SIRT1对牦牛卵母细胞体外成熟与老化的影响

旨在探索SIRT1在牦牛卵母细胞体外成熟与老化过程中的作用。本研究在体外成熟液中分别添加SIRT1特异性激动剂SRT2104 (SRT组)和特异性抑制剂Inauhzin (INZ组),牦牛卵丘卵母细胞复合体(COCs)体外培养24 h后,观察卵丘细胞的扩展和第一极体的排出情况;利用免疫荧光检测体外培养24与36 h后卵母细胞内的ROS水平;采用实时荧光定量PCR法检测体外培养24与36 h后卵母细胞内SIRT1、FOXO3a、SOD2以及Bax的表达水平;体外培养24与36 h后的牦牛卵母细胞进行体外受精,观察并统计其卵裂率与囊胚形成率。结果显示,体外培养24 h,SRT组的卵丘细胞扩展程度显著高于对照组(P0.05),而INZ组的卵丘细胞扩展程度和第一极体排出率显著低于对照组(P0.05)。随着体外培养时间的增加,卵母细胞内的ROS水平显著增加(P0.05);添加SRT2104能显著抑制卵母细胞中ROS水平的积累(P0.05),而添加Inauhzin则显著上调卵母细胞内的ROS水平(P0.05)。体外培养24 h后,SRT组SIRT1、FOXO3a与SOD2的表达水平显著高于对照组(P0.05),但Bax的表达水平显著降低(P0.05);INZ组的SIRT1、FOXO3a与SOD2表达均显著低于对照组(P0.05),但Bax的表达水平显著上调(P0.05)。牦牛卵母细胞体外培养24 h后,SRT组的卵裂率与囊胚形成率显著高于INZ组和对照组(P0.05);卵母细胞体外培养36 h后,INZ组的卵裂率和囊胚形成率显著低于其他组(P0.05)。综上表明,SIRT1参与了牦牛卵母细胞的体外成熟,在体外培养液中适当添加SIRT1激动剂,有利于卵母细胞体外成熟及缓解老化,同时改善早期胚胎的发育能力。     

KDM1A对牦牛卵母细胞减数分裂成熟及其发育潜能的影响

旨在探讨KDM1A对牦牛卵母细胞减数分裂成熟及其发育潜能的影响。本研究在体外成熟液中添加不同浓度的KDM1A特异性抑制剂GSK-KDM1A,牦牛卵丘-卵母细胞复合体（COCs）体外培养24 h后,观察卵丘细胞的扩展和第一极体的排出情况;利用免疫荧光检测体外培养过程中卵母细胞内KDM1A的表达模式;采用实时荧光定量PCR检测体外培养卵母细胞内Kdm1a、Oct-4、Sox-2以及Nanog的表达水平;体外培养成熟后的牦牛卵母细胞进行体外受精,观察其卵裂率与囊胚形成率。结果显示,体外培养24 h后,GSK-KDM1A组的卵丘细胞扩展程度显著低于对照组（P<0.05）,而320 nmol·L^-1组的卵丘细胞扩展程度和第一极体排出率均显著低于160 nmol·L^-1组（P<0.05）。在卵母细胞体外成熟过程中,Kdm1a呈现动态表达模式,MⅠ期的表达水平显著低于GV和MⅡ期（P<0.05）;添加GSK-KDM1A能显著抑制卵母细胞中KDM1A蛋白的表达（P<0.05）,320 nmol·L^-1组各时间点KDM1A的表达量均显著低于160 nmol·L^-1组（P<0.05）。GSK-KDM1A组卵母细胞内Oct-4与Sox-2的表达水平显著高于对照组（P<0.05）,但Nanog的表达水平无显著差异（P>0.05）。牦牛卵母细胞体外成熟后,GSK-KDM1A组的卵裂率显著低于对照组（P<0.05）,但囊胚形成率无显著变化（P>0.05）。综上表明,KDM1A参与调控牦牛卵母细胞减数分裂成熟过程,GSK-KDM1A能有效抑制KDM1A的表达,影响卵母细胞减数分裂成熟及其发育潜能,揭示KDM1A在此过程中扮演重要角色。     

环境雌激素灭多威对牛卵母细胞体外培养质量的影响

试验旨在研究体外培养液中添加灭多威（methomyl，MET）对牛卵母细胞质量的影响。通过免疫荧光染色和实时荧光定量PCR等方法检测牛卵母细胞的卵丘细胞扩展程度、第一极体排出率、活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平、谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平、线粒体膜电位（ΔΨm）以及凋亡相关基因的表达进行评价。结果显示，不同浓度MET不影响卵丘细胞的扩展程度，但200 μmol/L MET处理组卵母细胞的第一极体排出率显著低于对照组（P<0.05）。与对照组相比，200 μmol/L MET处理组的卵母细胞ROS水平显著升高，GSH水平、线粒体膜电位（ΔΨm）均显著降低（P<0.05）。此外，本研究还发现，200 μmol/L MET处理组卵母细胞中促凋亡基因Caspase-3和Bax的mRNA转录水平显著升高，抗凋亡基因Bcl-xl的mRNA转录水平显著降低（P<0.05）。上述结果表明，MET可以通过增加氧化应激和细胞凋亡来降低体外培养牛卵母细胞的质量。     

绵羊miR-127/FOXO4反馈环路及其对卵泡颗粒细胞凋亡相关基因表达的影响

旨在研究oar-miR-127/FOXO4反馈环路及其对绵羊卵泡颗粒细胞的作用。本研究利用Promoter 2.0预测绵羊miR-127启动子,利用JASPAR数据库预测转录因子FOXO4与oar-miR-127启动子区的结合位点,构建包含预测结合位点的pGL3-basic-miR-127荧光素酶报告载体和pcDNA-FOXO4过表达载体;利用TargetScan软件在线预测oar-miR-127与FOXO4基因3'-UTR区结合位点,构建包含预测结合位点的pmir-GLO-FOXO4野生型、突变型和缺失型荧光素酶报告基因重组质粒;将pGL3-basic-miR-127荧光素酶报告载体和pcDNA-FOXO4过表达载体共（或单独）转染体外培养的绵羊卵泡颗粒细胞,FOXO4突变型、野生型和缺失型重组质粒与miR-127 mimic/mimic NC共转染体外培养的293T细胞,48 h后检测荧光素酶活性;pcDNA-FOXO4过表达载体（miR-127 mimic/mimic NC）转染绵羊卵泡颗粒细胞48 h,利用qRT-PCR检测miR-127（FOXO4）及凋亡基因（Casp3、Bax及BCL2）的表达水平。过表达转录因子FOXO4显著降低了oar-miR-127启动子相对荧光素酶活性（P<0.05）和oar-miR-127表达水平（P<0.05）;miR-127 mimic和FOXO4野生型重组质粒共转染的颗粒细胞荧光素酶活性显著低于共转染miR-127 mimic和FOXO4缺失/突变型重组质粒的细胞（P<0.05）。转染miR-127 mimic的颗粒细胞中FOXO4表达量显著降低（P<0.05）,Casp3和Bax基因表达水平极显著升高（P<0.001）;过表达转录因子FOXO4的颗粒细胞中Casp3和Bax的表达水平无显著变化（P>0.05）,但BCL2相对表达量显著降低（P<0.05）。本研究证实了oar-miR-127与靶基因FOXO4间存在反馈环路,并促进绵羊卵泡颗粒细胞的凋亡,为研究其在绵羊卵泡发育中的作用机制奠定了基础。     

脱氧雪腐烯醇(DON)对牛卵母细胞体外成熟及发育能力的影响

本试验旨在探究脱氧雪腐烯醇（DON）对牛卵母细胞体外成熟发育的影响及其作用机制。将牛卵丘卵母细胞复合体分别在含DON浓度为0、50、250、500、1 000 ng·mL^-1的体外成熟培养液中进行体外成熟,检测卵丘细胞扩展程度及第一极体排出率,构建DON毒性模型。然后,借助此模型研究DON对卵母细胞的线粒体分布及后续受精卵裂率、囊胚发育率的影响,探究DON对牛卵母细胞体外成熟及后续发育能力的影响;通过检测体外成熟卵母细胞内的氧化相关因子（ROS、GSH）水平和抗氧化基因CAT、GPx4的mRNA表达量,揭示DON影响牛卵母细胞体外发育能力的分子机制。结果表明,250、500 ng·mL^-1的DON显著抑制卵母细胞的第一极体排出（P<0.05）,1 000 ng·mL^-1的DON极显著抑制第一极体排出（P<0.01）; 250 ng·mL^-1的DON显著抑制卵丘卵母细胞扩展（P<0.05）,500、1 000 ng·mL^-1的DON极显著抑制卵丘细胞扩展（P<0.01）;后续试验选取DON浓度为500 ng·mL^-1作为毒性模型（DON组）,与不含DON组（对照组）进行比较研究,结果发现,对照组与DON组的线粒体均匀分布比例（60.2%vs.40.0%）存在显著差异（P<0.05）;试验组较对照组的受精卵裂率（33.6±3.6%vs.（67.7±2.6）%）及早期囊胚率（（0.0±0.0）%vs.（18.3±2.2）%）均显著降低（P<0.05）;试验组较对照组,卵母细胞内ROS水平（1.6 vs.1.0）显著升高（P<0.05）,GSH相对水平（0.4 vs.1.0）显著降低（P<0.05）,抗氧化基因CAT与GPx4的mRNA相对表达量（0.0 vs.1.0;0.6 vs.1.0）显著降低（P<0.05）。以上研究表明,DON对卵母细胞的体外成熟及早期胚胎发育具有抑制作用,其作用机制与DON破坏牛卵母细胞内抗氧化系统平衡相关。     

2-氨基乙基联苯基硼酸酯对玻璃化冷冻牛成熟卵母细胞发育能力的影响

【目的】研究内质网IP3受体（IP3R）抑制剂2-氨基乙基联苯基硼酸酯（2-APB）对玻璃化冷冻-解冻牛MⅡ期卵母细胞发育能力的影响。【方法】将体外成熟24 h的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）用0.1%透明质酸酶消化去除卵丘颗粒细胞，获得的卵母细胞分为对照组和2-APB组，采用OPS法进行玻璃化冷冻，对照组直接进行玻璃化冷冻，2-APB组在玻璃化冷冻前先用10 μmol/L 2-APB预处理10 min。2 d后解冻卵母细胞，统计解冻后（0 h）及恢复培养2 h时卵母细胞的存活率，用FITC-PNA荧光探针检测恢复培养2 h时卵母细胞皮质颗粒（CG）的分布，用2'，7'-DCHFDA和Cell Tracker Blue CMF2HC分别检测胞内活性氧（ROS）和谷胱甘肽（GSH）含量。将成熟培养24 h未冷冻卵母细胞（Fresh组），与解冻后恢复2 h的对照组和2-APB组卵母细胞同时进行孤雌激活，于培养的第2、7天分别统计孤雌胚胎的卵裂率和囊胚率。【结果】与对照组相比，2-APB组冷冻-解冻卵母细胞0和2 h的存活率均显著增加（P＜0.05）；2-APB组皮质颗粒皮质区分布比例显著提高（P＜0.05），损伤型分布比例显著降低（P＜0.05）；2-APB组卵母细胞内GSH含量显著增加（P＜0.05），ROS含量显著降低（P＜0.05）；2-APB组卵母细胞孤雌激活胚胎的卵裂率、囊胚率均显著增加（P＜0.05），且与Fresh组无显著差异（P＞0.05）。【结论】2-APB预处理可通过增加卵母细胞内GSH含量，降低卵母细胞皮质颗粒损伤型分布比例和胞内ROS含量，提高玻璃化冷冻保存牛MⅡ期卵母细胞质量及早期胚胎发育能力。     

单宁酸对猪卵母细胞体外成熟及胚胎发育能力的影响

研究旨在探讨单宁酸对猪卵母细胞体外成熟质量及其胚胎发育能力的影响。在猪卵丘卵母细胞复合体（COCs）体外成熟培养液中添加不同浓度（0、1、10、100 μg/mL）单宁酸培养42 h后,检测COCs的扩散程度和卵丘细胞扩散指数,统计COCs的体外成熟率,检测成熟卵母细胞内谷胱甘肽（glutathione,GSH）、活性氧（reactive oxygen species,ROS）和生长分化因子9（growth differentiation factor 9,GDF9）的水平,并统计孤雌激活及体外受精胚胎48和168 h的卵裂率、囊胚率及囊胚总细胞数。结果显示,与对照组相比,10 μg/mL单宁酸组卵丘细胞扩散指数显著提高（P<0.05）,100 μg/mL单宁酸组显著降低（P<0.05）;1和10 μg/mL单宁酸组卵母细胞成熟率差异不显著（P>0.05）,100 μg/mL单宁酸组卵母细胞成熟率显著降低（P<0.05）;1和10 μg/mL单宁酸组GSH和GDF9水平显著提高（P<0.05）,ROS水平显著降低（P<0.05）。孤雌胚胎和体外受精胚胎发育能力结果显示,与对照组相比,各单宁酸组卵裂率差异不显著（P>0.05）,10 μg/mL单宁酸组孤雌胚胎囊胚率及体外受精胚胎囊胚率显著提高（P<0.05）,100 μg/mL单宁酸组孤雌胚胎囊胚细胞数及体外受精胚胎囊胚细胞数均显著低于其他各组（P<0.05）。以上结果表明,10 μg/mL单宁酸可通过提高卵丘细胞扩散能力及GSH和GDF9水平、降低卵母细胞内ROS水平,改善猪卵母细胞成熟质量,提高孤雌胚胎及体外受精胚胎的发育能力。     

RFRP-3对猪卵母细胞体外成熟的影响

旨在研究RFRP-3对猪卵母细胞体外成熟的影响。本研究采用从屠宰场收集健康母猪的卵巢中挑取的GV期卵母细胞，随机分为3组，在培养基中分别添加0、10^-6和10^-8mol·L^-1 RFRP-3培养猪卵母细胞44 h后统计各组卵母细胞的成熟率；在后续试验中将收集到的卵母细胞随机分为2组，在培养基中分别添加0和10^-8 mol·L^-1 RFRP-3培养猪卵母细胞44 h，观察猪卵母细胞的卵丘扩展情况并计算各组的卵丘扩展指数和各组卵母细胞的成熟率；利用qRT-PCR检测卵丘扩展因子(PTGS2、HAS2、PTX3)、卵母细胞分泌因子(GDF9、BMP15)和周期蛋白相关基因(CCNB1和CDK1)的表达变化；利用ELISA试剂盒检测MPF和cAMP的含量；采用放射免疫法检测孕酮和雌激素的浓度，每组卵母细胞量不少于100枚，每个试验重复3次。结果表明，与对照组相比，添加10^-8mol·L^-1 RFRP-3培养猪卵母细胞可极显著降低卵母细胞的成熟率(P<0.01)；通过显微镜观察并计算卵丘扩展指数发现，试验组中卵丘扩展无明显变化(P>0.05)，但卵丘扩展因子(PTGS2、HAS2、PTX3)的表达极显著下降(P<0.01)；RFRP-3可以极显著降低猪卵母细胞MPF的含量(P<0.01)，对cAMP的含量无显著影响(P>0.05)；添加RFRP-3可促进GDF9(P<0.01)和BMP15(P<0.05)的表达，抑制CCNB1(P<0.05)和CDK1(P<0.05)的表达；同时试验组培养基中孕酮、雌激素的浓度也极显著下降(P<0.01)。综上，RFRP-3通过调控猪卵母细胞成熟相关因子和卵丘扩展因子的表达以及类固醇激素的分泌，从而抑制卵母细胞的体外成熟。本研究为阐明RFRP-3对哺乳动物卵母细胞的调控作用奠定理论基础。     

藏红花素对小鼠卵母细胞体外成熟能力的影响

试验旨在探讨藏红花素（crocin）的抗氧化应激作用对小鼠卵母细胞体外成熟及后续胚胎发育能力的影响。在体外成熟（IVM）培养液中添加不同浓度藏红花素（0、5、10、15、20、25、30 μmol/L），小鼠卵母细胞在体外成熟培养12 h后，检测卵母细胞第一极排出情况、卵母细胞胞质内活性氧（ROS）和谷胱甘肽（GSH）含量，并进行体外受精（IVF）；体外受精后6 h统计受精率，24 h统计卵裂率，96 h统计囊胚率。结果显示，与对照组相比，10、15 μmol/L藏红花素显著提高了卵母细胞第一极体排出率（P<0.05）；当藏红花素浓度继续增加时，卵母细胞的第一极体排出率下降，30 μmol/L藏红花素显著降低了卵母细胞第一极体排出率（P<0.05）；5、10、15 μmol/L藏红花素均显著降低了卵母细胞ROS含量（P<0.05），10、15 μmol/L藏红花素均显著提高了卵母细胞GSH含量（P<0.05）。与对照组相比，10 μmol/L藏红花素组受精率、卵裂率、囊胚率差异均不显著（P>0.05），15、20、25、30 μmol/L藏红花素均显著降低受精率和囊胚率（P<0.05），对卵裂率影响不显著（P>0.05）。结果表明，在小鼠卵母细胞体外成熟培养液中添加10 μmol/L藏红花素可以显著增加第一极体排出率，显著降低卵母细胞ROS含量、提高卵母细胞GSH含量，但对受精后的胚胎发育无显著影响。     

玻璃化冷冻对牦牛未成熟卵母细胞发育能力及COC转录组的影响

旨在探讨玻璃化冷冻-解冻对牦牛未成熟卵母细胞发育能力及卵丘-卵母细胞复合体（COCs）转录组的影响，为完善牦牛COCs冷冻保存技术提供理论依据。本研究将未经成熟培养的牦牛COCs进行玻璃化冷冻-解冻后分为2组，A组：COCs体外成熟（IVM）后用普通牛精子进行体外受精（IVF），获得的受精卵在G-1胚胎培养液中培养72 h后转入G-2培养液培养96 h；B组：IVF后，受精卵在G-1培养液培养120 h后转入G-2培养液培养48 h；以未进行冷冻处理的新鲜COCs作为对照组（C组）：IVF后，受精卵在G-1培养液培养72 h后转入G-2培养液培养96 h。对牦牛新鲜COCs（n=3）和玻璃化冷冻-解冻的COCs（n=3）进行扩增、建库和转录组测序（RNA-seq）分析。结果发现，B组的卵裂率、囊胚率显著高于A组（P<0.05），但A组和B组的卵裂率、囊胚率均显著低于C组（P<0.05）。以|log₂（fold change）|≥ 2，Q<0.05为阈值，牦牛冻融COCs相对于新鲜COCs共筛选出851个差异表达基因（DEGs），其中上调846个，下调5个。GO分析表明，DEGs主要富集于生物过程、细胞组分和分子功能3大类；KEGG注释结果表明，DEGs富集到258条通路，其中16条通路显著富集（P<0.05）。研究表明，IVF后在G-1培养液中培养120 h可以提高牦牛玻璃化冷冻卵母细胞的后续发育能力；玻璃化冷冻影响牦牛COCs转录组，从而降低卵母细胞的发育潜力。该发现为完善牦牛COCs玻璃化冷冻技术提供了一定的理论基础。     

Effects of KDM1A on the Meiotic Maturation and Developmental Potential of Yak Oocytes

The purpose of this study was to explore the effects of KDM1A on the meiotic maturation and developmental potential of yak oocytes. The specific inhibitor GSK-KDM1A of KDM1A was added into in vitro maturation medium of yak oocytes. After 24 h in vitro culture of yak cumulus oocyte complexes (COCs), the expansion of cumulus cells and the extrusion of the first polar body were observed. The expression level of KDM1A in oocyte was measured by immunofluorescence during in vitro culture. The expression levels of Kdm1a, Oct-4, Sox-2 and Nanog in oocytes were detected by RT-qPCR. Then, yak oocytes were fertilized after in vitro culture, and the cleavage rate and blastocyst formation rate were observed, respectively. The results showed that the cumulus cells expansion in GSK-KDM1A groups were significant lower than those in control group (P<0.05) after 24 h culture, and the cumulus cells expansion and the first polar body extrusion rate in 320 nmol·L^-1 group were significantly lower than those in 160 nmol·L^-1 group (P<0.05). During oocyte in vitro maturation, Kdm1a showed dynamic expression profile, and the expression level of Kdm1a in MⅠ-stage was significantly lower than that in GV-stage and MⅡ-stage (P<0.05). The GSK-KDM1A could significantly inhibit the expression of KDM1A protein in oocytes (P<0.05), and the expression of KDM1A in 320 nmol·L^-1 group was significantly lower than that in 160 nmol·L^-1 group (P<0.05). The expression levels of Oct-4 and Sox-2 in GSK-KDM1A group were significantly higher than that in control group (P<0.05), but there was no significant difference in the expression of Nanog (P>0.05). After 24 h culture, the cleavage rates of oocytes in GSK-KDM1A groups were significantly lower than those in control group (P<0.05), while the blastocyst formation rate was not significantly different (P<0.05). In conclusion, KDM1A is involved in regulating the meiotic maturation process of yak oocytes. GSK-KDM1A can effectively inhibit the expression of KDM1A, affect the meiotic maturation and developmental potential of oocytes, which reveal that KDM1A plays an important role in this process.     

微囊藻毒素-LR对猪体外成熟卵母细胞氧化损伤与凋亡的影响

旨在探讨微囊藻毒素-LR(microcystin-LR,MC-LR)对体外成熟猪卵母细胞的毒性损伤及其潜在损伤机制.本研究从屠宰场所获得的猪卵巢中收集GV期卵母细胞,将其随机分为4组,在卵母细胞体外成熟培养液中分别添加0、20、40和60μg? mL-1 MC-LR,研究MC-LR对卵母细胞第一极体(Pbl)排出、纺锤...     

乙草胺对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

【目的】研究乙草胺对小鼠卵母细胞体外成熟的影响,为研究体内乙草胺对卵母细胞质量的影响提供参考。【方法】将收集的卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes,COCs)置于含有不同浓度(0(对照组)、10、50、100、130、200 μmol/L)乙草胺的体外成熟培养液中培养14 h,统计卵母细胞第一极体排出率,进行体外受精后,统计体外受精胚胎的囊胚率,筛选出适宜于卵母细胞体外培养的乙草胺浓度。将COCs在对照组和筛选出的适宜浓度的乙草胺组成熟培养液中培养14 h后,利用DCFH-DA检测卵母细胞活性氧(ROS)水平;利用CellTracker^TM蓝色染料检测卵母细胞谷胱甘肽(GSH)水平;利用JC-1染色法检测卵母细胞线粒体膜电位水平(mitochondrial membrane potential,MMP);利用实时荧光定量PCR检测卵母细胞内凋亡相关基因的表达水平,利用Hoechst 33342染色检测体外受精胚胎的囊胚细胞总数,用Fluorescein-dUTP染色法检测囊胚细胞凋亡率。【结果】与对照组相比,100、130、200 μmol/L乙草胺组卵母细胞的第一极体排出率显著降低(P＜0.05),100和130 μmol/L乙草胺组体外受精胚胎的囊胚率显著降低(P＜0.05),200 μmol/L乙草胺组体外受精胚胎未发育到囊胚期,因此选择100和130 μmol/L乙草胺进行后续试验。与对照组相比,在100和130 μmol/L乙草胺组中,卵母细胞ROS水平显著升高(P＜0.05),GSH水平及MMP显著降低(P＜0.05),卵母细胞中促凋亡基因Caspase-9的相对表达量显著升高(P＜0.05),而抗凋亡基因Bax、Bcl-2的相对表达量显著降低(P＜0.05);100和130 μmol/L乙草胺组囊胚细胞总数显著降低(P＜0.05),囊胚细胞凋亡率显著升高(P＜ 0.05)。【结论】乙草胺通过提高卵母细胞内ROS及促进卵母细胞凋亡降低卵母细胞的质量,从而影响卵母细胞受精后胚胎的发育潜力。     

柠檬苦素对小鼠卵母细胞体外成熟及其体外受精胚胎发育的影响

【目的】研究柠檬苦素(limonin,Lim)对小鼠卵母细胞体外成熟(IVM)及后续体外受精(IVF)胚胎发育潜能的影响,旨在为体外成熟培养系统的优化提供参考。【方法】在小鼠体外成熟培养液中添加不同浓度的Lim(0、10、20、50 μmol/L),成熟培养12 h后统计小鼠卵母细胞第一极体(PBI)排出率,筛选体外成熟培养液中添加Lim的最适浓度;在体外成熟培养液中添加最适浓度的Lim,以0 μmol/L Lim为对照组,成熟培养12 h,通过免疫荧光染色检测活性氧(ROS)、谷胱甘肽(GSH)以及线粒体膜电位(MMP)水平;通过实时荧光定量PCR检测卵母细胞抗氧化及凋亡相关基因的mRNA表达水平。将最适Lim组及对照组卵母细胞体外成熟24 h后进行体外受精,于体外受精24 h和3.5 d分别统计胚胎卵裂率和囊胚率,并用Fluorescein-dUTP和Hoechst 33342染色分别检测囊胚总细胞数及囊胚内凋亡细胞比率。【结果】与0 μmol/L Lim组相比,20 μmol/L Lim组小鼠卵母细胞PBI排出率显著升高(P＜0.05),后续试验均用20 μmol/L Lim进行处理。与对照组组相比,20 μmol/L Lim组小鼠卵母细胞内ROS水平显著降低(P＜0.05),GSH、MMP水平均显著增加(P＜0.05),抗氧化相关基因(GPx3、CAT和Prdx3)、抗凋亡相关基因(Bcl-2、Bcl-xl)表达水平均显著上调(P＜0.05),促凋亡相关基因(Caspase-3)表达水平显著下调(P＜0.05);体外受精胚胎的卵裂率、囊胚率、囊胚总细胞数均显著增加(P＜0.05),囊胚内细胞凋亡比率显著下降(P＜0.05)。【结论】在体外成熟培养液中添加20 μmol/L Lim可以通过抑制氧化应激和细胞凋亡、增加MMP水平提高小鼠卵母细胞质量,从而提高体外受精胚胎的发育潜力。     

维生素A对牦牛卵母细胞体外成熟及后续胚胎发育能力的影响

【目的】探究维生素A对牦牛卵母细胞体外成熟及后续胚胎发育能力的影响。【方法】以牦牛卵母细胞为研究对象，在其体外成熟培养液中分别添加0（对照组）、2、5、10和20 μmol/L维生素A，体外培养24 h统计第一极体排出率；对成熟后各组卵母细胞进行孤雌激活，在孤雌激活胚胎培养的第2和8天分别统计卵裂率和囊胚率；用实时荧光定量PCR检测各组MⅡ期卵母细胞中维生素A调控卵母细胞成熟典型信号通路中的节点基因RARα、RARβ、RARγ、RXRα、RXRβ、RXRγ、STRA8及非典型信号通路中的节点基因MEK和ERK1的相对表达量，筛选最佳维生素A处理浓度。在体外成熟培养液中添加最佳浓度维生素A，成熟6和24 h分别收集MⅠ和MⅡ期卵母细胞，将部分MⅡ期卵母细胞进行孤雌激活，收集激活8 d的囊胚，用实时荧光定量PCR检测GV、MⅠ和MⅡ期卵母细胞及孤雌激活囊胚中RARα、RXRα、STRA8基因的相对表达量。【结果】与对照组相比，2、5和10 μmol/L维生素A组第一极体排出率和卵裂率均显著提高（P<0.05），且2 μmol/L维生素A组均达到最高；2 μmol/L维生素A组囊胚率显著提高（P<0.05），20 μmol/L维生素A组第一极体排出率、卵裂率和囊胚率均显著降低（P<0.05）。实时荧光定量PCR结果表明，与对照组相比，2、5、10和20 μmol/L维生素A组RARα、RXRα和STRA8基因的相对表达量均显著增加（P<0.05），其中2 μmol/L维生素A组均达到最高，因此2 μmol/L维生素A对牦牛卵母细胞体外成熟的效果最好。与GV期卵母细胞相比，STRA8、RXRα、RARα基因的相对表达量在MⅡ期卵母细胞均极显著增加（P<0.01），在MⅠ及囊胚期差异均不显著（P>0.05）。【结论】在体外成熟过程中，添加2 μmol/L维生素A可以促进牦牛卵母细胞的成熟，能够显著提高孤雌激活胚胎的卵裂率，且维生素A主要通过典型信号通路调控牦牛卵母细胞的成熟。