溶藻弧菌对三疣梭子蟹溶菌酶和磷酸酶活性的影响

将健康的三疣梭子蟹（平均体重176±21.3g）分别注射生理盐水和溶藻弧菌,在感染后0、24、48和72h分别采集不同处理组梭子蟹的血淋巴、肌肉和肝胰腺组织,测定其中的溶菌酶（LSZ）、酸性磷酸酶（ACP）及碱性磷酸酶（ALP）活性,研究溶藻弧菌对三疣梭子蟹体内免疫相关酶活的影响。结果表明,感染组梭子蟹血淋巴LSZ活性在感染后24h显著高于对照组（P〈0.05）,随后活性显著降低（P〈0.05）;肌肉和肝胰腺组织中LSZ活性在感染24h有稍微上升的趋势,但是随着感染时间的延长其活性又逐渐下降,且在感染48h后分别显著低于对照组（P〈0.05）。感染组梭子蟹不同组织中ACP和ALP酶活随着感染时间的延长均呈下降的趋势,且感染48h后显著低于对照组（P〈0.05）。试验表明,三疣梭子蟹感染溶藻弧菌后对机体免疫相关酶活指标的影响较大,导致机体免疫防御能力的减弱。     

三疣梭子蟹血淋巴免疫功能的初步研究

利用API ZYM试剂盒和酶活力测试盒检测了三疣梭子蟹血细胞及血清中的19种酶类及血清中溶菌酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶和过氧化物酶的活性。试验结果表明,在雄蟹血清和血细胞中均检测到19种酶,在雌蟹血清和血细胞中分别检测到18种和16种。碱性磷酸酶和酸性磷酸酶的活性很低。在此基础上,研究了三疣梭子蟹血清和血细胞溶解物(HLS)对溶藻弧菌的抗菌活力,结果显示血清样品对溶藻弧菌的抗菌活力较强,但其体外作用的持续时间较短;而血细胞溶菌酶对溶藻弧菌的抗菌活力较弱。     

盐度对三疣梭子蟹成熟前后呼吸代谢的影响

为了探讨三疣梭子蟹对不同盐度水平的生理响应以及成熟前后的生理变化,实验采用水化学和酶学方法,研究了盐度(15、20、25、30和35)对成熟前后三疣梭子蟹耗氧率、排氨率、氧氮比(O∶N)以及己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、琥珀酸脱氢酶(SDH)和乳酸脱氢酶(LDH)4种呼吸代谢酶活力的影响。结果发现:1.盐度与规格的交互作用对三疣梭子蟹呼吸代谢无显著影响(P>0.05);2.盐度对三疣梭子蟹耗氧率的影响不显著(P>0.05),但显著影响其排氨率(P<0.05);成熟前后的三疣梭子蟹耗氧率和排氨率差异显著(P<0.05);3.盐度对三疣梭子蟹O∶N未产生显著影响(P>0.05),三疣梭子蟹成熟前O∶N显著高于成熟后(P<0.05);4.除LDH外,盐度对三疣梭子蟹呼吸代谢酶活力影响不显著(P>0.05);除鳃中SDH和LDH外,三疣梭子蟹呼吸代谢酶活力随生长发育发生显著变化(P<0.05)。研究表明,规格对三疣梭子蟹呼吸代谢的影响高于盐度,长时间盐度驯化可能减弱甚至消除三疣梭子蟹在不同盐度水平下代谢的差异。     

微孢子虫感染三疣梭子蟹的肌组织病理及其免疫相关酶活性

利用纯化的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)"牙膏病"病原微孢子虫对三疣梭子蟹进行人工感染实验,观察感染蟹肌肉组织的临床变化及其超微病理,并测定感染后肌肉和肝胰腺组织酸性磷酸酶(ACP)和超氧化物歧化酶(SOD)不同时间点的活性。结果发现,微孢子虫肌肉注射感染三疣梭子蟹后,蟹的肌纤维透明度随着感染时间的延长逐渐下降并向白浊化转变。超微病理显示,注射感染176 h后,肌细胞内存在大量微孢子虫,感染蟹肌细胞出现核膜肿胀和线粒体双层膜破裂等病变,严重者肌纤维发生断裂、溶解,电镜下可见大量高电子密度的溶解灶。免疫相关酶活分析显示,微孢子虫感染后,三疣梭子蟹肌肉和肝胰腺组织ACP和SOD活性均呈现两个显著上升过程(P0.05);肝胰腺组织ACP活性始终高于肌肉组织,而两种组织的SOD活性恰好相反;感染蟹肌肉组织内两种酶活性几乎始终大于正常对照组。酶活的变化可能与蟹微孢子虫的肌肉组织亲嗜性及其增殖速度较慢等特点有关。     

三疣梭子蟹个体发育早期的同工酶谱变化

采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术研究了三疣梭子蟹个体发育早期（从未受精卵到第一期幼蟹）11种同工酶（LDH、GDH、ADH、SOD、EST、ME、MDH、SDH、GOT、ACP和α-AMY）酶谱的变化：结果表明,三疣梭子蟹EST、ME、MDH、SDH、GOT、ACP和α-AMY等7种同工酶电泳图谱显示了明显的发育阶段差异性,大都随发育渐趋复杂。个体发育阶段特异性的同工酶可以作为一项生化指标用于三疣梭子蟹发育阶段的鉴别。在三疣梭子蟹整个胚胎和幼体发育过程中均未能检测出LDH和GDH活性,而ADH和SOD酶活性则有持续和较稳定的表现。根据各同工酶的个体发育谱式,三疣梭子蟹个体发育过程中同工酶的表达类型被划分为4种。讨论了三疣梭子蟹同工酶的个体发生多念性和刚孵化的第一期涵状幼体的同工酶活性。     

溶藻弧菌诱导对三疣梭子蟹血淋巴非特异性免疫水平的影响

以平均体质量为(162±26)g雌性三疣梭子蟹为试验对象,注射组从游泳足第一关节基膜注射200 μL浓度为2.4×107 CFU/mL的溶藻弧菌菌悬液,对照组注射等量无菌生理盐水.各组在注射0、24、48、72、96h后随机取9只三疣梭子蟹,从游泳足基膜部位抽取血淋巴,测定血淋巴的血细胞总数、大颗粒细胞比例、血清蛋白、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、一氧化氮和诱导型一氧化氮合成酶等非特异性免疫指标.结果表明,遭受低剂量的溶藻弧菌侵袭后,三疣梭子蟹血细胞总数迅速降低(P＜0.05),与对照组相比降低36％,而大颗粒细胞比例则先上升(P＜0.05),72 h后恢复至正常水平;血清蛋白含量则无明显变化;血清中酸性磷酸酶、碱性磷酸酶活性也迅速增加,并分别在24、72 h达到峰值(P＜0.01,P＜0.05),在96h后两种酶的活性均恢复至对照组水平;血清中一氧化氮含量及诱导型一氧化氮合成酶活性则稳步增加,并在96 h达到峰值(P＜0.01).研究证实低剂量的溶藻弧菌能刺激三疣梭子蟹调动血细胞、酸、碱性磷酸酶、一氧化氮合成酶系统进行免疫防御,但是各非特异性免疫指标大多具有明显的时间效应,响应速度有较大差异.     

致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)自然感染三疣梭子蟹

近年来包括急性肝胰腺坏死病(AHPND)在内的多种新发疫病的流行,使我国甲壳类养殖业遭受了严重的经济损失。为了筛查导致山东潍坊某养殖场中一虾蟹混养池塘内患病三疣梭子蟹感染的可能病原,本研究采用分子生物学检测方法,对三疣梭子蟹样品进行了白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、虾血细胞虹彩病毒(SHIV)、致急性肝胰腺坏死病副溶血孤菌(Vp_(AHPND))、虾肝肠胞虫(EHP)、偷死野田村病毒(CMNV)、黄头病毒(YHV)和肝胰腺细小病毒(HPV)等8种病原的检测,并对样品进行了组织病理和原位杂交分析。分子生物学检测结果显示,患病三疣梭子蟹样品呈Vp_(AHPND)阳性,而呈现WSSV、IHHNV、SHIV、EHP、CMNV、YHV和HPV阴性。对样品进行Vp_(AHPND)套式PCR第二轮扩增产物的序列测定、比对和进化树分析,结果显示,扩增产物序列与致病副溶血弧菌质粒上pirA~(vp)毒力基因片段具有99%的同源性,该序列与已报道的多个致病副溶血弧菌PirA聚在进化树的同一主分支上。组织病理学分析显示,患病三疣梭子蟹的肝胰腺小管上皮细胞坏死,心肌纤维呈溶解样病变,鳃丝上皮柱突细胞明显坏死,胸神经节的神经细胞损伤严重,并且这些组织中还可见大量的细胞核固缩现象;原位杂交结果显示,肝胰腺、心肌、鳃组织及胸神经节中的病变部位均存在Vp_(AHPND)探针的蓝紫色杂交信号。以上表明,虾蟹混养池塘中三疣梭子蟹在自然状态下感染了Vp_(AHPND),并导致肝胰腺、心肌、鳃和胸神经节发生了严重病理损伤。本研究首次在养殖三疣梭子蟹中检测到Vp_(AHPND)感染并揭示了感染所致的病理变化,相关结果为揭示Vp_(AHPND)自然宿主种类和养殖三疣梭子蟹病害防控提供了基础信息。     

三疣梭子蟹几丁质酶基因的克隆及其在蜕皮过程中的表达分析

为探究几丁质酶基因在三疣梭子蟹蜕皮过程中的生理作用,本研究通过转录组测序和RACE技术克隆了三疣梭子蟹几丁质酶基因（PtChi）cDNA全长（登录号：KF914663）,并通过荧光定量PCR（qRT-PCR）技术研究了该基因在三疣梭子蟹不同组织及不同蜕皮阶段的表达情况。结果表明,(1)PtChi基因cDNA全长2 200 bp,包括5’非编码区（5’-UTR）16 bp、3’-UTR 714 bp和开放阅读框1 470 bp,编码489个氨基酸,预测分子量和等电点为53.97 ku和4.76。(2)BlastP 结果显示,PtChi推导氨基酸序列与已知甲壳动物Chi-3的一致性为61%~96%,系统进化树分析表明PtChi与其他甲壳动物Chi-3聚为一支。(3)qRT-PCR结果显示PtChi基因在C期三疣梭子蟹肝胰腺中表达水平最高,胃、大颚器、心脏和眼柄中PtChi-mRNA表达水平依次降低,在其他组织中PtChi-mRNA表达量最低,且表达水平无显著差异。(4)不同蜕皮阶段,PtChi在肝胰腺、肠、胃和大颚器4种组织中的表达变化模式有所不同,肝胰腺中PtChi-mRNA表达水平在AB期最高,C期最低,暗示PtChi可能参与三疣梭子蟹蜕皮后期对病原体的免疫防御;肠中的PtChi-mRNA表达水平在E期最高,C期最低,推测PtChi参与蜕皮过程中肠道围食膜的分解和免疫功能;胃中PtChi表达水平在C期最高,暗示其参与了食物消化。以上结果表明,本研究克隆的PtChi可能为甲壳动物Chi-3型,其准确生理学功能及其在蜕皮过程中的调控机制有待进一步深入研究。     

三疣梭子蟹核型分析

实验用三疣梭子蟹于2003年3月－2004年6月购自浙江象山石浦港。以成熟卵、精巢、胚胎及溞状幼体等为材料进行三疣梭子蟹染色体数目和核型的研究。染色体制片采用组织切片法和气干法,用Olympus显微镜进行观测、摄影,依据Levan等的染色体分类标准进行核型分析。结果表明,精巢最适宜进行三疣梭子蟹染色体计数,卵内溞状幼体最适宜做核型分析。三疣梭子蟹染色体的数目是2n=106,n=53。核型分析显示,三疣梭子蟹有20对（第1～20号）中部着丝粒染色体（m）、3对（第21－23号）亚中部着丝粒染色体（sm）和30对（笫24～53号）端部着丝粒染包体（t）。因此,三疣梭子蟹核型为2n=106=40m＋6sm＋60t,染色体臂数NF=152;没有检查出异形性染色体的存在。     

盐度胁迫对三疣梭子蟹血清非特异性免疫因子的影响

采用紫外分光光度法和酶学分析方法研究了盐度(14和36)胁迫下12 h内经溶藻弧菌筛选过的三疣梭子蟹F2代(简称筛选蟹F2)的血蓝蛋白含量及血清酶活力的变化,用普通三疣梭子蟹F1代(简称普通蟹F1)作对照。试验结果表明,在高盐和低盐短时胁迫下,筛选蟹F2和普通蟹F1的血蓝蛋白含量、3种保护酶(SOD、POD和CAT)和磷酸酶(ACP和AKP)活力随时间变化呈现有升有降的变化趋势。此外,无论在低盐还是高盐胁迫下,筛选蟹F2的血蓝蛋白含量和各项血清酶活力分别在0 h(正常水平)和盐度胁迫下均显著高于普通蟹F1(P<0.05)。低盐和高盐短时胁迫对三疣梭子蟹的非特异性免疫影响显著且表现出较强的应激反应;在正常和抗盐度胁迫下,筛选蟹F2的非特异性免疫比普通蟹F1更具优势。     

莱州湾三疣梭子蟹生物学参数及生长特性研究

根据2012年5~11月使用单船底拖网进行的7个航次调查数据,运用FiSATⅡ软件相关模块对莱州湾三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)生长、死亡参数及生长特性、种群补充模式、资源量等进行研究。结果显示:7个航次共捕获三疣梭子蟹1128 ind,雌雄性比为0.96,雌性甲宽为27~227 mm,雄性为29~207mm;获得三疣梭子蟹雌性生长参数k=1.60、L_∞=241.50、W∞=639.29、t0=0.081,雄性为k=1.50、L∞=210.00、W∞=418.23、t0=0.091;经体长结构VPA(Length-Structured VPA)模块估算,稳定状态下莱州湾三疣梭子蟹雌性渔获尾数为734×10~4ind、种群尾数为1.15×10~8ind、资源量为2 682 t,雄性渔获尾数为810×10~4ind、种群尾数为1.19×10~8ind、资源量为1 929 t;经变换体长渔获曲线法(Length-Converted Catch Curve)及刀刃式选择假设模型(Knife-Edge)估算三疣梭子蟹雌性总死亡系数Z=4.17、自然死亡系数M=1.20、捕捞死亡系数F=2.97、资源开发利用率E=0.712、平均选择甲宽Lc=62.38mm、最大效益时开发利用率Emax=0.515;雄性总死亡系数Z=3.76、自然死亡系数M=1.19、捕捞死亡系数F=2.57、资源开发利用率E=0.684、平均选择体长Lc=40.84 mm、最大效益时开发利用率Emax=0.487。研究表明:1)莱州湾三疣梭子蟹雌雄性比、雌雄性幂指数均处在正常水平,总体生长状况良好;2)莱州湾三疣梭子蟹雌、雄性群体资源利用率均显著高于最适利用率与最大利用率,处于过度开发水平;3)莱州湾三疣梭子蟹现存资源量低于生态容量,上升空间较大。     

三疣梭子蟹性腺发育控制技术研究

通过调控放养密度、掌握饵料投喂、采用不同水质管理措施、镊烫法切除单侧眼柄等技术措施抑制或促进三疣梭子蟹卵巢发育,使卵巢推迟或提前了2个月成熟,进行反季节销售,取得了良好的效果。     

三疣梭子蟹血细胞全长cDNA文库构建及EST初步分析

三疣梭子蟹是我国沿海重要养殖品种之一,近年来养殖病害呈逐年上升趋势,制约了三疣梭子蟹养殖产业的健康可持续发展。为大规模克隆三疣梭子蟹免疫相关基因,研究其免疫基因的功能和免疫机制,奠定三疣梭子蟹病害防治理论基础,采用SMART技术构建了三疣梭子蟹血细胞全长cDNA文库。经测定,文库滴度为1.14×107pfu/mL,文库总容量为5.7×107pfu,重组率达到98%,插入片段平均长度为817.5 bp。文库随机测序获得的70个全长cDNA,从中发现18个已知基因和5个未知基因。已知基因主要为多肽/蛋白质合成相关基因,共9个;免疫相关基因4个,分别是抗菌肽hyastatin、C-reactive prote in-1、profilin和m asquerade-like prote in,且4个免疫相关基因共有48个克隆,占测序总克隆的68.6%,表明血细胞中免疫相关基因表达非常活跃。研究结果证实,构建血细胞全长cDNA文库是大规模克隆三疣梭子蟹免疫相关基因的可靠途径,并为深入研究免疫相关基因的功能和免疫机制奠定基础。     

梭子蟹酵母菌人工感染实验和组织病理学初步研究

近年,浙江省舟山市暂养梭子蟹(Portunus trituberculatus)连续暴发“乳化病”,发病蟹均分离到一种酵母菌。本实验以该株酵母菌通过肌肉注射方式,对三疣梭子蟹、红星棱子蟹、日本鲟3个品种的健康蟹进行了人工感染实验,以验证其致病性。结果发现,该菌株能感染试验蟹类,并出现与自然发病蟹类似的症状。从感染蟹的体液、肝胰腺、心脏等部位分离到了酵母菌,但未分离到细菌,也未发现寄生虫。酵母菌在病蟹的肝胰腺、鳃、心脏中大量侵袭,并引起这些组织发生以坏死为主的变质性病变,其病理特征主要表现为：细胞肿胀、变性、坏死,某些细胞的细胞核固缩、碎裂或崩解。初步确认该酵母菌是引发梭子蟹“乳化病”的病原。     

三疣梭子蟹水通道蛋白 1 cDNA 及其盐度胁迫下的表达分析

采用RACE技术克隆获得总长为1 712 bp的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)水通道蛋白基因全长cDNA序列,命名为PtAQP基因.该基因5'和3'非编码区分别为153 bp和788 bp,开放阅读框为771 bp,推测编码256个氨基酸,预测分子量为27.0 kD,理论等电点为8.26.生物信息学分析表明,PtAQP含有6个跨膜区和2个NPA单元,具有与MIP家族匹配的保守氨基酸序列,属于稳定蛋白;同源性和系统进化分析表明,三疣梭子蟹PtAQP氨基酸序列与可口美青蟹(Callinectes sapidus) AQP1的同源性最高(87％),与可口美青蟹紧密聚为一支;荧光定量RT-PCR分析表明,PtAQP基因在各组织中均有表达,而在胃中的相对表达量最高.通过分析PtAQP基因在盐度胁迫中的表达规律发现,盐度胁迫可显著改变PtAQP基因在三疣梭子蟹鳃和肝胰腺中的表达模式,整体呈先下降后上升最后下降到初始水平的表达趋势.该研究结果表明,PtAQP基因在三疣梭子蟹渗透压调节中发挥重要作用.     

锯缘青蟹和三疣梭子蟹幼体饵料的研究

采用３种单细胞藻类，３种动物性饵料和４种人工饵料，分别喂养不同发育期的锯缘青蟹和三疣梭子蟹幼体，根据其变态速度和存活率比较各种饵料的饲喂效果。     

三疣梭子蟹基因组小卫星特征分析

通过构建三疣梭子蟹部分基因组文库，对获得的4 164个克隆测序，共获得总长度为622 409bp的DNA序列。在序列拼接后长度500～1500bp的709个克隆中，筛选到130个小卫星序列，其序列总长度占测序序列总长度的2.55%。小卫星序列中，以12bp重复单位的序列数量最多（10.77%），总体趋势表现为重复单位越长，相应的重复序列数目越少（R=-0.663，p＜0.01）。小卫星重复单位拷贝数分布范围以8bp重复单位最广为3.9～66.5；其次是13bp重复范围在2.0～40.6；再次是26bp重复，范围在2.3～21.0。平均拷贝数最高的三种重复类型分别为8bp重复(19.96),25bp重复(16.00)和22bp重复(15.85)。小卫星序列中各重复单位的拷贝数分布范围2～66.5，集中分布在2～25，且表现为拷贝数目越大，其相应的重复序列数目越低的趋势。130个重复序列分别由123种重复单位所组成, 因而小卫星重复序列的类型很多。 我们初步分成三类：两种碱基组成类别、三种碱基组成类别和四种碱基组成类别, 并进一步根据各个重复序列中所含有的碱基种类的数量从大到小排列这些碱基而分成若干小类。从这些分类中可以看出，三疣梭子蟹基因组中的小卫星整体上是富含A/T的重复序列, 并揭示了其与微卫星重复序列之间的关系, 即一部分小卫星重复序列可能起源于微卫星序列。     

不同阶段三疣梭子蟹保护酶及消化酶活性研究

以三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的幼蟹、雌性成蟹及抱卵雌蟹为研究对象,分别测定比较了野生和养殖蟹肌肉中的超氧化物歧化酶(SOD)及肝胰腺中的胃蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性,旨在揭示三疣梭子蟹不同生长阶段的消化酶和SOD酶活性的变化规律,及其与生长环境之间的关系。结果表明:(1)幼蟹、成蟹和抱卵蟹的SOD酶均表现为野生蟹显著高于养殖蟹(P<0.05);野生成蟹的脂肪酶和胃蛋白酶活性亦显著高于养殖蟹,是养殖蟹的2.5倍以上。因此,养殖蟹的机体健康水平、免疫保护和抗应激能力不及野生蟹,尤以幼蟹阶段SOD酶活性最低,抗逆境力最差。(2)野生和养殖幼蟹的淀粉酶活性分别为(1.57±0.09)U.mg-1和(2.61±0.01)U.mg-1,显著高于成蟹和抱卵蟹(P<0.05);野生和养殖成蟹的胃蛋白酶活性分别为(5.83±0.45)U.mg-1和(2.77±0.10)U.mg-1,显著高于幼蟹和抱卵蟹(P<0.05),是幼蟹和抱卵蟹的2～3倍;脂肪酶活性以养殖抱卵蟹最高,野生成蟹次之;消化酶活性变化与蟹的生长阶段及食性转变相关。     

利用16S rRNA和COI基因序列对三疣梭子蟹不同群体遗传特征的比较分析

采用PCR扩增技术对三疣梭子蟹日本北海道群体、韩国东海岸群体和我国山东即墨市会场村群体3个野生群体的16S rRNA和COI基因片段进行了扩增和测序,分别得到了长度为523和658bp的片段。通过统计变异位点、平均核苷酸差异数和核苷酸多样性指数,分析比较了不同群体间的序列差异和遗传多样性水平。结果显示,我国会场三疣梭子蟹野生群体的遗传多样性水平较低。用MEGA4.0软件中的NJ法构建的分子进化树,基于16S rRNA片段构建的NJ系统树所反映的分类关系与基于COI基因片段构建的系统树并不一致,主要不同在于与日本蟳的分类关系上,基于16S rRNA基因片段构建的NJ系统树显示梭子蟹科的3个属聚为两大支:三疣梭子蟹不同的单倍型先聚在一起,再和梭子蟹属的远海梭子蟹及塞氏梭子蟹聚为一支;而青蟹属的3种蟹先聚在一起,再和日本蟳聚为一支。而基于COI基因片段构建的系统树显示,梭子蟹属先与青蟹属的两种蟹聚为一支,然后再与日本蟳聚在一起。本研究共发现19种单倍型,我国会场群体与日本北海道群体、韩国东海岸群体均有共享单倍型,表明我国会场群体与国外两个野生群体的遗传背景相似。这些资料为我国三疣梭子蟹的种质资源保护和利用提供了基础的分子生物学依据。     

三疣梭子蟹血淋巴细胞及血液生化指标的初步研究

采用记数板记数,常规法涂片,在光学显微镜下对三疣梭子蟹进行细胞体、细胞核的测量及血淋巴细胞的分类记数,并测定血液生化指标。实验结果表明:雌性梭子蟹血淋巴细胞密度较高,并且血细胞的个体差异较大,小颗粒细胞约占细胞总数的84%,大颗粒细胞约占14%,无颗粒细胞最少,而且变异系数较大;三类细胞的大小无显著差异。三疣梭子蟹血清蛋白含量较低,雌蟹血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶及乳酸氨酶活性远远高于雄蟹。研究结果显示:性腺发育雌蟹的细胞密度及酶活性显著高于雄蟹。