凡纳滨对虾热休克蛋白70的原核高效表达

将凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）热休克蛋白70基因（heat shock protein 70，HSP70）克隆到原核表达载体pET-3c中，经酶切和DNA测序鉴定后，将重组质粒转入表达宿主BL21（DE3），在不同温度、时间下经IPTG诱导表达。收集菌液，进行SDS-PAGE和Western blot检测，并用软件Bandscan分析蛋白表达水平。结果表明，成功构建含凡纳滨对虾HSP70基因的重组表达载体pET-3c／HSP70，表达的目标蛋白相对分子量约为72kD，并能与小鼠抗人HSP70抗体特异性结合。37℃诱导5h目标蛋白表达量最高；但25℃诱导目标蛋白的可溶性比例达80％，目标蛋白占全菌总蛋白70％以上，均较37℃为高。     

脊尾白虾热休克蛋白HSP90基因的原核表达与鉴定

将脊尾白虾热休克蛋白90基因克隆到原核表达载体pET-30a中,经酶切验证和DNA测序鉴定后,将重组质粒转化表达宿主大肠杆菌Rosetta,优化温度、时间、IPTG和OD600表达条件进行诱导表达,收集菌液,进行SDS-PAGE和质谱检测,并用Quantity one软件分析蛋白表达水平。结果表明,成功构建了含脊尾白虾HSP90基因的重组表达载体pET-30a-HSP90,表达目的蛋白相对分子量为82.7kD,为HSP90蛋白。通过条件优化认为重组菌株Rosetta/pET-30a-HSP90的最佳诱导温度为37℃,最佳IPTG浓度为1.0mmol/L,最佳诱导时机和诱导时间分别为0.58h、7h。     

半滑舌鳎两种leptin基因的体外重组表达和生物活性分析

根据半滑舌鳎lepa和lepb编码氨基酸序列合成开放阅读框ORF肽段。利用原核表达载体pEQ30成功构建了半滑舌鳎lepa/pQE30和lepb/pQE30重组质粒,分别转化至大肠杆菌M15后,经IPTG诱导获得了N端含6个组氨酸的半滑舌鳎LepA和LepB重组蛋白。获得的重组蛋白大小均为16 ku,37°C下用0.5 mmol/L的IPTG诱导4 h后目的蛋白表达量最高,主要以包涵体形式存在。检测半滑舌鳎LepA和LepB重组蛋白浓度分别为0.3和0.25 mg/mL。Western blot免疫印迹和质谱分析表明,获得的LepA和LepB重组蛋白均具有免疫活性且序列正确。Ni2+-NTA亲和层析柱纯化可获得高纯度的半滑舌鳎LepA和LepB重组蛋白。离体孵育实验表明,获得的半滑舌鳎LepA和LepB重组蛋白能显著抑制半滑舌鳎下丘脑lepa、lepb和gnrh3 mRNA的表达水平,表明获得的重组蛋白具有明显的生物活性。研究结果可为探究leptin在半滑舌鳎生长发育中的调控机制提供重要参考。     

日本鳗鲡Ⅱ型干扰素基因(IFN-γ和IFN-γrel)的原核表达与纯化研究

分别以日本鳗鲡(Anguilla japonica)pMD19-T-IFNγ和pMD19-T-IFN-γrel重组克隆质粒为模板,采用PCR方法扩增日本鳗鲡IFN-γ和IFN-γrel基因,而后分别将IFN-γ和IFN-γrel成熟肽的编码序列克隆至原核表达载体pQE30和pET32a上,成功构建了重组表达载体pQE30-IFN-γ和pET32a-IFN-γrel。将重组表达载体pQE30-IFN-γ和pET32a-IFN-γrel分别转化入Escherichia coli M15和Escherichia coli BL21感受态细胞进行表达,并优化IPTG诱导表达体系后用SDS-PAGE电泳鉴定IFN-γ与IFN-γrel重组蛋白表达形式。IFN-γ与IFN-γrel重组蛋白经镍柱纯化后进行SDS-PAGE电泳检测和Western blot鉴定。结果显示,重组表达载体pQE30-IFN-γ与pET32a-IFN-γrel分别在E.coli M15和E.coli BL21中得以正确表达。重组IFN-γ蛋白分子量为21 kD左右,表达的融合蛋白以可溶性形式存在;重组IFN-γrel蛋白分子量为31 kD左右,以包涵体形式存在。且两者均在1.0 mmol·L~(-1) IPTG诱导6 h时表达量最高。经镍柱纯化和Western blot检测,成功获得高纯度的IFN-γ和IFN-γrel重组蛋白。建立了日本鳗鲡IFN-γ和IFN-γrel基因的原核表达系统,为进一步研究日本鳗鲡干扰素系统的功能及调控机制奠定了基础。     

半滑舌鳎食欲素A体外重组表达及活性分析

为了在蛋白水平上认识半滑舌鳎食欲素A(orexin A)的摄食调控作用及机制,利用原核表达载体pET32a成功构建了重组半滑舌鳎orexin A/pET32a质粒,转化至大肠杆菌BL21后经IPTG诱导获得了N端含6个组氨酸的半滑舌鳎orexinA重组蛋白。获得的重组蛋白大小为24.9 ku,32℃下用1.0 mmol/L的IPTG诱导6 h目的蛋白表达量最高,占菌体总蛋白的52.8%,并主要分泌在上清液中。Western blotting免疫印迹表明,获得的orexin A重组蛋白可被6×His抗体特异性识别。Ni~(2+)-NTA亲和层析柱纯化获得了高纯度的半滑舌鳎orexin A重组蛋白。下丘脑离体孵育实验表明,获得的orexin A重组蛋白能显著影响半滑舌鳎下丘脑NPY mRNA,orexin mRNA的表达水平和NPY肽的分泌,表明获得的重组蛋白具有生物活性。研究结果可为探究orexin A在半滑舌鳎摄食代谢中的作用机制及研制高效绿色的促摄食制剂提供基础资料。     

禽多杀性巴氏杆菌PlpB基因交叉保护力研究

根据报道的PM70菌株的PlpB基因序列,设计PlpB基因一对寡核苷酸引物。以C48-1菌株为实验材料,成功扩增PlpB基因的全序列,该片段共831bp。将扩增基因插入原核表达载体pGEX-KG,成功构建了重组表达质粒pKG-PlpB,并对pKG-PlpB重组表达质粒进行序列测定,结果表明:扩增序列与GenBank上所报道的PM70株的PlpB基因序列核苷酸同源性在99%以上。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经诱导获得大小约56KDa的表达蛋白。Western blot检测表明,该表达蛋白具有良好的反应原性。     

星突江鲽胰岛素样生长因子II的原核表达与生物活性分析

根据鲽形目和鲈形目鱼类的IGF-II基因保守序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆得到编码星突江鲽(Platichthys stellatus)IGF-II成熟肽的全长c DNA序列(210 bp),同源性分析显示IGF-II成熟肽在B、A和D区高度保守。利用原核表达载体p ET-28a构建了重组表达质粒(IGF-II/p ET28a),转化大肠杆菌BL21(DE3)后经IPTG诱导,获得了N端含6个组氨酸的重组蛋白。37℃条件下用1.0 mmol/L的IPTG诱导6 h,目的蛋白表达量最高,占菌体总蛋白的42.7%。重组蛋白主要以包涵体形式存在,经SDS-PAGE电泳检测,IGF-II重组蛋白大小为11.4 k D,Western-Blotting免疫印迹呈阳性。包涵体经6 mol/L盐酸胍变性、Ni2+离子亲和柱纯化和尿素梯度复性后,获得了纯化IGF-II蛋白。细胞增殖实验结果显示,重组蛋白可显著促进人胚胎肾细胞HEK293T的增殖,表明获得的IGF-II重组蛋白具有细胞水平的生物活性。研究结果为深入研究星突江鲽IGF-II的功能提供了基础资料。     

盐度胁迫下三疣梭子蟹热休克蛋白HSP90a的原核表达

为证明三疣梭子蟹HSP90a蛋白与盐度胁迫的相关性,实验根据GenBank上提供的三疣梭子蟹HSP90a基因蛋白编码区序列,构建pET28-HSP90a原核表达重组质粒在大肠杆菌DE3(BL21)中进行的盐度胁迫表达。结果显示,转重组质粒的大肠杆菌生存率明显高于转空载体的大肠杆菌,越接近大肠杆菌盐度耐受极限值,两者差异越显著,在盐度胁迫最高值(1 050 mmol/L)下,两者差异达到10.7倍,说明在盐度胁迫下三疣梭子蟹HSP90a对大肠杆菌有保护作用,能显著提高大肠杆菌对盐度胁迫的耐受力。由此推测,HSP90a蛋白可能参与了三疣梭子蟹盐度适应的生理过程。     

半滑舌鳎生长因子midkine的定点改造及原核表达

为进一步研究半滑舌鳎midkine(MK)成熟肽活性与功能,对半滑舌鳎生长因子MK成熟肽进行定点改造及原核表达.根据大肠杆菌偏爱密码子的特点,实验利用SOEing PCR法对半滑舌鳎MK成熟肽进行定点突变.将改造后的半滑舌鳎成熟肽MK克隆到载体质粒pET32a(+),构建原核表达载体pET32a(+)-MK,并转化至大肠杆菌BL21(DE3) pLysS菌株中.SDS-PAGE结果显示,与对照组相比,经IPTG诱导表达后半滑舌鳎重组蛋白MK存在于大肠杆菌上清液中,产物相对分子质量约为33 ku.研究表明,本实验对半滑舌鳎生长因子midkine成功进行了定点改造,原核表达质粒成功构建并在大肠杆菌中高效表达,且主要以可溶形式存在.     

青鱼Dazl基因的原核表达及其多克隆抗体制备

实验进行了青鱼( Mylopharyngodon piceus ) Dazl 基因的原核表达,兔抗青鱼源Dazl多克隆抗体的制备及抗体的特异性验证。首先将青鱼 Dazl 基因的编码区利用重组表达引物从pCS2- MpDazl 质粒中扩增出来,经酶切后连接到pET-28a载体中,构建pET-28a- MpDazl 重组表达载体。然后将pET-28a- MpDazl 重组质粒转化至大肠杆菌( Escherichia coli )BL21中,利用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷( IPTG)诱导表达,获得分子量为27 kD的Dazl重组蛋白。将纯化的Dazl重组蛋白作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,抗体的效价和特异性通过ELISA法和 Western blot检测。结果:成功构建重组表达载体pET-28a- MpDazl;以0.5 mmol/L IPTG在37 ℃条件下诱导4 h可获得高效表达的Dazl重组蛋白;制备的兔抗青鱼Dazl多克隆抗体能够特异性识别原核表达Dazl蛋白、青鱼卵巢的内源Dazl蛋白以及细胞中过表达的Dazl蛋白,并证实了青鱼Dazl蛋白在性腺中表达的特异性。