大白菜细胞质雄性不育特异RAPD标记的筛选

根据近等基因系分析原理,以大白菜细胞质雄性不育系CMS-2及其保持系B-2为材料.对大白菜细胞质雄性不育基因及其保持基因进行RAPD标记研究。引物S391在不育系中有特异性扩增,得到一条约700bp的特异片断;引物S425在保持系中有特异性扩增,得到一条约600bp的特异片,分别命名为S391-700bp、S425-600bp。采用Blastn进行核苷酸同源序列比较,结果发现S391-700bp存在一个开放阅读框架,这一开放阅读框架与植物叶绿体丝氨酸乙酰基转移酶DNA部分片段有很高的同源性;S425-600bp是新发现的一段DNA序列。根据测序结果设计特异引物,结果表明本研究所获得的两个标记片断都能确定其特异性。     

大豆RN型细胞质雄性不育系及保持系cDNA-AFLP分析

本研究利用cDNA-AFLP技术对大豆RN型细胞质雄性不育系及其同核异质保持系进行多态性分析。提取不育系和保持系的总RNA,反转录成cDNA。以cDNA为模板,通过PCR对64对AFLP引物进行扩增筛选,对不育系或保持系中特有的差异带进行回收测序,通过NCBI-Blast同源比对分析得到12条同源序列,其中8条序列为已知功能的基因,4条为未知功能基因。其中与线粒体基因同源的序列A4,编码ATP合成酶γ亚基蛋白基因同源的序列A1,编码减数分裂不联会突变蛋白同源的序列B1可能与不育有关。这些片段的发现为不育机制的深入研究提供帮助,同时可作为不育系及保持系快速鉴定的依据,对缩短育种年限,加快育种进程具有重要意义。     

甜菜细胞质雄性不育相关基因的克隆表达及CMS的相关性研究

已有的研究表明,线粒体atpA基因和orf187片段与作物雄性不育关系密切。为了研究atpA基因和orf187片段与甜菜细胞质雄性不育之间的关系,采用同源序列法分离克隆了甜菜体内atpA和orf187序列;序列分析揭示这2个片段序列在不育系和相应保持系间存在差异,进一步利用半定量RT-PCR和Real-time PCR技术分析了两系的atpA基因和orf187片段的表达情况。结果表明,与保持系相比,atpA在不育系中发生了碱基的置换及插入;orf187在不育系中缺失6个碱基,而在保持系中多了6 bp的重复序列;基因表达分析也显示,不育系atpA在花蕾发育的前2个时期表达量明显低于相应的保持系,而在大花蕾期其表达量又高于相应的保持系;orf187在不育系小花蕾时期表达量明显高于相应的保持系,随着花蕾的发育,该序列在不育系中的表达逐渐减弱并明显低于对应保持系中的表达量。推测atpA和orf187的结构变异及异常表达与甜菜细胞质雄性不育有着密切关系。     

四种细胞质来源的烟草不育系线粒体SSR位点差异

采用线粒体SSR(mtSSR)方法对普通烟草4种不育类型的不育系、不育胞质来源的烟草野生种和保持系进行线粒体位点差异分析,探讨mtSSR位点差异与胞质不育的关系。在烟草线粒体基因组上检索到24个能重复稳定扩增出片段的mtSSR,对烟草属植物的这些mtSSR分析结果显示,普通烟草种内mtSSR较为保守,多态性比率仅10.5%;4种不育类型的各自不育系与保持系、不育胞质上存在多个差异位点,在Nta(sua.)S类型中差异位点在线粒体编码基因orf138a、orf138c以及orf102~orf210的基因间区;在Nat(gla.)S类型中,差异位点在线粒体orf138a、orf138c两个编码基因以及nad2~sdh3、rps12~orf125b、orf116~orf101b、orf102~orf210的4个基因间区;在Nta(rep.)S类型中,差异位点在线粒体编码基因orf190以及orf104c~orf202的基因间区;在Nta(rus.)S类型中,差异位点在线粒体编码基因orf137以及rps12~orf125b的基因间区。这些位点差异可能与各自的雄性不育有关。另外,mtSSR引物TMS20在Nat(sua.)S、Nat(gla.)S、Nat(rep.)S和Nat(rus.)S类型的雄性不育系中分别扩增出了184、172、212和225 bp的片段,表明可用该引物区分4种烟草CMS类型。     

与大白菜细胞质不育相关RAPD特征片段的克隆和序列分析

为了研究和获得大白菜细胞质不育系和保持系线粒体DNA的多态性,选用153个RAPD随机引物,对3套材料,每套中包含不同来源、同核异质的大白菜细胞质不育系（Pol-CMS、Ogu-CMS和CMS96）和保持系线粒体DNA进行RAPD分析。结果表明,有4个RAPD随机引物可以在全部Ogu-CMS和CMS96不育系中扩增出特异带,有1个随机引物仅在所有Ogu-CMS不育系中扩增出特异带;同时将OPAH16随机引物扩增的与不育相关的特异带进行了克隆和测序。结果表明,所获得的特异片段均与拟南芥和甘蓝型油菜的线粒体基因组序列部分同源,但与已发表的不育基因序列没有同源性。由这5个序列推导出的蛋白质与拟南芥中的一种未知功能蛋白AtMg00760（ORF109b）具有部分同源性。这5个序列的可能功能正在验证中。     

甜菜胞质雄性不育系与保持系某些生理特性的差异

采用比较生理学的方法，对甜菜细胞质雄性不育系及其保持系生殖生长阶段的某些生理特性进行了研究。结果表明，甜菜细胞质雄性不育系的细胞色素氧化酶及ATP酶活性均表现为不育系低于其保持系；过氧化物酶和过氧化氢酶活性则表现为不育系高于其保持系，这反映线粒体内外末端氧化酶活性的高低可能与胞质雄性不育有一定关系；赤霉素含量表现为胞质雄性不育系低于其保持系。     

小麦K、V型细胞质雄性不育系线粒体基因的比较分析

细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility,MS)是高等植物中普遍存在的一种母性遗传现象,跟线粒体基因密切相关。小麦K型和V型细胞质雄性不育性是由于粘果山羊草和偏凸山羊草或易变山羊草的细胞质导入普通小麦中产生的,被认为是最有利用潜力的小麦不育种质,但是其不育性产生的机理还不清楚。本研究在已知小麦K型细胞质雄性不育系和保持系线粒体基因组序列的基础上,比较分析了K型,V型不育系和保持系中33个线粒体基因和22个开放阅读框(open reading frame,orf;K型不育系特有的,被认为是K型不育系的不育候选基因)。结果表明,线粒体基因中除atp6、nad6和rps3在保持系和不育系之间有较大差异外,其它基因在保持系和不育系中都是高度保守的,其一致性达98%以上,atp6和nad6在两个不育系中也是高度一致的;22个orf中只有orf249在K型和V型不育系之间具有一定差异,其余的orf高度一致,说明小麦K型和V型不育系的线粒体基因是高度保守的,推测二者可能具有相似的不育基因或不育机理。研究结果为小麦K型和V型不育系在杂交育种中的利用奠定了一定的理论基础。     

大白菜细胞质雄性不育的分子鉴定及序列分析

为了获得3种大白菜细胞质雄性不育系Ogu CMS,Pol CMS,CMS96和保持系间的多态性以及定位大白菜CMS96不育系所属的不育类型,利用设计的atp6,orf222单一和混合引物PCR扩增3组11份同核异质大白菜细胞质雄性不育系和保持系mtDNA。结果表明,atp6引物在大白菜Ogu CMS不育系扩增的200 bp片段为其特异带;orf222引物仅在大白菜Pol CMS和CMS96不育系有扩增产物,但二者有3点完全不同:大白菜Pol CMS不育系扩增产物为675bp,CMS96不育系扩增产物为669 bp,二者相差6个核苷酸,后者定名为大白菜CMS96-orf222。大白菜CMS96-orf222与甘蓝型油菜Nap CMS的nad5c基因和Nap-orf222基因同源性均为99%,E值为0.0;大白菜Pol CMS的675 bp序列具有ORF224开放阅读框,没有保守结构域,而大白菜CMS96的669 bp序列具有ORF222开放阅读框和保守结构域YMF19。另外,atp6和orf222混合引物多重PCR扩增产物存在明显多态性:800 bp为大白菜保持系的差异带型;2 300 bp和1 500 bp为大白菜Pol CMS不育系特异带型;200 bp为大白菜Ogu CMS不育系特异带型;690 bp为大白菜CMS96不育系特异带型。该方法仅用一次PCR反应快速地将3种大白菜细胞质雄性不育系和保持系一次性全部区分开,为大白菜分子育种和常规育种更好地相结合提供了简单、快速、准确和重复性好的方法和手段。     

细胞质雄性不育棉花线粒体蛋白质和DNA的分析

以哈克尼西棉细胞质雄性不育系和保持系的花药及黄化苗为材料, 分别对线粒体蛋白质和DNA进行了SDS-PAGE、 RAPD和RFLP分析。 蛋白质SDS-PAGE分析表明, 在处于败育时期的不育系花药线粒体内缺少一种约31 kDa的多肽。 RAPD分析表明, 不育系与保持系的线粒体基因组之间存在着明显的差异。 以4个线粒体基因为探针进行的RFLP分     

烟草ATP合酶F_0部分4个亚基基因转录本编辑位点分析

RNA编辑是高等植物线粒体基因转录后表达调控的一种重要方式。为探究ATP合酶F_0部分的4个亚基基因与植物雄性不育性的关系,本研究以3个烟草雄性不育系(MS中烟90、MS云烟85和MS K326)及其同型保持系为供试材料,比较分析atp6、atp9、orf25和orf B线粒体基因转录本的编辑位点。结果表明,orf25和orf B基因转录本在不育系和保持系中发生的编辑位点是一致的。atp6基因在不育系中未发生编辑,在保持系中共有6处发生了RNA编辑。与保持系相比,atp9基因在不育系中除8处共同的C→T编辑外,还缺少2个C→T的特异编辑位点,其中1个导致氨基酸类型的改变。推测不育胞质因缺少特异的线粒体基因转录本编辑而导致烟草的细胞质雄性不育。     

线粒体DNA由来的RAPD标记能鉴别水稻雄性不育和可育细胞质

以野败型细胞质的水稻雄性不育系珍汕97A及其保持系珍汕97B的总DNA为模板,从100个引物中筛选到OPA12对珍汕97A能扩增出一条1600 bp的特异带.用OPA12扩增野败型细胞质的龙特浦A及其保持系龙特浦B、矮败型细胞质的协青早A及其保持系协青早B、恢复系明恢63、珍汕97A/明恢63的F1和F2个体的总DNA,不育系、F1和F2所有调查个体都有16     

甜椒胞质雄性不育恢复系SRAP及SCAR标记

以甜椒胞质雄性不育恢复系5-2R1和相应的保持系5-2为试材,利用SRAP分子标记技术筛选与甜椒恢复基因相关的分子标记。128对SRAP引物共扩增获得了3796条从100bp至800bp大小不同的条带,平均每对引物组合可扩增出30条清晰的条带,检测到4个多态性位点,其中恢复系材料仅有1个。对该特异片段进行回收、克隆和测序,结果表明该片段全长为259bp。经数据库比对分析表明,该片段与线粒体中的NADH脱氢酶第5亚基(GenBank:EF151914.1)具有81%的同源性;同时,该片段与辣椒BAC克隆PEPBAC 158K24(GenBank:FJ597540.1)的部分序列高度同源。根据序列特点设计特异SCAR引物,对恢复系和保持系进行扩增验证,仅在恢复系中扩增出目的条带,表明已成功地将此SRAP标记转化为简单、稳定的SCAR标记。我们推测本研究获得的SCAR标记可能与胞质雄性不育恢复性状连锁。     

甜菜细胞质雄性不育系与其保持系线粒体DNA的RAPD分析

本文对甜菜线粒体DNA的提取方法进行了改进,在不需密度梯度离心条件下即可获得高纯度的DNA。优化了甜菜线粒体的RAPD的反应条件,对细胞质雄性不育甜菜的不育系及其保持系的线粒体DNA(mtDNA)进行了RAPD(随机扩增多态DNA,randomly amplified polymorphic DNA)分析,结果表明：甜菜细胞质雄性不育系和保持系线粒体DNA之间存在丰富的多态性。     

甜菜细胞质雄性不育系及保持系叶绿体DNA的RAPD分析

对细胞质雄性不育甜菜的不育系及其保持系的叶绿体DNA(ctDNA)进行了RAPD分析,结果表明：在所选的70个引物中,甜菜细胞质雄性不育系和保持系叶绿体DNA之间不存在差异性。与此同时,对叶绿体DNA的提取方法进行了改进,在不需密度梯度离心条件下即可获得高纯度的DNA;优化了甜菜叶绿体的RAPD的反应条件。     

Random amplified polymorphic DNA analyses of cytoplasmic male sterile and male fertile Pigeonpea (Cajanus cajan (L.) Millsp.)

Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) markers were used for the identification of two pigeonpea cytoplasmic genic male sterile (CMS) lines derived from crosses between the wild (Cajanus scarabaeoides & C. sericeus) and the cultivated species of Cajanus cajan. The male sterile (A) line and its maintainer (B) line could be easily differentiated with certain random primers. The two male sterile (288 A and 67 A)systems are based on C. scarabaeoidesand the other is based on C. sericeus could also be differentiated. Amplification product of 600bp amplified by primer OPC-11 was observed in both the cytoplasmic male sterile lines (288 A and 67A), which was absent in the maintainer lines (288 B and 67 B) and the putative R-line (TRR 5 and TRR 6). CMS lines, putative R lines, other cultivars and wild species under the study could be easily distinguished with the help of different primers. Dendrogram constructed based on the similarity index showed that considerable genetic variation exist sbetween CMS lines, two putative R line and wild species studied. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.     

大白菜CMS96细胞质雄性不育分子特性研究

大白菜CMS96细胞质不育系是由大白菜株系与甘蓝型油菜细胞质不育源杂交、多代回交后获得的。该不育系生长势旺、不育性稳定,不育度和不育株率均为100%,蜜腺正常,在大白菜杂种一代生产中具有广阔的应用前景。为了定位大白菜CMS96细胞质不育所属的类型和获得其不育有关的特异序列,依据atp9、coxI、orf138和orf224保守序列设计4对引物,对3组11份大白菜材料线粒体DNA进行PCR扩增,每组材料内包含同核异质PolCMS、OguCMS、CMS96三种大白菜不育系和一种共用保持系。结果表明,atp9和coxI引物在所有材料中均有扩增产物,供试材料间没有差异;而orf138和orf224引物扩增产物存在差异。orf138引物仅在全部OguCMS和CMS96不育系中扩增出309bp特异带,而保持系和PolCMS不育系没有扩增产物;orf224引物仅在所有PolCMS中扩增出689bp特异带,而保持系、OguCMS和CMS96不育系没有扩增产物。同时,对保持系和不育系花组织mRNA进行RT-PCR分析,进一步验证了orf138和orf224引物扩增产物的特异性和一致性。同源性分析结果表明,利用orf138引物所获得的309bp大白菜mtDNA特异片段均与萝卜OguCMS、甘蓝型油菜OguCMS萝卜体细胞杂种所具有的Oguorf138高度同源,二者有172个核苷酸完全相同,有58个氨基酸完全相同;orf224引物所获得的689bp大白菜mtDNA特异片段与甘蓝型油菜的Polorf224高度同源,二者有677个核苷酸完全相同,有225个氨基酸完全相同,同源性均达到100%。初步认为大白菜OguCMS和CMS96不育系具有相似性,OguCMS萝卜所具有的orf138是导致二者不育的原因;Pol甘蓝型油菜所具有的Polorf224是导致大白菜PolCMS不育的原因。     

Identification of the Putative Cytoplasmic Donor of a CMS System in Brassica juncea

Chloroplast (cp) and mitochondrial (mt) DNA restriction profiles of a cytoplasmic male sterile (CMS) line of Brassica juncea and its maintainer line were compared and found to be markedly different. Comparison of cpDNA restriction profiles of fifty different species of genus Brassica and some allied genera showed that the cpDNA profiles of CMS lines were similar to that of B. tournefortii for twenty different restriction endonucleases. This CMS system is thus not of spontaneous origin as reported earlier, but is alloplasmic in nature. Comparison of restriction profiles of mtDNA of B. tournefortii and CMS lines revealed some differences which might either be due to changes in DNA pattern during the transfer, or, due to the cytoplasm coming from a B. tournefortii line different from the one used in this study.