猪外周血单核细胞来源的树突状细胞体外诱导培养

为建立猪外周血单核细胞来源的树突状细胞(Mo DC)体外培养模型,从猪外周新鲜血液中分离外周血单核细胞(PBMC),通过贴壁法获得树突状细胞前体细胞,采用重组猪的集落共刺激因子(rp GM-CSF)和白细胞介素4(rp IL-4)双因子诱导及脂多糖(LPS)刺激成熟法,收集不同时间段的细胞,利用扫描电子显微镜观察其形态,流式细胞分析仪检测表面分子表达率及其对FITC-dextran的吞噬能力,混合淋巴细胞反应检测细胞对同种异体T细胞的刺激能力。结果表明,经体外诱导的细胞具有典型的树突状形态;经脂多糖刺激的树突状细胞表型分子CD1a、CD80、CD86、SLAII、CD172a与未经刺激的树突状细胞有明显增高,其吞噬能力有所下降,刺激同种异体T淋巴细胞的能力增强。本研究成功建立了猪Mo DC的体外诱导培养方法,为进一步研究其在机体免疫调节和抗病毒感染中的作用奠定了基础。     

猪外周血单核细胞来源的树突状细胞体外诱导培养（英文）

[目的]建立猪外周血单核细胞来源的树突状细胞(MoDC)体外培养模型。[方法]从猪外周新鲜血液中分离外周血单核细胞(PBMC),通过贴壁法获得树突状细胞前体细胞,采用重组猪的集落共刺激因子(rp GM-SCF)和重组猪的白细胞介素4(rp IL-4)双因子诱导及脂多糖(LPS)刺激成熟法,收集不同时间段的细胞,利用扫描电子显微镜观察其形态,流式细胞分析仪检测表面分子表达率及其对FITC-dextran的吞噬能力,混合淋巴细胞反应检测细胞对同种异体T细胞的刺激能力。[结果]经体外诱导的DC具有典型的树突状形态;LPS刺激的DC表型分子CD1a、CD80、CD86、SLAII、CD172a与LPS未刺激的DC有明显增高,其吞噬能力有所下降,刺激同种异体T淋巴细胞的能力有所增强。[结论]该试验成功建立了猪MoDC的体外诱导培养方法,为进一步研究猪MoDC在机体免疫调节和抗病毒感染中的作用奠定了基础。     

猪外周血单核细胞来源的树突状细胞体外诱导培养

[目的]建立猪外周血单核细胞来源的树突状细胞(MoDC)体外培养模型.[方法]从猪外周新鲜血液中分离外周血单核细胞(PBMC),通过贴壁法获得树突状细胞前体细胞,采用重组猪的集落共刺激因子(rpGM-SCF)和重组猪的白细胞介素4(rpIL-4)双因子诱导及脂多糖(LPS)刺激成熟法,收集不同时间段的细胞,利用扫描电子显微镜观察其形态,流式细胞分析仪检测表面分子表达率及其对FITC-dextran的吞噬能力,混合淋巴细胞反应检测细胞对同种异体T细胞的刺激能力.[结果]经体外诱导的DC具有典型的树突状形态;LPS刺激的DC表型分子CDla、CD80、CD86、SLAⅡ、CD172a与LPS未刺激的DC有明显增高,其吞噬能力有所下降,刺激同种异体T淋巴细胞的能力有所增强.[结论]该试验成功建立了猪MoDC的体外诱导培养方法,为进一步研究猪MoDC在机体免疫调节和抗病毒感染中的作用奠定了基础.     

蛋氨酸脑啡肽对GM-CSF诱导的小鼠骨髓来源的树突状细胞TLR-4表达的影响

观察蛋氨酸脑啡肽(MENK)对巨噬细胞-粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)诱导的小鼠骨髓来源树突状细胞TLR-4表达的影响,探讨蛋氨酸脑啡肽对小鼠骨髓来源树突细胞免疫功能的调节机制。体外制备小鼠骨髓细胞用GM-CSF协同MENK诱导培养7d后用RT-PCR法检测TLR-4的mRNA表达,用Western-Blot检测TLR-4蛋白的表达。结果表明:MENK协同诱导组TLR-4的表达高于正常对照组(p<0.01)和GM-CSF诱导组(p<0.05),MENK可以促进树突状细胞TLR-4的表达。     

蛋氨酸脑啡肽对GM-CSF诱导的小鼠骨髓来源树突状细胞TLR-4和TNF-α表达影响

观察蛋氨酸脑啡肽(MENK)对巨噬细胞-粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)诱导的小鼠骨髓来源树突状细胞TLR-4和TNF-α表达的影响,探讨蛋氨酸脑啡肽对小鼠骨髓来源树突细胞免疫功能的调节机制。体外制备小鼠骨髓细胞用GM-CSF协同MENK诱导培养7 d后用RT-PCR法检测TLR-4和TNF-α的mRNA表达,用Western-Blot和ELISA法分别检测TLR-4和TNF-α蛋白的表达。结果表明,MENK协同诱导组TNF-α和TLR-4表达高于正常对照组(P<0.01)和GM-CSF诱导组(P<0.05)。显示MENK可以促进树突状细胞TLR-4和TNF-α的表达。     

抗原浓度和DC数量对OT-I小鼠CD8+ T细胞分化与增殖的影响

【目的】探讨细胞毒性T细胞(CTL)表位肽SIINFEKL浓度和树突状细胞(DC)数量对CD8+T细胞活化和增殖的影响。【方法】用小鼠重组粒细胞集落刺激性生物因子(GM-CSF)和IL-4诱导骨髓细胞来源的DC增殖和分化,将所得成熟树突状细胞(maDC)和SIINFEKL抗原肽,与免疫磁珠法分离的OT-I小鼠CD8+T细胞共培养。用不同质量浓度的SIINFEKL(100,10,1,0.1,0.01和0.001 ng/mL)或不同数量的DC(DC/T比例分别为1/20和1/5)与CD8+T细胞共培养,刺激CD8+T细胞增殖分化。于共培养不同时间收集细胞,流式细胞术测定CD8+T细胞的数量、分裂速度、细胞表面活化分子的表达丰度,碘化丙叮(PI)染色测定细胞活力。【结果】在任一DC/T比例下,SIINFEKL浓度过低,均不能引起CD8+T细胞的充分增殖,而高于CD8+T细胞最佳增殖浓度的SIINFEKL则导致CD8+T细胞数量减少;在SIINFEKL质量浓度为0.001~0.1 ng/mL时,增加DC数量能促进CD8+T细胞的扩增;而SIINFEKL质量浓度为1~100 ng/mL时,提高DC数量反而导致CD8+T细胞数量减少;高浓度抗原和DC数量能有效诱导CD8+T细胞的活化和分裂增殖,但过量刺激会使细胞死亡,导致CD8+T细胞数量减少。【结论】CD8+T细胞的增殖受DC数量和抗原肽浓度的共同调节,要获得持久有效的CD8+T细胞免疫,必须保证CD8+T细胞得到足够的抗原信号,同时避免抗原信号过强导致的细胞活化后死亡。     

β-胡萝卜素对小鼠骨髓源树突状细胞成熟的影响

为探讨β-胡萝卜素对小鼠骨髓源树突状细胞(BMDCs)活化和成熟的影响,从小鼠骨髓中分离获得前体细胞, GM-CSF和IL-4诱导使其分化成未成熟的BMDCs,并用不同浓度的β-胡萝卜素进行作用,检测BMDCs的表型标志、吞噬能力以及细胞因子的分泌水平。β-胡萝卜素作用后BMDCs进一步与异种CD4~+T细胞混合培养,检测T细胞的增殖情况。结果表明:与未处理组相比,经β-胡萝卜素作用24 h后, BMDCs表面分子CD40、MHCII、CD80和CD86的表达量显著上调, BMDCs吞噬FITC-Dextran的能力显著下降,细胞因子IL-12p70和IL-10的分泌水平显著上升, BMDCs刺激CD4~+T细胞的增殖能力显著增强。这说明β-胡萝卜素可促进DCs的活化和成熟,可作为潜在的疫苗佐剂。     

不同品系小鼠腹腔巨噬细胞对LPS的反应性初步比较研究

为初步探究不同品系小鼠腹腔巨噬细胞对LPS的反应性区别,通过对C57BL/6小鼠、BALB/C小鼠和昆明小鼠腹腔注射硫乙醇酸盐(Thioglycollate,TG)以诱导巨噬细胞聚集。4d后收集细胞,计数并培养。使用脂多糖(LPS)分别刺激3种细胞,测定并对比炎症因子的分泌情况。结果表明:腹腔注射TG后,C57BL/6小鼠诱导率最高;LPS刺激细胞后,C57BL/6小鼠的腹腔巨噬细胞分泌的TNF-α、IL-6、iNOS和COX-2的分泌量均较其他2种小鼠高。     

超鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的克隆与真核表达

    为了研究鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的生物学功能,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从刀豆蛋白(ConA)刺激的四川山地乌骨鸡外周血淋巴细胞中扩增出GM-CSF基因,进一步通过PCR等方法将该基因亚克隆入真核表达载体pCI-neo,构建出重组表达质粒pCI-GM-CSF,将pCI-GM-CSF转染COS-7细胞,提取表达产物进行活性检测.序列测定表明,四川山地乌骨鸡GM-CSF全基因长为435 bp,编码144个氨基酸,与GenBank 上公布的瓦赫宁鸡GM-CSF基因(AJ621740)氨基酸序列同源性达95.1%,与其他哺乳动物GM-CSF基因的氨基酸序列同源性低于30%.骨髓细胞增殖实验证实四川山地乌骨鸡GM-CSF能明显促进鸡骨髓细胞的增殖.以上结果表明,本实验成功克隆了四川山地乌骨鸡GM-CSF基因,证实四川山地乌骨鸡GM-CSF重组蛋白具有明显的生物学活性.     

鸡骨髓源树突状细胞体外诱导培养及鉴定

为建立鸡骨髓源树突状细胞(DC,dendritic cells)体外培养方法,用重组鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rGM-CSF)和重组鸡白细胞介素4(rIL-4)体外诱导鸡骨髓细胞分化为DC,然后通过形态观察、表型鉴定及功能分析来初步鉴定所培养的DC。试验结果表明:培养7 d后,光学显微镜下观察到细胞表面不规则,有显著的树突状突起,呈典型的DC形态,流式细胞仪测得细胞表面CD11c和MHCⅡ分子的表达量分别为69.3%和63.0%。经脂多糖或CpG-ODN刺激24 h后的DC,其表面成熟分子标志CD40和CD86上调表达,同时其刺激同种异体T细胞增殖的能力显著增强(P<0.01)。结论:本试验建立的方法能在体外制备出大量具有较高纯度的鸡骨髓源DC,并具有体内DC的生物学特征。     

大花蕙兰花粉贮藏与离体萌发研究

为解决兰花花期不遇的问题,为杂交育种工作提供参考与借鉴。以大花蕙兰(Cymbidium hybridum)品种JOIC和KK560为试材,筛选适宜的花粉离体萌发培养基配方;检测不同贮藏温度、不同保存时间的大花蕙兰花粉离体萌发率,确定适宜的花粉保存方法。结果显示,大花蕙兰品种JOIC花粉粒离体萌发的最适培养基配方为0.5 MS+30%蔗糖,大花蕙兰品种KK560花粉粒离体萌发的最适培养基配方为0.01%硼酸+0.2%氯化钙+30%蔗糖。建议保存前将花粉块硅胶阴干24 h,-20 ℃保存,期限为6个月。     

灵芝孢子粉总三萜的提取优化及其体外生物活性

对灵芝孢子粉总三萜的提取过程进行优化,以得率为指标,通过单因素试验、Plackett-Burman试验筛选出影响灵芝孢子粉总三萜得率的显著因素,利用响应面设计优化灵芝孢子粉总三萜的提取条件。对于提取出的灵芝孢子粉总三萜,评价其清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基和ABTS⁺自由基的方法,并采用CCK-8比色法就其抗人肝癌细胞HepG-2增殖的活性进行研究。结果表明,最佳提取条件为乙醇体积分数80%,固液比1:23,超声功率540 W,提取温度40 ℃,提取时间60 min。此优化条件下提取的灵芝孢子粉总三萜具有较好的抗氧化能力,清除ABTS⁺的能力强于清除DPPH,对人肝癌细胞HepG-2亦具有一定的抑制作用。     

11S通过NF-κB信号通路引起猪小肠上皮细胞损伤

通过体外培养猪小肠上皮细胞(IPEC-J2),研究大豆球蛋白(11S)对猪小肠上皮细胞的影响。将IPEC-J2细胞分为6组[A(对照组)、B、C、D、E和F],各组中分别添加0、1、5、10、5、5 mg·mL^-1的11S,并且在E组和F组分别添加1 μmol·L^-1吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)和1 μmol·mL^-1 Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)。分别于8、16、24 h,用CCK-8法检测细胞存活率,用ELISA法检测细胞一氧化氮(NO)、二胺氧化酶(DAO)、5-羟色胺(5-HT)、白细胞介素6(IL-6)和白细胞介素10(IL-10)含量,用western blot法检测细胞p-NF-κB p65、iNOS、COX-2的蛋白表达量,用qPCR法检测细胞NF-κB p65、IKKβ、iNOS、IKKα、COX-2 mRNA的相对表达量。结果表明:11S可以降低猪小肠上皮细胞存活率,添加PDTC和L-NAME可以提高小肠上皮细胞存活率;11S可促进NO、DAO、5-HT和IL-6的分泌,降低IL-10的分泌,增加p-NF-κB p65、iNOS、COX-2的蛋白表达量及NF-κB p65、IKKβ、iNOS、IKKα、COX-2 mRNA的相对表达量,添加PDTC和L-NAME可抑制11S的作用。综上,11S可引起猪小肠上皮细胞损伤,随着11S浓度的增大,损伤程度增加,PDTC和L-NAME可以降低11S对细胞的损伤。     

DON、ZEA联合染毒对体外培养鸡脾脏淋巴细胞分泌IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的影响

旨在研究DON、ZEA联合染毒对体外培养鸡脾脏淋巴细胞分泌IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的影响。DON、ZEA联合染毒剂量为0.012 5 μg·mL^-1和0.006 25 μg·mL^-1、0.050 μg·mL^-1和0.025 μg·mL^-1、0.2 μg·mL^-1和0.1 μg·mL^-1、0.8 μg·mL^-1和0.4 μg·mL^-1,进行DON、ZEA联合染毒48 h对鸡脾脏淋巴细胞上清液IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ含量及其mRNA表达的影响。结果表明,各染毒组细胞上清液IL-10和IFN-γ蛋白含量,细胞内IL-2、IL-4和 IL-10 mRNA水平随毒素剂量的升高而增加 (P<0.01);各染毒组细胞上清液IL-2和IL-4蛋白含量均随毒素浓度的升高而降低(P<0.01);细胞内IFN-γ mRNA表达量均随毒素浓度的升高而先升高后降低(P<0.01)。DON、ZEA联合染毒导致细胞因子IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ分泌失衡,且呈剂量依赖性;DON、ZEA联合染毒鸡脾淋巴细胞上调或下降促炎性细胞因子的水平; Th1和Th2细胞因子平衡失调,因此造成细胞免疫损伤,从而对细胞产生毒性。     

β-伴大豆球蛋白通过p38/JNK MAPK信号通路引起IPEC-J2细胞损伤

采用细胞体外培养技术,研究不同浓度7S(β-伴大豆球蛋白)对IPEC-J2(猪小肠上皮细胞)的影响。实验分为6组,A(对照组)、B(1 mg·mL^-1 7S)、C(5 mg·mL^-1 7S)、D(10 mg·mL^-1 7S)、E(5 mg·mL^-1 7S+1 μmol·L^-1 SP600125)、F(5 mg·mL^-1 7S+1 μmol·L^-1 SB202190),24 h后,用CCK-8法检测细胞存活率,收集细胞用ELISA法检测NO、5-HT、IL-6和IL-10含量,用Western blot法检测p-JNK、p-p38、Bcl-2蛋白表达量,用PCR法检测Bad、Bax、Bcl-2、Bcl-x_L和Caspase-3 mRNA相对表达量。检测结果表明:C组和D组的IPEC-J2细胞活性极显著降低(P<0.01),E组和F组的细胞活性显著高于C组(P<0.05),说明7S促进炎性细胞因子NO、5-HT和IL-6的分泌,降低IL-10的分泌,添加抑制剂使细胞因子NO、5-HT和IL-6分泌减少,IL-10的分泌增多;同时7S促进p-JNK、p-p38蛋白表达,降低Bcl-2蛋白表达,添加抑制剂可抑制p-JNK、p-p38蛋白表达,使Bcl-2蛋白表达增高。Bcl-2/Bax mRNA比值随7S浓度增加而降低,Bax/Bcl-x_l比值随7S浓度增加而升高,Caspase-3 mRNA相对表达量随7S浓度增加而升高。添加抑制剂后Bcl-2/Bax比值增高,Bax/Bcl-x_l比值降低,Caspase-3 mRNA降低。结果表明,7S通过p38/JNK MAPK信号通路引起仔猪肠上皮细胞损伤。     

纳米碳与枯草菌对黄瓜幼苗生长及土壤环境的影响

为筛选适宜黄瓜苗期生长的枯草芽孢杆菌浓度,以黄瓜幼苗为材料,设置纳米碳溶胶和枯草芽孢杆菌浓度双因素试验,纳米碳溶胶稀释倍数设0、350、650倍,枯草芽孢杆菌浓度为0、8×10⁷、1.6×10⁸ CFU·mL^-1,分析枯草芽孢杆菌和纳米碳溶胶对黄瓜苗期长势、根系生长状况和土壤肥力的影响。结果表明,适宜浓度的枯草芽孢杆菌和纳米碳溶胶能够显著增强黄瓜幼苗的地上、地下部分生长,改善土壤状况。单施情况下,1.6×10⁸ CFU·mL^-1枯草芽孢杆菌处理可以促进根系生长,显著降低土壤电导率(EC值)的同时提升土壤P含量,增强土壤酶活性,增加细菌、放线菌数量;650倍纳米碳溶胶处理可以显著促进植株叶片生长,提升土壤有机质含量和蔗糖酶活性,土壤放线菌数量增加57.36%。8×10⁷ CFU·mL^-1枯草芽孢杆菌与650倍纳米碳溶胶共处理使株高相对生长率提高6.51%,显著促进根系生长,根系干质量、鲜质量、表面积、直径和体积均为处理中最高,比未添加菌剂与纳米碳的处理分别提高56.63%、57.14%、66.15%、56.55%、21.94%,降低土壤EC值,土壤中细菌数量是未添加菌剂与纳米碳的1.85倍,综合表现最优。     

虾源蜡样芽孢杆菌D7的生态安全性评价

为了评价蜡样芽孢杆菌菌株D7的生态安全性,分别测定了蜡样芽孢杆菌D7对氨氮、亚硝酸盐、磷酸盐浓度的影响,以及对小球藻、大型蚤、斑马鱼、凡纳滨对虾和草鱼等水生动植物的安全性。研究结果表明,蜡样芽孢杆菌菌株D7浓度≥1×10⁷ cfu·mL^-1时,水中氨氮及亚硝酸盐含量显著降低(P<0.05)。蜡样芽孢杆菌菌株D7浓度≤1×10⁶ cfu·mL^-1时,对氨氮及亚硝酸盐含量无显著影响。蜡样芽孢杆菌菌株D7浓度在10⁴~10⁸ cfu·mL^-1时,水中磷酸盐含量无显著变化。小球藻含量与菌体浓度呈正相关。处理96 h,对大型蚤、斑马鱼和凡纳滨对虾死亡率均无显著影响。以不同细菌剂量(10⁸~10¹² cfu·mL^-1)灌胃草鱼,处理96 h后,未出现草鱼死亡现象。表明虾源蜡样芽孢杆菌D7生态安全性较好,对水体及养殖动物无明显危害。     

隐绿原酸对H9N2-AIV致小鼠肺损伤的免疫调节和抗氧化效果

为探讨隐绿原酸(4-CQA)对感染H9N2亚型禽流感(H9N2-AIV)病毒的小鼠造成肺损伤的修复作用,将90只6～8周龄健康昆明系小鼠随机分为病毒(H9N2)感染组、H9N2+4-CQA组、空白对照组、4-CQA对照组,用H9N2-AIV滴鼻复制小鼠肺损伤模型并灌胃4-CQA干预.观察各组小鼠肺组织病理学变化;测定肺...     

集胞藻酰基载体蛋白基因过量表达对脂肪酸合成的影响

酰基载体蛋白(ACP)是微生物脂肪酸生物合成途径中的一个关键蛋白。为了促进集胞藻脂肪酸的积累,以集胞藻PCC6803为研究对象,成功构建了用于过量表达ACP(ssl2084)基因的同源重组质粒ssl2084⁽⁺⁾并在集胞藻PCC6803中进行转化。将ssl2084⁽⁺⁾突变株进行DNA水平和蛋白质水平鉴定,结果表明,ssl2084基因已经得到过量表达。利用气相色谱—质谱联用技术(GC-MS)对突变藻株在不同温度下脂肪酸的含量及组分进行检测,发现在30 ℃培养条件下ssl2084⁽⁺⁾突变株中C12:0、C16:0和C18:0的含量显著增加,分别为1.50、8.74和0.60 mg·g^-1,与野生型相比分别增加了54.71%、50.82%和155.86%;在20 ℃低温胁迫培养条件下,C12:0、C16:0和C18:0的含量分别达到1.70、11.85和2.31 mg·g^-1,与野生型相比分别增加了31.94%、47.35%和39.90%。以上结果表明,在集胞藻PCC6803中过表达ssl2084基因能提高集胞藻中的中长链脂肪酸的含量,低温条件使得集胞藻中的中长链脂肪酸的含量进一步提高。     

猪链球菌2型灭活疫苗对小鼠的免疫效果评价

在前期筛选出2株毒力强、抗原性好、遗传稳定的猪链球菌2型(SS2)疫苗菌株(HF2、HF3株)并分别制成灭活疫苗(采用ISA 201 VG矿物油佐剂)的基础上,进一步与SS2商品化灭活疫苗(HA9801株,铝胶佐剂)同步免疫小鼠,利用间接ELISA、流式细胞术、免疫攻毒试验、细菌定植试验和病理组织学观察等方法测定小鼠血清中IgG抗体效价,细胞因子含量(IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-β、MCP-1),外周血中CD4⁺/CD3⁺、CD8⁺/CD3⁺ T细胞亚群含量,攻毒保护率,组织荷菌数和病理组织变化等指标。结果显示,二免7 d后,HF2、HF3灭活疫苗组和HA9801商品化灭活疫苗组的血清IgG抗体效价分别为1:25 600、1:12 800、1:25 600;HF2灭活疫苗组的IL-4、IL-10含量显著高于HF3灭活疫苗组和HA9801商品化灭活疫苗组,IFN-γ、TNF-β含量显著高于HF3灭活疫苗组,但MCP-1含量显著低于HF3灭活疫苗组;HF2和HF3灭活疫苗组的CD4⁺/CD3⁺ T细胞比率均显著低于HA9801商品化灭活疫苗组,但CD8⁺/CD3⁺ T细胞比率差异不显著;HF2、HF3灭活疫苗和HA9801商品化灭活疫苗对小鼠的攻毒保护率均为100%;HF2灭活疫苗组小鼠的肺、脾脏组织荷菌数显著低于HF3灭活疫苗组;HF2灭活疫苗组小鼠的肺、肾、脾脏病理变化较HF3灭活疫苗组和HA9801商品化灭活疫苗组轻微。综合结果表明,由SS2(HF2株)制备的ISA 201 VG佐剂灭活疫苗免疫小鼠后不仅可产生较强的免疫应答,还可完全抵抗强毒株的攻击。