营养素和催乳激素通过哺乳动物雷帕霉素靶点调控乳蛋白的合成

研究结果表明,营养和内分泌系统影响奶牛乳腺内乳蛋白的翻译过程,但其分子机制还不是很清楚。因此,本试验旨在研究营养素和激素通过哺乳动物雷帕霉素(mTOR)信号路径对乳蛋白合成的影响。氨基酸混合物(AA)、能量底物(葡萄糖和醋酸盐)和激素混合物(皮质醇、胰岛素和催乳素)分别或混合添加到培养乳腺腺泡(泌乳奶牛乳腺中分离)的培养媒介中,同时测定乳蛋白合成和mTOR信号路径元件的磷酸化状态。结果表明,AA单独添加时比能量底物或激素混合物单独添加时,乳蛋白的合成提高50%。乳蛋白的合成不受葡萄糖或催乳素的影响。AA能刺激乳蛋白的合成,催乳素同时添加能够进一步增强乳蛋白的合成,但葡萄糖同时添加不能增强这种作用。催乳素能够诱导蛋白激酶B的磷酸化状态,并且AA或葡萄糖同时作为底物时能够增强这种磷酸化状态。AA和催乳素在刺激乳蛋白的合成和进一步提高乳蛋白合成的同时,也提高了mTOR底物(p70核糖体蛋白S6激酶±1、真核起始因子4E(eIF4E)结合蛋白-1(4E-BP1)和4E-BP1的分化异变体)的磷酸化状态。结果暗示营养素和激素可能通过mTOR信号路径调控乳蛋白的合成。     

营养素和催乳激素通过哺乳动物雷帕霉素靶点调控乳蛋白的合成（摘要）

研究结果表明,营养和内分泌系统影响奶牛乳腺内乳蛋白的翻译过程,但其分子机制还不是很清楚。因此,本试验旨在研究营养素和激素通过哺乳动物雷帕霉素（mTOR）信号路径对乳蛋白合成的影响。氨基酸混合物（AA）、能量底物（葡萄糖和醋酸盐）和激素混合物（皮质醇、胰岛素和催乳素）分别或混合添加到培养乳腺腺泡（泌乳奶牛乳腺中分离）的培养媒介中,同时测定乳蛋白合成和mTOR信号路径元件的磷酸化状态。     

营养素和激素通过哺乳动物雷帕霉素靶标信号通路调控乳蛋白合成

营养物质和内分泌虽能影响奶牛乳蛋白的合成,但至今这种调控作用的分子机制仍未完全阐明。本研究的目的是测定营养物质和激素是否是通过哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)信号通路调控乳蛋白合成。试验从泌乳奶牛乳腺组织中分离乳腺腺泡,用含有氨基酸(AA)、葡萄糖和乙酸(GA)或催乳激素(HIP)以其混合物的培养基处理腺泡,然后测定乳蛋白合成速率和mTOR信号通路中各元件的磷酸化状态。结果发现,培养基添加AA后可使乳蛋白合成率提高50%,而单独添加GA或HIP不影响乳蛋白合成。HIP可以增强AA调控乳蛋白合成,但GA没有增强AA的这种作用。HIP可诱导蛋白激酶B发生磷酸化,而且当AA或GA存在时,HIP能增强这种磷酸化作用。AA和HIP对乳蛋白合成的促进作用与mTOR的底物磷酸化有关,即与p70核糖体蛋白S6激酶-1和真核起始因子4E(eIF4E)结合蛋白-1(4E-BP1)的磷酸化有关。结果表明,营养物质和激素可能通过mTOR信号通路调控乳蛋白合成。     

淀粉和氨基酸对泌乳奶牛乳腺内乳蛋白合成调控的影响

本试验旨在研究乳腺内局部分子适应以调控乳蛋白的合成。研究假设氨基酸和产能底物通过系统和局部机制组合独立调控乳腺内氨基酸的代谢和乳蛋白的合成。试验选用6头具瘤胃瘘管的初产泌乳中期荷斯坦奶牛,随即分配到4个处理组中。试验采用重复的不完全4×4拉丁方试验设计。试验期间,试验动物的基础日粮组成(17.6%粗蛋白质和6.61MJ/kg泌乳净能)相同。泌乳奶牛限饲采食量至70%并通过蠕动泵连续36h分别灌注水、酪蛋白(0.86kg/d)、淀粉(2kg/d)和淀粉与酪蛋白的混合物(2kg/d淀粉+0.86kg/d酪蛋白)。整个试验期间测定乳产量和乳成分组成;灌注的最后8h每20min采集动脉和静脉血浆样品,用于测定乳腺对氨基酸的吸收率;每期灌注末采集乳腺组织样品,用于评定调控乳蛋白合成的细胞内信号分子磷酸化位点。结果显示,灌注酪蛋白组增加了动脉血浆中氨基酸的浓度,提高了乳腺从血浆中摄取氨基酸的效率,但对氨基酸的清除率和乳蛋白的产量没有影响。灌注淀粉组增加了乳产量和乳蛋白产量,提高了乳腺血浆流量,但降低了动脉血浆中氨基酸的浓度,同时,提高了乳腺对氨基酸的清除率和乳腺对氨基酸的净吸收量。灌注淀粉组同时提高了血浆中葡萄糖、胰岛素和胰岛素样生长因子-1的浓度,核糖体蛋白S6的磷酸化和内皮型一氧化氮合成酶含量也随之提高并伴随着乳蛋白产量和血浆流量的变化。灌注酪蛋白和淀粉的混合物处理组提高了哺乳动物雷帕霉素靶标的磷酸化。结果表明,不同的营养素刺激,乳蛋白合成调控的细胞信号分子机制反应不同。试验过程中,由于灌注酪蛋白对乳蛋白合成的影响不明显,未发现试验假设的酪蛋白和淀粉对动物代谢和细胞信号传导的独立效应。     

双向电泳分析蛋氨酸对奶牛乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质的影响

为了寻找奶牛乳腺上皮细胞核中与乳蛋白合成相关的重要蛋白质,从翻译水平揭示乳蛋白合成的机理,本试验应用双向凝胶电泳技术和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)的方法,分析添加蛋氨酸后奶牛乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质的变化,并采用Western blotting验证。质谱分析鉴定出5个表达上调的细胞核磷酸化蛋白质,分别是葡萄球菌核酸域包含蛋白质1、甘氨酰-tRNA合成酶、Septin-6、Twinfilin-1和延长因子1-beta,这些蛋白质的功能涉及DNA转录、mRNA翻译、蛋白质合成、细胞分裂、细胞形态发生及细胞周期的调控。     

雌激素处理的奶牛乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质组学分析

雌激素调节多种生理过程,包括乳腺生长发育、形态发生、增殖和分化及乳蛋白的表达。许多磷酸化蛋白调节乳蛋白合成,如磷酸化Stat5和mTOR,但在乳蛋白合成的转录和翻译后水平的调节鲜有报道。为了阐述雌激素在奶牛乳腺上皮细胞中的作用机制,本试验利用双向电泳和质谱分析,鉴定了雌激素调节的细胞核磷酸化蛋白质。在雌激素处理24h后,鉴定出7个表达上调的蛋白质,包括以前报道过的甘氨酰-tRNA合成酶,属于氨基酰-tRNA合成酶家族Ⅱ;这些蛋白质涉及翻译起始因子、GTP结合的核蛋白、热休克蛋白、泛素-蛋白酶体系统。这些筛选出来的蛋白质,揭露了雌激素影响奶牛乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质,为进一步研究乳合成的分子机制提供一个新的途径。     

生长激素和胰岛素样生长因子Ⅰ对奶牛乳蛋白合成关键激酶及调节因子mRNA表达量的影响

本试验旨在探讨生长激素(GH)和胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞内调控乳蛋白合成的关键激酶及调节因子mRNA表达量的影响。试验对纯化后的荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞进行4种处理,对照组采用无血清生长培养基,试验组在对照组的基础上分别添加GH(100 ng/mL)、IGF-Ⅰ(100 ng/mL)和GH(100 ng/mL)+IGF-Ⅰ(100 ng/mL)。培养24 h后,采用实时定量PCR(RT-qPCR)法测定κ-酪蛋白基因以及调控乳蛋白合成的关键激酶及调节因子的mRNA表达量,并测定生长激素受体(GHR)和胰岛素样生长因子Ⅰ受体(IGF-ⅠR)mRNA表达量。结果表明:体外培养的奶牛乳腺上皮细胞可以表达GHR和IGF-ⅠRmRNA,各试验组均能显著提高κ-酪蛋白(CSN3)mRNA表达量(P<0.05),但未发现GH和IGF-Ⅰ复合存在累积效应;与对照组相比,GH组有提高E74-样转录因子5(ELF5)mRNA表达量的趋势(P<0.10),而IGF-Ⅰ组显著提高了哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和核糖体蛋白S6激酶1(rpS6K1)mRNA表达量(P<0.05),GH+IGF-Ⅰ组未呈现加强作用。结果提示,GH和IGF-Ⅰ可能单独通过影响调控乳蛋白合成的关键激酶及调节因子mRNA表达来调节κ-酪蛋白的合成。     

必需氨基酸调控奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成的研究进展

乳蛋白含量的高低是衡量乳品质的重要指标，奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）是乳腺合成乳蛋白的基本功能单位。必需氨基酸（EAA）作为乳成分前体物质，其不仅是乳蛋白合成的底物，而且可以作为信号分子调控乳蛋白的合成。本文综述了近年关于EAA对BMECs乳蛋白合成的影响及其潜在的信号通路机制的研究进展，为今后系统研究氨基酸对BMECs乳蛋白合成的调控及提高泌乳奶牛氨基酸转化为乳蛋白的效率提供参考。     

奶牛乳蛋白产量的营养调节效应与乳腺真核起始因子-2(eIF2)和核糖体s6(S6)激酶-1(S6K1)的磷酸化有关

日粮蛋白质和能量同时影响泌乳动物乳蛋白的产量,必需氨基酸单独不能完全解释营养素对乳蛋白产量的影响。生长动物组织中,营养素对蛋白质合成受哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)和整合应激网络(ISR)的调控。本试验旨在探讨乳腺内营养素信号是否也通过mTOR和ISR网络调控乳蛋白的合成。泌乳奶牛饥饿22 h后,静脉内分别灌注必需氨基酸(EAA)和葡萄糖混合物,葡萄糖、l-Met+l-Lys、l-His或l-Leu 9 h。结果表明,EAA和葡萄糖混合物或葡萄糖能分别提高乳蛋白产量的33%和27%。Met+Lys或His产生的效应分别是EAA和葡萄糖混合物效应的35%和41%。乳腺组织中,EAA和葡萄糖混合物降低了ISR靶点eIF2的磷酸化,但增强了mTOR靶点S6K1和S6的磷酸化,同时刺激了乳蛋白的合成。葡萄糖提高了乳腺内S6K1的磷酸化(P0.05),降低了eIF2磷酸化62%,暗示着ISR网络在刺激乳蛋白产量中的作用。与此相反,EAA提高或趋向于(P0.1)提高乳腺内mTOR的活性(P0.05),但His,如葡萄糖一样降低了eIF2磷酸化62%。尽管EAA和葡萄糖混合物激活了乳蛋白合成信号的活性83%到127%,但EAA产生的效应还不到EAA和葡萄糖混合物效应的50%。因此,本试验结果表明,ISR和mTOR网络在调控乳蛋白产量中只起着部分的作用。     

奶牛乳腺中4F2hc基因的表达模式及亮氨酸对其表达的调控研究

为了研究4F2hc在奶牛乳腺中的表达模式及调控方式，进一步明确氨基酸在奶牛乳腺上皮细胞中的跨膜转运过程，本研究采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术检测了4F2hc在泌乳期和干奶期奶牛乳腺组织中的表达变化；在体外培养的泌乳期奶牛乳腺上皮细胞中添加亮氨酸，采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术检测其对奶牛乳腺上皮细胞中4F2hc表达的影响；采用雷帕霉素抑制剂抑制mTOR信号通路，使用Western blotting方法检测mTOR信号抑制后奶牛乳腺上皮细胞中4F2hc表达以及乳蛋白合成的变化。结果显示，在泌乳期的奶牛乳腺组织中4F2hc的mRNA和蛋白表达水平均显著或极显著高于干奶期（P<0.05，P<0.01）；在体外培养的奶牛乳腺上皮细胞中添加亮氨酸可以极显著提高乳腺上皮细胞中4F2hc的mRNA和蛋白质表达水平（P<0.01）；亮氨酸刺激可以激活细胞内的mTOR信号通路（P<0.05），而雷帕霉素处理则可以显著抑制mTOR信号分子的磷酸化并极显著抑制亮氨酸诱导的4F2hc的表达（P<0.05，P<0.01），进而极显著抑制β-Casein的合成（P<0.01）。以上研究结果表明，4F2hc基因的表达与奶牛乳腺的泌乳活性之间呈正相关，亮氨酸可以通过激活mTOR信号通路来调节4F2hc基因的表达，进而影响乳蛋白的合成。     

奶牛泌乳启动调控激素的研究进展

哺乳动物泌乳启动都是在一系列激素的调控作用下完成的。奶牛的泌乳启动受到多种激素的共同调控,处于非妊娠期的奶牛乳腺在经过特定激素的刺激后,都会在一定程度上出现泌乳现象。本文对奶牛催乳素PRL、雌激素E、胰岛素INS、生长激素GH和孕酮P4与泌乳启动的关系进行了综述,为研究泌乳启动和奶牛产奶量等提供重要理论基础。     

奶牛乳蛋白产量的营养调节效应与乳腺真核起始因子-2（eIF2）和核糖体s6（S6）激酶-1（S6K1）的磷酸化有关（摘要）

日粮蛋白质和能量同时影响泌乳动物乳蛋白的产量,必需氨基酸单独不能完全解释营养素对乳蛋白产量的影响。生长动物组织中,营养素对蛋白质合成受哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）和整合应激网络（ISR）的调控。本试验旨在探讨乳腺内营养素信号是否也通过mTOR和ISR网络调控乳蛋白的合成。泌乳奶牛饥饿22 h后,静脉内分别灌注必需氨基酸（EAA）和葡萄糖混合物,葡萄糖、l-Met＋l-Lys、l-His或l-Leu 9 h。结果表明,EAA和葡萄糖混合物或葡萄糖能分别提高乳蛋白产量的33%和27%。     

日粮能量水平对乌金猪肌肉组织蛋白质翻译起始因子基因表达的影响

试验旨在研究日粮不同能量水平对乌金猪肌肉组织蛋白质翻译起始因子基因表达的影响。选取健康、体重约15 kg的乌金猪54头,随机分为3组,每组3个重复,每个重复6头猪。各组猪饲喂不同能量水平的日粮（11.84、12.97、14.18 MJ/kg）,试验分15～30、31～60、61～100 kg 3个阶段。各阶段换料过渡期为7 d,分别于猪30、60、100 kg时分批屠宰。结果显示,高能量水平日粮可降低猪的瘦肉率和肌肉粗蛋白含量,增加肌内脂肪含量,降低蛋白质翻译起始因子基因的表达。屠宰体重为30 kg时,低能量组猪的真核起始因子-2B(eIF-2B)、真核起始因子-4E(eIF-4E)表达水平显著高于高能量组（P<0.05）,真核起始因子-4B (eIF-4B)基因表达量显著高于中能量组（P<0.05）。屠宰体重为60 kg时,高能量组和中能量组猪的eIF-2B、eIF-4B、eIF-4E表达水平显著低于低能量组（P<0.05）。屠宰体重为100 kg时,高能量组猪的真核起始因子-4A (eIF-4A)的相对表达水平显著低于低能量组和中能量组（P<0.05）,低能...     

激素及细胞因子对泌乳的影响及其调控

乳腺发育及泌乳过程是在机体内分泌系统严格控制下的复杂过程,受到多种激素和细胞因子的调控,包括催乳素(PRL)、生长激素(GH)、胰岛素(insulin)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、瘦素(leptin)等。催乳素是启动泌乳最关键的激素。GH对乳腺发育具有直接作用。胰岛素通过改变乳房外周的物质代谢调节乳腺的底物供应。IGF-1可促进细胞生长、分化和存活,从而维持泌乳细胞的数量和泌乳性能,是更直接的促进泌乳和维持泌乳因子。这些激素或细胞因子水平的变化不仅能够调控乳腺发育、启动泌乳以及维持泌乳等重要的生理过程,也直接影响乳产量及乳蛋白和乳脂肪的含量。论文综述了激素及其细胞因子对泌乳等的影响,并就其机制进行了探讨。     

新城疫病毒在感染早期通过Akt/mTOR/4E-BP1和p38/Erk/Mnk1通路激活宿主真核翻译起始因子eIF4E的研究

为阐明新城疫病毒(NDV)在感染宿主细胞后对宿主真核翻译起始因子以及相关调控通路的调节作用,本实验采用western blot检测NDV感染He La细胞早期真核翻译起始因子e IF4F的磷酸化水平以及Akt/m TOR/4E-BP1和p38/Erk/Mnk1调控通路的活化情况,同时用紫外线(UV)灭活的NDV进行对照试验。结果显示,NDV感染He La早期能够迅速诱导真核起始因子e IF4E的磷酸化,而UV灭活NDV作用的细胞则无此现象。通过对相关调控通路的检测发现,NDV在感染早期对e IF4E的磷酸化是通过激活p38/Erk/Mnk1通路实现的。此外,NDV感染还可以激活Akt/m TOR/4E-BP1通路,诱导e IF4E阻遏蛋白4E-BP1发生磷酸化并解离出e IF4E,从而促进e IF4F复合体的形成,确保真核翻译的进行。该结果对深入解析NDV与宿主之间的相互作用以及翻译相关信号通路参与调控病毒复制的机制具有重要意义。     

L型氨基酸转运载体1对奶牛乳腺中β-酪蛋白表达的影响

为研究L型氨基酸转运载体1（L type amino acid transporter 1,LAT1）对奶牛乳腺中β-酪蛋白表达的作用,本试验采用PCR技术体外扩增奶牛LAT1基因并构建LAT1真核表达载体,采用脂质体转染技术将LAT1真核表达载体转染奶牛乳腺上皮细胞,并于转染48 h后采用Western blotting技术检测LAT1过表达后乳腺上皮细胞中LAT1、4F2hc和β-酪蛋白的表达变化。荧光显微镜检测结果显示,LAT1真核表达载体成功转染奶牛乳腺上皮细胞;Western blotting检测结果显示,LAT1过表达的奶牛乳腺上皮细胞中LAT1极显著增加（P<0.01）,β-酪蛋白的表达显著升高（P<0.05）,4F2hc表达变化不显著（P>0.05）。这些结果提示LAT1对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成具有促进作用。     

王不留行对奶牛乳蛋白合成信号转导通路的影响

为确定王不留行对奶牛乳蛋白合成信号转导通路的影响,本试验通过水浸提方法制备王不留行提取液,采用Western blotting方法分别检测经王不留行水浸提液、雌激素及催乳素处理的泌乳期奶牛乳腺上皮细胞中乳蛋白合成信号分子的表达变化。结果显示,王不留行水浸提液、雌激素及催乳素都可以促进p-STAT5、p100、GAS、S6K1及p-mTOR的表达,进而促进乳蛋白合成,且添加蛋氨酸可以促进这一作用。提示,王不留行具有和雌激素、催乳素相似的作用,并在转录和翻译水平调节泌乳基因表达。     

泌乳奶牛乳腺葡萄糖吸收、代谢及其调控研究进展

乳腺是合成乳汁的重要场所。葡萄糖是泌乳奶牛合成乳糖的前体物,并且与乳脂、乳蛋白合成密切相关。为提高泌乳奶牛饲料转化效率、泌乳量,有必要深入研究奶牛乳腺的葡萄糖吸收与代谢机制。本文从乳腺葡萄糖吸收方式、乳腺葡萄糖摄取的调控、乳腺葡萄糖代谢及调控3个方面,对泌乳奶牛乳腺的葡萄糖吸收、代谢及其调控进行综述,为进一步研究乳腺代谢,调控乳产量、乳脂含量和乳蛋白含量提供依据。     

乳腺内氨基酸调控乳蛋白合成的分子作用机制

作为维持哺乳动物生命活动重要的"生物工厂",乳腺利用从流经血液中摄取的氨基酸等营养物质为底物合成乳蛋白。研究证实,氨基酸还可作为一种信号因子,通过乳腺内多种信号级联传导通路,调控乳蛋白基因的转录及翻译过程,从而影响乳腺中乳蛋白的合成。酪氨酸蛋白激酶-信号转导子和转录激活子(JAK-STAT)信号通路和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)信号通路是乳蛋白基因转录和翻译过程中的主要调控路径。本文综述了乳腺JAKSTAT和m TOR信号通路的分子机制及氨基酸通过这些通路调控乳蛋白合成的研究进展,旨在进一步阐明氨基酸调控乳蛋白合成的作用机理。