杂交群体及自然群体中进行葡萄无核性状的鉴定。结果表明,分子标记VvSD10在F₁代杂交群体及自然群体中的无核分型正确率分别为97%、94%,其无核检测率均为56%,无核保持率分别为77%、85%。【结论】分子标记VvSD10在遗传群体及自然群体中的无核分型均能提供较高的准确信息,为无核葡萄的分子标记辅助育种奠定了基础。     

基于HRM获得与桃Tssd紧密连锁的SNP标记

【目的】植物中,SNP标记具有分布广泛、分辨率高、共显性和多态性高等特点,是遗传研究的常用分子标记。桃全基因组测序完成,获得了大量SNP位点。利用现有的SNP数据进行简单、快速的SNP基因分型是基因定位、品种鉴定和图谱构建等后续研究的基础。文章拟建立采用高分辨率熔解曲线进行不同类型SNP的基因分型方法,以获得与桃温度敏感半矮生型基因紧密连锁的分子标记。【方法】以普通生长型(ST)单株97-32-46为母本,温度敏感半矮生型单株03-94-2(Tssd)为父本进行人工杂交,利用其分离群体96个后代单株为研究材料。在定位目标基因的区间内开发连锁和不同类型的SNP标记的基础上,采用高分辨率熔解曲线进行SNP的基因分型并获得与目标性状紧密连锁的SNP标记。【结果】明确了DNA模板和Mg~(2+)是影响基因分型的关键因子,并确立了反应体系最佳浓度区间。在15μL反应体系中模板DNA的量低于5.0 ng时或Mg~(2+)浓度低于1.6μmol·L~(-1)时则不能完成PCR扩增和基因分型;根据亲本基因型和表型一致的SNP位点设计引物,扩增片段长度在140 bp左右。高分辨率熔解曲线分析可对由单个核苷酸变异引起的4种不同类型的SNP(A/T、A/G、A/C和C/G)进行基因分型,并正确区分了温度敏感半矮生型和普通生长型,与进行Sanger测序鉴定的结果一致。采用96孔板对温度敏感半矮生型和普通生长型各48个分离后代单株进行了PCR扩增和基因分型,确定了遗传距离。分型结果表明高分辨率熔解曲线分析技术可以将96个样杂交后代单株分为温度敏感半矮生型和普通生长型2种,正确地区分了A/A基因型和A/T基因型。在96个样品中仅1个没有成功扩增,在温度敏感半矮生型和普通生长型中各存在1个重组单株。获得与温度敏感半矮生型基因紧密连锁的SNP标记,遗传距离为2.11 cM。【结论】建立了基于高分辨率熔解曲线分析的SNP基因分型。尽管高分辨率熔解曲线分析技术无法区分两种不同纯合类型的SNP变异,但仍不失为区分已知变异SNP的有效方法。在已经获得桃大量SNP的基础上,该体系可用于桃的基因定位、遗传多样性和品种鉴定等研究。     

利用大白菜×芜菁F2群体定位抗根肿病QTL及上位性互作分析

【目的】挖掘和分析芸薹种抗根肿病基因及基因间的互作关系,为芸薹种抗根肿病育种提供理论依据。【方法】以大白菜自交系‘BJN’为母本,芜菁自交系‘Siloga’为父本进行杂交获得F₁。F₁单株自交获得由140个单株构成的F₂群体,用于遗传图谱构建。95个F₂单株及其F₃家系用于抗根肿病（CR）性状的QTL定位和上位性互作分析。利用1 214个分子标记和前人开发的与7个CR连锁的22个标记进行亲本间多态性筛选。根据作图群体的多态性标记基因型,采用JoinMap 4.0作图软件构建遗传连锁图谱。以采自甘蓝型油菜栽培地的根肿菌对2个亲本及其95个F_2：3家系进行根肿病抗性鉴定。根据F₃植株的发病等级,计算F₂单株的平均发病指数（DI）。利用Windows QTL Cartographer 2.5软件,采用复合区间作图法检测抗根肿病QTL。利用基于混合线型模型的QTL Network 2.0软件进行互作关系分析。SPSS 18.0.0软件用于分析F₂群体中QTL连锁标记的基因型与其相应个体平均DI值间的相关性。双因素方差分析方法分析QTL连锁标记的交互作用。通过单因素方差分析,采用最小显著差异法和q检验（SNK）多重比较QTL紧密连锁标记（sau_um026和BrID90197)组合成的9种基因型在根肿病抗性上的差异。【结果】抗病性鉴定表明‘Siloga’对根肿菌表现为抗病,而‘BJN’表现为感病。F₂群体中根肿病发病指数呈偏正态分布,表明根肿病抗性表现为由主效基因存在的多基因控制的数量性状。利用检测到的261个多态性标记构建出一个包含222个标记和10条连锁群的芸薹种遗传图谱。该图谱总长度为1 152.6 cM,定位了与3个CR连锁的5个标记,覆盖了大白菜参考基因组的88.6%。通过QTL定位共检测到源于‘Siloga’的2个QTL位点,分别位于A3连锁群的主效QTL（qPbBa3.1）和A8连锁群的微效QTL（qPbBa8.1）。qPbBa3.1和qPbBa8.1的贡献率分别为19.02%和7.82%。qPbBa3.1区域内包含有抗根肿病基因CRa或CRb,而qPbBa8.1与Crr1毗邻。此外,检测到qPbBa3.1和qPbBa8.1间的上位性互作,互作效应为加性×加性,贡献率为6.58%。双因素方差分析表明,sau_um026与BrID90197间存在极显著差异（P=7.22×10^-5）,进一步验证了qPbBa3.1和qPbBa8.1间的互作效应。单因素方差分析表明,sau_um026和BrID90197的9种基因型间存在显著性差异（P=9.45×10^-10）。多重比较结果表明,qPbBa3.1为抗病亲本‘Siloga’基因型的个体抗病性显著高于其他基因型,杂合基因型的高于感病亲本‘BJN’基因型,含有qPbBa8.1的个体抗病性得到加强。【结论】芜菁自交系‘Siloga’根肿病抗性受主效qPbBa3.1,微效qPbBa8.1,qPbBa3.1和qPbBa8.1间的加性×加性上位性互作效应的影响。     

SH6矮化中间砧‘富士’苹果不同树形对树体生长和果实产量、品质的影响

【目的】探讨矮化中间砧‘富士’(宫藤富士/SH6/平邑甜茶)苹果3种不同树形(自由纺锤形、V字形和篱壁形)的树体生长和果实产量、品质的差异,为矮化中间砧苹果的早果、优质最佳树形选择应用提供理论依据。【方法】以2010年春季定植的3年根1年干SH6矮化中间砧‘富士’成品苗(宫藤富士/SH6/平邑甜茶)为试材,单位面积种植株数相同,分别为自由纺锤形(2 m×4.5 m)、V字形(1.5 m×6 m)和篱壁形(3 m×3 m)3种方式建园,自栽植后分别采用相应的树形修剪方法,连续6年调查不同树形SH6矮化中间砧‘富士’苹果树体生长、枝类组成及果实产量、单果重、固酸比等品质指标。【结果】不同树形SH6矮化中间砧‘富士’苹果树体生长和果实产量、品质存在较大差异。自栽植后第3年开始,不同树形的树体总枝量和覆盖率开始呈现显著差异,自由纺锤形树体总枝量和覆盖率最大,V字形次之,篱壁形最小;3种树形的枝类组成差异不显著。种植后第4年初结果和5—6年结果期的单株产量和累计产量均为自由纺锤形最高,显著高于V字形和篱壁形;自由纺锤形果实的平均单果重最大,V字形最小;各树形果实的果形指数、可溶性糖含量、可滴定酸含量、固酸比和果肉硬度均无显著差异。【结论】SH6矮化中间砧‘富士’苹果树采用自由纺锤形树形与V字形和蓠壁形相比,具有幼树生长快、成形早、总枝量高、枝类组成合理,结果早、稳产丰产、大果比例高、果实单果重高等特点。自由纺锤形是苹果矮砧规模化生产的适宜树形。     

苹果绵肉与脆肉株系果实质地差异的分子机理

【目的】研究新疆红肉苹果（Malus sieversii脆2号’ f. neidzwetzkyana）与‘富士’苹果品种（M. domestica cv. Fuji）杂交后代绵/脆肉株系果实质地差异的分子机理,旨在为进一步完善功能型苹果育种的理论与技术体系提供科学依据。【方法】以新疆红肉苹果杂交后代‘红绵2号’和‘红脆2号’不同发育时期的果实为试材,检测乙烯释放量、果实硬度与脆度以及ACS1等4个乙烯生物合成基因和PG等30个果实软化相关基因的相对表达量,观察其变化。【结果】‘红绵2号’和‘红脆2号’苹果果实发育期间的硬度和脆度均呈下降趋势,但‘红脆2号’各时期果实硬度和脆度均明显高于‘红绵2号’。‘红绵2号’花后120 d乙烯释放速率明显上升,并出现明显的乙烯释放峰;而‘红脆2号’花后120 d乙烯释放速率上升不明显,且无明显的乙烯释放峰。‘红苹果果实各时期的ACS1、ACS3、ACO1和ACO2 4个乙烯生物合成相关基因表达量均明显低于‘红绵2号’;4个乙烯生物合成相关基因的表达模式存在明显差异,其中‘红绵2号’ACS1、ACO1和ACO2三个基因在果实发育后期的表达量均在94%以上,而ACS3a在果实发育前、后期表达量分别占50%,表现为组成型表达。所检测的与果实软化相关的30个基因表达的时间顺序存在明显差异,其中PL、AF1、EG2及XET1等15个基因主要在果实发育前期表达,PG、AF3、XET2、XET10和XET11 5个基因主要在果实发育后期表达,基因表达量均占总表达量的70%以上;除PL和AF1等6个基因外,‘红脆2号’PG等24个基因的总表达量均极显著低于‘红绵2号’。【结论】果实发育后期乙烯释放高峰的到来以及果实发育前、后期不同乙烯生物合成与果实软化相关基因的上调表达,是导致‘红绵2号’果实在采收前就已软化变绵及其与‘红脆2号’质地差异的主要原因。     

一种高通量提取桃DNA方法的建立与应用

【目的】DNA制备是大规模基因型筛选和分子标记辅助选种的重要前提,本研究采用一种1.2 mL八联排管代替单个离心管,探索一种操作简便、节约时间、成本低的桃DNA快速提取方法,以满足高通量遗传研究的需求,提高工作效率。【方法】以普通生长型桃（standard type,ST）‘中油桃8号’为母本,温度敏感半矮生型桃（temperature-sensitive semi-dwarf in Prunus persica,PpTssd）‘09-1-112’为父本,杂交获得F₁代分离群体500株实生苗为载体,包括温度敏感半矮生型246株,普通生长型254株,建立一种高通量、低成本桃DNA提取方法。利用1.2 mL八联排管结合八通道移液器,简化提取步骤,提取桃幼嫩叶片中的基因组DNA;通过紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳对所提取的DNA浓度、纯度和完整性进行检测。基于高分辨率熔解曲线（high resolution melting,HRM）,采用96孔板对温度敏感半矮生型桃和普通生长型桃共500个F₁分离后代单株进行PCR扩增和基因分型,区分TSSDtssd基因型与tssdtssd基因型。基于双亲表型与基因型一致,开发InDel位点,PCR扩增后,采用SDS-PAGE在F₁群体中进行验证,确定利用分离的DNA是否正确区分不同基因型。【结果】分离的DNA经紫外分光光度计检测,浓度范围约为25-200 ng·μL^-1,OD_260nm/OD_280nm约为1.81-1.98,DNA纯度较高;琼脂糖凝胶电泳条带清晰、单一,DNA完整度较高。参考桃基因组（Version 2.0）,根据双亲深度测序数据,开发获得SNP标记SNP_Pp03_3758620,应用于高分辨率熔解曲线基因分型,发现温度敏感半矮生型和普通生长型呈现明显不同的峰型,证明提取的DNA模板可应用于HRM基因分型。基于双亲基因型与表型一致,开发InDel标记InDel_Pp03_3829009,聚丙烯酰胺凝胶电泳的验证结果显示PCR扩增具有较高的强度,获得与目的片段大小一致的特异性条带,且在两种不同生长型单株中具有明显的多态性,表明PCR扩增稳定,提取的DNA可用于基于InDel标记的多态性分析。使用该提取方法,每人每天可以完成1 000个样品的DNA提取,成本较低,且不会对幼苗早期生长造成影响。【结论】建立了一种简便、有效、低成本的桃基因组DNA提取方法,可以满足基因分型、品种鉴定及遗传分析等分子生物学研究,实现了大批量不同样本基因组DNA的同时提取,具有较高应用价值。     

基于SLAF-seq技术的甘薯SNP位点开发

【目的】单核苷酸多态性（SNP）是基因组中最普遍的遗传变异,是构建遗传图谱、完成分子标记辅助育种的一种非常重要的遗传标记。新一代高通量测序平台为SNP位点的检测提供了强有力的技术支持。多倍体作物通常表现为基因组序列大且重复比例高,一直以来多倍体作物的SNP位点挖掘面临巨大的挑战。【方法】共收集300份甘薯种质资源,利用SLAF-seq测序技术进行测序。首先以马铃薯基因组为参照,通过生物信息学分析进行实验方案的系统设计,筛选特异长度的DNA片断,构建SLAF-seq文库。后通过高通量测序的方式获得海量序列,进而通过软件分析比对,获得多态性SLAF标签,最后在多态性SLAF标签上开发大量特异性SNP位点。【结果】对照拟南芥的测序数据与其参考基因组进行比对的结果表明,双端比对效率在本试验中为87.71%,酶切效率为93.22%,说明本试验SLAF建库正常。通过测序共产生498.14 Mb的读长数据,测序后各样品所获得的读长数目在441 595-2 731 920范围内,其中,冀薯4号获得的数据量最大,共计获得2 731 920个读长,对照拟南芥数据量最小,共计获得441 595个读长。测序质量值Q30的范围在88.37%-90.67%,样品3043 Q30测序值仅为87.31%,样品鄂紫1号Q30测序值为91.31%,所有样品Q30值均在80%以上。测序获得GC含量的范围在37.23%-38.09%,样品苏薯9号和浙薯2号存在极端值,样品苏薯9号的GC含量在39.80%,样品浙薯2号GC含量在37.10%,所有样品GC含量均值为37.64%,GC含量普遍不高,说明达到测序要求。本研究共计获得597 094 个SLAF标签,样品的平均测序深度为11.77×,其中多态性SLAF标签260 000个,占SLAF标签总数的43.54%。根据所获得的260 000个多态性SLAF标签来统计SNP位点信息,共计获得795 794个群体SNP位点。【结论】共获得498.14 Mb的读长数据,597 094个高质量的SLAF标签,260 000个多态性SLAF标签,从260 000个多态性SLAF标签上共计开发获得795 794个高质量SNP位点。表明SLAF-seq技术可以很好地应用于甘薯SNP位点的开发,其效率远远高于SSR、AFLP、RAPD等分子标记技术。从全基因组范围获得的SNP位点可以进一步的用来完成后续群体进化分析和特异性SNP标记的开发。     

西瓜枯萎病菌生理小种1抗性基因连锁标记开发

【目的】开发与栽培西瓜枯萎病菌生理小种1抗性基因Fon-1紧密连锁的分子标记,为开展西瓜抗枯萎病分子辅助育种提供技术支撑。【方法】以栽培西瓜抗枯萎病品种Calhoun Gray为父本,感病品种Black Diamond为母本杂交获得的F2分离群体为供试材料,采用BSA法对Fon-1基因进行区间定位。依据11份栽培西瓜重测序信息,获取位于定位区间内的候选SNP位点。针对候选SNP位点设计CAPS/dCAPS标记,通过F2代分离群体和种质资源验证上述标记与Fon-1基因的连锁关系。【结果】通过BSA法,将Fon-1基因定位于1号染色体15 cM区间内。利用候选SNP位点信息,开发3个CAPS/dCAPS标记7716_fon、7419_fon和4451_fon,F2代分离群体以及164份西瓜育种材料验证显示,上述3个标记与Fon-1基因的连锁距离分别为0.8、1.0和2.8 cM。【结论】利用栽培品种Calhoun Gray的抗性遗传机制,开发的3个CAPS/dCAPS标记可以有效区分栽培西瓜对枯萎病菌生理小种1的抗病、感病性,为栽培西瓜品种枯萎病菌生理小种1抗性基因快速应用于栽培品种枯萎病抗性改良建立有效的技术手段。     

野生‘龙门香橙’的植物学特征观察及起源研究

【目的】广东省龙门县境内南昆山主峰天堂顶海拔1 000 m处有当地称之为‘龙门香橙’的野生柑橘,论文拟从形态学和DNA分子证据上探讨其与已知柑橘资源的异同,为合理利用该资源奠定基础。【方法】实地调查‘龙门香橙’的生长环境,观察记录叶、花、果实的形态特征。分析果实的可溶性固形物、糖、酸和抗坏血酸含量。在电子显微镜下观察花粉的显微特征。对比分析包括‘龙门香橙’在内的24个柑橘资源的AFLP图谱以及10个资源的8个SNP位点的基因型。克隆、测序分析‘龙门香橙’的β-胡萝卜素羟化酶（β-carotene hydroxylase,CHX）基因的2个等位基因,并与其他柑橘材料的CHX基因序列进行比对。【结果】生境调查结果表明‘龙门香橙’非人工种植,是真正的野生柑橘。其果实、种子的形状和单胚等特征与柚类相似,但果实与柚相比明显偏小、出汁率与可食率很低、味苦等性状提示其比较原始。叶片形状、线形翼叶、花丝联合等特征类似宽皮柑橘类,比较进化;但花丝和新叶染有紫红色等性状则比较原始。基于AFLP图谱的聚类分析显示其不与其他研究材料聚类,但介乎橘柚之间。8个SNP分子标记分析结果显示,‘龙门香橙’的3个SNP位点为宽皮柑橘纯合基因型,1个位点为橘柚杂合基因型,其余4个位点为柚子纯合基因型,这种基因型组合不同于其他任何所分析的材料。‘龙门香橙’的CHX基因的核苷酸序列显示其2个等位基因间相互差异较小,且含有其他已知柑橘CHX基因上未发现的SNP。CHX基因序列进化分析结果表明其与其他柑橘的遗传距离较远、差异似达种间水平。【结论】‘龙门香橙’是一个真正的野生柑橘资源。其形态性状兼具原始与进化特征。在DNA分子水平上,‘龙门香橙’与已知柑橘不同,甚为独特。