一种简便分离高质量家蚕基因组DNA的方法

本研究对传统的家蚕基因组提取方法进行了改进.改进方法无需研钵和液氮,将RNase与蛋白酶K同时加入剪碎的家蚕样品中消化处理,并利用旋转振荡培养箱旋转混匀和培育每步的样品.该方法减少了基因组DNA的损失,提高了工作效率,节约了成本.利用改进后的方法对不同家蚕品种的基因组DNA进行了提取和PCR扩增验证,结果表明提取的基因组DNA的质量、获得率、重复性都更好,能够满足家蚕分子生物学研究的需要.     

用放射免疫法检测家蚕雌蛾体中雌二醇的含量

为了便于对大量家蚕雌蛾粉及其制品样本中雌二醇的含量进行快速测定,研究了家蚕雌蛾体中雌二醇含量的测定方法。以0.1 mol/L HCl为处理液,乙醚为提取溶剂,振荡重复抽提3次,可有效地提取家蚕雌蛾体中雌二醇。以90 g/L牛血清白蛋白Tris缓冲液为测定溶剂,采用均相竟争的放射免疫法,可精确、稳定地测定出家蚕雌蛾体中雌二醇含量。     

家蚕雄蛾中睾酮和β-蜕皮激素的联合提取及含量测定

为了开发家蚕雄蛾保健食品并建立可控的原料质量标准,研究对家蚕雄蛾的睾酮和β-蜕皮激素2种活性成分进行联合提取及检测的方法。结果表明,采用70%乙醇作提取溶剂对家蚕雄蛾中的睾酮和β-蜕皮激素进行联合提取,能够有效获取2种活性成分,解决了因蛾体含有大量油脂给样品处理带来的困难,更加符合产品生产工艺要求。应用高效液相色谱法(HPLC)在检测波长为242 nm,样品溶液质量浓度20~70μg/m L的线性范围内,测定未交配家蚕雄蛾提取液中的睾酮与β-蜕皮激素的质量比分别为5.82μg/g和17.08μg/g,该检测方法的样品回收率分别达到98.59%和98.35%,可用于家蚕雄蛾原料及其提取液中2种活性成分含量的检测。     

提取家蚕肠道微生物总DNA的2种方法的比较研究

为寻找提取家蚕中肠道微生物总DNA的方法,比较研究了2种方法:①直接提取家蚕中肠道内容物的总DNA,再选择性研究其中来源于微生物的DNA;②先分离家蚕中肠道的微生物,再提取其总DNA.结果表明,方法②所得到的DNA数量较少,但纯度较高;方法①的数量多,种类齐,但杂质多.2种方法分别适合于不同的研究目的.     

~(60)Co-γ射线辐射对家蚕抗菌肽诱导效应研究

以不同品种的家蚕为材料,采用不同剂量的60Co-γ射线辐射处理后,分别提取抗菌肽,测定其抑菌效果。结果表明:经过不同剂量60Co-γ射线辐射处理后的家蚕,抗菌肽抑菌效果显著增强,但随着辐照剂量的增加,抗菌肽的抑菌效果减弱;不同家蚕品种及不同辐射剂量处理的家蚕抗菌肽的抑菌效果差异极显著。利用60Co-γ射线辐射诱导家蚕抗菌肽抑菌活性增强,为开展家蚕的综合利用提供了一条新的途径。     

蚕体黄酮类化合物的提取及不同家蚕品种间的含量差异

为了高效提取家蚕幼虫体内的黄酮类化合物及筛选富含黄酮类化合物的家蚕品种,通过正交试验优化提取工艺条件,采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法测定分析16个黄血蚕品种和3个普通白血蚕品种幼虫体中的黄酮类化合物含量。家蚕幼虫粉经超声波预处理20 min后以80%乙醇溶解,当原料质量浓度为25 g/L,在60℃水浴中提取6 h的效果较佳,提取蚕体总黄酮的质量比达到0.473 mg/g。黄血蚕品种幼虫体中的黄酮类化合物含量极显著高于普通白血蚕品种,两类品种样品中的总黄酮平均质量比分别为0.560、0.513 mg/g。在16个黄血蚕品种中,以来源于东南亚地区的二化性品种幼虫体中的黄酮类化合物含量较高,是富含黄酮类化合物的家蚕品种资源。     

家蚕幼虫体黄酮类化合物的提取及测定方法

为推进家蚕幼虫体的药用开发,研究了家蚕幼虫体黄酮类化合物含量的测定方法。将家蚕幼虫粉过80目筛,选用80%乙醇为溶剂,原料质量浓度按00333g/mL在60℃下抽提4h,重复抽提3次,可高效地提取家蚕幼虫体黄酮类化合物。以NaNO2Al(NO3)3显色,用紫外分光光度计于510nm波长下比色,可精确、稳定地测定出家蚕幼虫体中黄酮类化合物含量。家蚕幼虫体富含黄酮类化合物,其质量比达23770mg/g左右。     

Pb2+、Cd2+混合添食对家蚕生长发育及细胞凋亡的影响

家蚕自3龄起添食单一和混合的Cd2+、Pb2+重金属溶液,观察并记录其生长发育状况,测量各时期体长,提取DNA并分析断裂情况。结果表明,添食Pb2+、Cd2+两种混合重金属离子的家蚕体型比单一添食相应含量Cd2+的大,其体长大于单一添食相同含量Pb2+、Cd2+的家蚕;单一重金属离子作用下的家蚕DNA发生明显的梯状断裂,出现细胞凋亡现象,而混合重金属诱导的家蚕细胞DNA完整,未发生凋亡现象,预示着竞争位点假说在家蚕体内的存在。     

家蚕核糖体的提取及其Sarcin/Ricin结构域的初步鉴定

用超速离心结合密度梯度离心法从蚕蛹中提取家蚕80S核糖体,经尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果表明家蚕核糖体的RNA同大鼠核糖体RNA在序列长度上有明显差异,家蚕5.8S rRNA高于大鼠5.8S rRNA,而家蚕5S rRNA的序列长度则略低于大鼠。用核糖体失活蛋白R ic in分析鉴定家蚕核糖体的Sarc in/R ic in结构域,结果是家蚕Sarc in/R ic in结构域比大鼠Sarc in/R ic in结构域离28S rRNA的3′末端更近。     

家蚕幼虫体中黄酮类化合物的提取与测定

家蚕自古为滋补食疗珍品,丰富的有效活性成分使其具有独特的药理作用,为推进家蚕幼虫体的药用开发,用紫外分光光度法研究了家蚕幼虫体中黄酮类化合物含量在不同品种间的变化规律。将家蚕幼虫干燥粉碎,选用80%乙醇为溶剂,原料体积质量按0.0333g/mL在60℃下抽提4h,重复抽提3次,可高效地提取家蚕幼虫体黄酮类化合物。以NaNO2、Al(NO3)3显色,用紫外分光光度计于510nm波长下比色,可精确、稳定地测定出家蚕幼虫体中黄酮类化合物含量。结果表明,家蚕幼虫体富含黄酮类化合物,不同蚕品种其含量存在显著差异。     

老挝家蚕线粒体cox3基因序列分析及分子进化研究初探

对老挝家蚕品种L11的线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)cox3基因(cox3)进行PCR扩增、克隆和序列分析。结果表明,在测定的909bp的片段中,含有ATPase 6基因及tRNA-Gly基因的部分序列和cox3全序列。其中,cox3读码框包括789个核苷酸,编码262个氨基酸。L11 cox3和已经公布的家蚕(中国家蚕品种夏芳、日本家蚕Aojuku、韩国家蚕Backojam)mtDNAcox3基因完全一致,但与日本野桑蚕、中国野桑蚕的氨基酸同源性分别为99%和98%。     

家蚕地方品种线粒体基因组A+T丰富区的序列及分子进化分析

为了研究家蚕线粒体基因组A+T丰富区的结构和家蚕品种的进化,用PCR方法扩增了12个家蚕(Bombyxmori)地方品种线粒体基因组A+T丰富区及其侧翼序列,分离纯化后克隆到pMD18-T载体进行测序。序列分析表明,克隆片段长度约1.1 kb,基因排列顺序与C108线粒体相同,依次为12S rRNA基因3′端、A+T丰富区、tRNAMet、tRNAIle、tRNAGln和ND2基因5′端,在tRNAGln和ND2基因之间有47 bp的非编码区。以日本野桑蚕(Bombyxmandarina)为外群,用Phylip软件包构建了基于12个家蚕品种线粒体基因组A+T丰富区序列的NJ进化树。结果显示,甘肃种单独聚为一群,其进化早于其它11个品种聚成的类群,说明甘肃种是供试家蚕品种中进化最早的品种。这一结果在分子水平上为黄河流域是家蚕品种的发祥地之一提供了证据,也进一步支持了家蚕品种的中国起源说。对A+T丰富区及其侧翼基因的结构分析表明,家蚕线粒体12S rRNA和ND2基因都十分保守,14个品种统计只分别发生1个和2个碱基转换;A+T丰富区中(A+T)比例高达94.9%以上,第27 nt开始有1个T-串结构,长度为16~19 bp不等;同时还根据3个tRNA基因的核苷酸序列推定了其二级结构。     

野桑蚕线粒体ND5基因及其两端侧翼tRNA基因的克隆与序列分析

应用PCR技术,对中国山东青州野桑蚕mtDNA的ND5基因及其两端侧翼区域进行了克隆和序列分析。结果表明,在所测定的2．2kb左右的片段中,含有ND5基因的完整序列及Phe-tRNA(UUC)、Ser-tRNA(AGC)、Glu- tRNA(GAA)、His-tRNA(CAC)等4个tRNA基因,该片段的基因组结构与家蚕及其它地域来源野桑蚕的基因组结构基本一致,显示蚕类线粒体基因排列的保守性。ND5结构基因在不同家蚕及野桑蚕之间的比对分析表明,它们在核苷酸水平、氨基酸水平的同源性很高,相似性达96%以上。4个tRNA基因的碱基错配率较高,TψC环缺乏相对保守的T-ψ-C-Pu-A序列,各臂的碱基配对数、各环碱基数目变化较大。以ND5基因的核苷酸序列及氨基酸残基序列进行了家蚕及野桑蚕的分子进化分析,进一步证明家蚕起源于中国野桑蚕。     

野桑蚕12S rRNA基因的克隆及序列分析

通过PCR技术,对中国山东青州野桑蚕mtDNA的12SrRNA基因进行了克隆和序列分析。结果表明,青州野桑蚕12SrRNA基因为788nt,在DNA水平上,与家蚕12SrRNA基因的同源性达到99%,与中国陕西安康、日本筑波来源的野桑蚕12SrRNA基因的同源性分别为97%、98%;分子进化分析显示,家蚕可能是起源于中国野桑蚕。     

中国野桑蚕mtDNA中A+T丰富区片段的克隆及序列分析

对中国野桑蚕mtDNAA +T丰富区片段进行了克隆和序列分析。在所测定的 72 0bp左右的片段中 ,A +T含量为 92 0 8% ,与不同家蚕品种的mtDNA相近 ,中国野桑蚕与家蚕之间的核苷酸序列呈高度同源性 (98%以上 ) ;但与日本野桑蚕相比 ,中国野桑蚕mtDNA的A +T丰富区片段 ,缺少 2个 12 6bp的重复单位 ,A +T含量低 0 9% ,核苷酸序列同源性也较低 (72 % )。该片段与中系家蚕mtDNA比较 ,有 15个变异位点。对mtDNAA +T丰富区的中国野桑蚕和日本野桑蚕及中系、日系和韩国的 4个家蚕品种进行聚类分析表明 ,日本野桑蚕有可能由中国野桑蚕分化而来。     

天蚕、柞蚕线粒体DNA（mtDNA）的限制性酶切电泳图谱

采用差速离心和碱变性法，以９种限制性内切核酸酶对天蚕和柞蚕ｍｔＤＮＡ进行了单酶切分析，发现这两种蚕的ｍｔＤＮＡ在分子长度和酶切类型上存在明显差异。还对天蚕、柞蚕、蓖麻蚕和家蚕的ｍｔＤ－ＮＡ限制性酶切电泳图谱进行了比较研究。     

天蚕、柞蚕线粒体DNA（mtDNA）的限制性酶切电泳图谱

采用差速离心和碱变性法，以９种限制性内切核酸酶对天蚕和柞蚕ｍｔＤＮＡ进行了单酶切分析，发现这两种蚕的ｍｔＤＮＡ在分子长度和酶切类型上存在明显差异。还对天蚕、柞蚕、蓖麻蚕和家蚕的ｍｔＤ－ＮＡ限制性酶切电泳图谱进行了比较研究。     

家蚕后部丝腺离体线粒体的制备及其电镜制样技术的改良

为研究家蚕(Bomb yxmori)线粒体DNA(mt DNA),我们用一种简便的提取分离技术获得了纯净完好的离体线粒体制品。在离体线粒体电镜制样过程中,发现琼脂予包埋、乙醇脱水处理将破坏线粒体膜结构。改用线粒体沉淀直接固定,丙酮脱水处理电镜样品,线粒体膜结构得到保存,效果良好。     

不同处理对动物线粒体DNA提取的影响

无脊推动物^[1]野桑蚕的蛹分别在不同温度下保存处理和用不同方法破碎新鲜蛹细胞处理，脊推动物^[1]长吻鮠的离体肝脏在不同试剂下保存处理。经过处理后的材料分别再用改良的碱变性法^[2-6]提取mtDNA，并比较相应处理的mtDNA。研究发现：这几种处理的材料都能够将其mtDNA提取出来，但不同处理的材料线粒体DNA质量有所不同，提取动物线粒体DNA时应根据实际需要处理材料。     

家蚕耐氟种质的创建

用自行设计的方法，将耐氟主产基因导入性状优良的实用品种，并纯合固定，创建了一批耐氟种质，其２～４龄耐氟２００ｐｐｍ以上，保持了原型品种的特性，并在某些方面有所提高。