自交不亲和甘蓝亲和花粉授粉早期差异蛋白质分析

 为从蛋白质的角度揭示自交不亲和甘蓝亲和授粉早期花粉与柱头相互作用,将蛋白质组学方法应用于自交不亲和性甘蓝柱头与亲和花粉互作早期差异蛋白质的研究。结果表明,亲和授粉后3 ~ 5 min与1 h对比,有116个差异蛋白质点,而授粉后1 h与2 h差异不显著。按照特异表达与变化量大的蛋白质点优先原则,初步选取差异点中71个点做质谱分析,鉴定出31个可信差异蛋白质。与亲和授粉后3 ~ 5 min组相比,1 h组中特异表达蛋白质有19个,上调表达9个,下调表达3个。31种蛋白质的生物信息学分析表明,有两种蛋白与前人发现的与花粉管在柱头中生长发育相关蛋白相同,其他29种参与包括胁迫与防御应答在内多种生理过程。对早期差异蛋白中这种“既有促进花粉管发育的蛋白,也有与防御相关蛋白”现象分析表明,花粉管生长性侵入柱头的过程有可能伴随着柱头抗性的提高。     

甘蓝自交不亲和相关转录因子BosiPA1 蛋白基因的克隆与表达分析

 通过自交不亲和甘蓝‘A1’自花授粉1 h 和未授粉柱头蛋白质表达谱的对比,鉴定出1 个受 自花授粉诱导上调表达的蛋白,通过PCR 技术获取了其编码序列,命名为BosiPA1 蛋白,其基因全长为 3 730 bp,具有1 个1 092 bp 的完整编码框（KF314579）。BosiPA1 由6 个外显子、5 个内含子组成,编码 363 个氨基酸。序列分析表明BosiPA1 蛋白具有典型的basic helix-loop-helix（bHLH）功能域,在SCR、SRK、 Exo70A1 基因的ATG 上游启动子序列中存在可以被bHLH 功能区识别并结合的E-box（CANNTG）序列。 在分子进化上甘蓝BosiPA1与AtbHLH128 距离最近,与AtHEC1/2/3 和TgGBOF-1 处在同一个分支。RT-PCR 检测表明甘蓝BosiPA1 基因在花瓣、萼片、花粉、柱头和叶片中均有表达;荧光定量PCR 分析表明BosiPA1 基因在自花授粉10 min、30 min、1 h 的柱头中呈逐渐上升趋势。上述结果说明BosiPA1 与bHLH 的进化 分支较早,可能是一个参与甘蓝多器官发育的自交不亲和相关的转录因子。     

结球甘蓝自花和异花授粉诱导的柱头转录组分析

分别以自花授粉30 min、异花授粉30 min和未授粉处理的甘蓝柱头进行Illumina HiSeq2000高通量转录组测序,分析自交不亲和性甘蓝自花授粉、异花授粉柱头与未授粉柱头中基因表达的差异。转录组测序共获得1.6 × 108对原始序列读取片段,总碱基数为2.38 × 1010 bp,与未授粉对照相比,自花、异花授粉后差异表达的基因分别有2 900个和2 328个,共有的差异表达基因1 904个。在差异表达基因背景和全部基因背景下,自花授粉较大比例的差异基因是细胞杀伤、胞外基质部分和核酸结合转录因子活性;异花授粉较大比例的差异基因是信号传递、胞外区域部分、结构分子活性和营养库活性。GO功能的显著性富集分析表明,自花授粉处理后特有的40个极显著的富集条目主要涉及糖跨膜转运活性、微管结合和钙调素依赖性蛋白激酶活性等。异花授粉特有的53个极显著的富集条目主要涉及法尼酸O–甲基转移酶的活性、微管负向运动和生长素跨膜运输等。自花授粉处理后特异差异表达的996个基因主要涉及钙离子结合、细胞骨架相关、茉莉酸和水杨酸代谢等生物过程,异花授粉处理后特异差异表达的424个基因主要涉及物质跨膜转运及脂质代谢。     

砂梨不同S基因型异花授粉和蕾期自花授粉试验

绝大多数梨品种自花授粉结实率极低,有的甚至不结实,这种现象叫自交不亲和。当不同品种异花授粉时,自交不亲和基因型相同也会出现结实率低或不结实,这种现象在遗传学上也归属于自交不亲和现象[1-4]。自交不亲和性的本质是成熟雌蕊分泌的一种RNase抑制其相同S基因型花粉在柱头上萌发后的继续生长,造成授粉、受精受阻[1-2]。因此,梨属植物生产上为提高产量、品质和效益,配置授粉品种是常用而有效的栽培措施之一。日本已对梨自交不亲和现象进行了广泛深入的研究[1-2,5-11]。在蕾期这种RNase基因的表达量较少,其雌蕊抑制花粉在柱头上继续生长…     

自花和异花授粉对蓝莓花粉管动力学的影响

以‘园蓝’和‘蓝金’为试材,以‘灿烂’为异花授粉品种,开展自花和异花授粉,授粉后不同时间取样观察花粉原位萌发和花粉管生长情况,分析自花和异花授粉对参试品种花粉管动力学的影响。结果表明:自花和异花授粉对‘园蓝’的花粉管动力学有显著影响,其自花授粉花粉管生长速度显著低于异花授粉,胚珠的退化速度显著加快,至授粉后120h,异花授粉处理被花粉管生长穿过的花柱比率显著高于自花授粉,表现出自交不亲和性;自花和异花授粉对‘蓝金’的花粉管动力学有一定影响,但至授粉后120h,其异花授粉处理被花粉管生长穿过的花柱比率与自花授粉无差异,表现为自交亲和。综合分析表明,参试材料自花授粉受精生物学特性具有明显的种群特异性,‘园蓝’自交不亲和反应发生在花柱基部,属于配子体自交不亲和中的合子前不亲和类型。     

结球甘蓝CML家族基因及其在授粉后柱头中的表达

利用NCBI和甘蓝基因组数据库筛选获得了76个结球甘蓝CML家族基因,其随机分布在甘蓝的9条染色体上,染色体上最多的有12个基因,最少有1个基因。分析发现该基因家族编码蛋白氨基酸残基长度在109 ~ 365个之间,分子量大多在20 kD左右,为小分子蛋白,且均含有2 ~ 4个保守的EF-hand结构域。甘蓝的76个CML基因依据与拟南芥的CML家族的进化关系及序列相似性分为Ⅰ~ Ⅷ个亚家族,每个亚家族基因有较高的同源性,进化关系较近。经亚细胞预测分析发现大部分蛋白在质膜和胞外表达,少量在质膜、细胞核内和叶绿体等部位表达。数字表达谱分析发现在76个基因中,有25个基因在自花和异花授粉后差异表达,其中BoCML12、BoCML42、BoCML44、BoCML45、BoCML60、BoCML70、BoCML71 和BoCML74等8个基因在自花和异花授粉后表达趋势有较大差异,表明这8个基因以不同的方式参与调控甘蓝自花和异花授粉后的反应过程,有可能与甘蓝的自交不亲和性相关。     

甘蓝BYPASS1 编码基因的克隆与表达分析

通过双向电泳结合MALDI-TOF-TOF/MS 质谱技术在甘蓝柱头内鉴定出1 个受自花授粉诱导
上调表达的BYPASS1 蛋白（BPS1）。利用PCR 技术扩增甘蓝BPS1 基因的编码序列, 序列分析结果表明：
该基因没有内含子,开放阅读框为1 059 bp,编码352 个氨基酸,蛋白质分子量为38.7 kD。氨基酸同源
性和系统发生树分析结果表明：甘蓝BPS1 与拟南芥BPS1 亲缘最近,氨基酸同源相似性达85%;与烟草
BPS2 关系较远。RT-PCR 检测结果表明：甘蓝BPS1 基因在开花前1～2 d 的花瓣、萼片、花药、柱头和
叶片中均有表达,柱头中的表达量最高。实时荧光 定量PCR 分析结果表明：甘蓝柱头内BPS1 表达水平在
自花授粉后逐渐升高,异花授粉后柱头内BPS1 表达水平先升高后降低再升高。     

花龄对‘灿烂’兔眼蓝莓花粉原位萌发和花粉管生长的影响

以‘灿烂'兔眼蓝莓为试材,分别进行异花授粉和自花授粉后,于去雄后第0、1、2、3、4、5、6天对去雄的花进行授粉,于授粉后2、6、12、24、48、72、96 h进行取样观察花粉原位萌发和花粉管生长情况,以期阐明花龄对蓝莓花粉萌发和花粉管生长的影响,为杂交育种和花期人工辅助授粉提供科学依据。结果表明:‘灿烂'兔眼蓝莓开花第1~4天,异花授粉后花粉管生长至花柱基部的花柱比率显著高于其它时期,花龄对其异花和自花授粉后花粉原位萌发和花粉管生长有着显著的影响,且‘灿烂'兔眼蓝莓存在自交不亲和的现象,花柱基部为其自交不亲和的关键位置,大蕾期和延迟授粉可以一定程度地克服自交不亲和现象,人工辅助授粉和杂交育种的最佳授粉时间为花后第1~4天。     

梨不同花龄自花与异花授粉的花柱内花粉管生长及坐果率的比较

对自交不亲和强度不同的梨品种丰水和菊水的不同花龄花进行自花授粉和丰水×菊水异花授粉后,用荧光显微镜观察花粉萌发及生长特性。结果表明,开花当天及以后的自花和异花授粉花粉在柱头上均有较高的萌发率;自花和异花花粉管在花柱内的生长速度及停止生长的位置不同,丰水自花授粉后花粉管生长的短且慢,菊水自花花粉管生长的长且快,而异花授粉的花粉管生长最快。自花授粉后,不同花龄对花粉管生长影响表现为:开花4d前的蕾期授粉以及开花4d后的延迟授粉,花粉管生长长度显著的长。开花6d前的各种授粉组合,花粉管生长均较差。这与田间授粉坐果率的高低基本一致,即整体表现为各个花龄的授粉都以异花授粉坐果率最高,其次为菊水自花授粉,丰水自花授粉坐果率最低。另外,自花授粉中,蕾期授粉和延迟授粉(开花2d后除外)坐果率都有提高,而异花授粉中蕾期授粉和延迟授粉的坐果率却有所下降。     

甘蓝PMEI家族基因结构、基因组分布和表达分析

为了弄清甘蓝PMEI家族基因成员数、基因结构和分布及其与自交不亲和性的关系,利用转录组测序和相关生物信息学方法对其进行了基因结构分析和全基因组鉴定,对家族基因进行了表达谱分析,并通过实时荧光定量PCR技术验证了基因的表达情况。结果表明,甘蓝中PMEI家族包含101个基因,分为11组,其成员不均匀分布在9条染色体上,主要通过全基因组三倍体复制(wholegenome triplication,WGT)和串联复制事件进行倍增,与拟南芥在1 556万年前发生分化。数字表达谱分析发现在101个基因中,BoPMEI56、BoPMEI54、BoPMEI32、BoPMEI29、BoPMEI78、BoPMEI30、BoPMEI57、BoPMEI58和BoPMEI84这9个基因在自花和异花授粉后表达趋势有明显差异。荧光定量PCR结果显示,其在自花授粉和异花授粉的表达变化趋势与转录组分析结果基本一致。这些结果表明:BoPMEI家族的101个成员中,可能至少有9个基因以不同方式参与调控甘蓝自花和异花授粉后的反应过程,可能与甘蓝自交不亲和性有关。     

G蛋白调节剂对梨花粉原位萌发和花粉管生长的影响

用荧光显微镜观察了G蛋白调节剂处理柱头后对梨花粉萌发和花粉管伸长的影响,结果表明:1)G蛋白激活剂霍乱毒素(CTX)处理柱头后进行自花授粉,授粉后24h和48h,可明显促进自花花粉的萌发;而G蛋白抑制剂百日咳毒素(PTX)处理柱头后异花授粉则抑制异花花粉萌发。2)CTX处理柱头后自花授粉对自花花粉管的生长具有促进作用;而PTX处理柱头后异花授粉,表现出对异花花粉管生长的抑制作用。     

结球甘蓝花粉钙调素基因的克隆与表达分析

 根据芸薹属植物钙调素基因保守区域设计引物,采用同源克隆的方法从结球甘蓝自交不亲和系和自交系花粉中克隆得到一个钙调素开放阅读框cDNA 序列,该序列长450 bp,编码149 个氨基酸;编码蛋白不含跨膜区,无信号肽,具有4 个完整的EF-hand 结构域。构建了结球甘蓝花粉钙调素原核表达系统,钙调素基因及其3 个突变体在E. coli 中得到表达,均获得分子量约为16 kD 的可溶性融合蛋白,在EGTA 存在的条件下,各融合蛋白具有各自独特的凝胶迁移现象,活性检测表明甘蓝花粉钙调素活性依赖于钙离子。该基因在甘蓝自交不亲和系花粉萌发过程中表达量先上升后下降,在自交系中随花粉萌发增大而降低;在含有钙调素拮抗剂TFP 的培养基中,自交不亲和系和自交系花粉中钙调素基因表达量均受到抑制;在含有W-7 琼脂糖的培养基中无明显差异。     

苹果部分品种的授粉结实性研究

 苹果授粉结实性研究结果表明, 除‘惠’以外, 多数品种的自花授粉结实率较低, 表现自交不亲和。而绝大多数品种异花授粉结实率较高, 表现异花授粉结实性; 个别异花授粉品种组合之间授粉结实率较低的主要原因是由于授粉双方具有相同的S 基因型所致。花粉发芽率除三倍体品种花粉败育及二倍体品种‘王林’以外, 发芽均表现良好。     

钙调素对梨自花及异花授粉后花柱自发荧光变化的影响

采用激光共聚焦显微镜研究了外源钙调素及其抗血清对‘丰水’梨自花（不亲和）和异花（亲和）授粉后花柱自发荧光变化的影响。结果表明：授粉12 h后,CaM处理后异花授粉花柱荧光值与未处理异花授粉花柱荧光值相比,花柱上部荧光值降低下部升高;而CaM处理后自花授粉花柱自发荧光值除距柱头2 500～3 000 μm外其余部分均高于未处理自花授粉花柱;CaM抗血清处理后异花授粉花柱荧光值除距柱头1 000～2 000 μm外其余部分均高于未处理异花授粉花柱;CaM抗血清处理自花授粉花柱自发荧光与未处理自花授粉花柱相比,分布规律发生改变,最高值位于距柱头1 000～1 500 μm处。授粉72 h后CaM处理后异花授粉花柱荧光值高于未处理异花授粉花柱,最高值位于子房端;CaM处理后自花授粉与未处理自花授粉花柱自发荧光值相比,分布规律发生改变,最高值位于距柱头1 500～2 000 μm处;CaM抗血清处理后异花及自花授粉花柱自发荧光与未处理异花及自花授粉花柱相比较分布规律均发生了改变,最高值都位于0～500 μm处。证实了外源CaM及其抗血清对自花、异花授粉的生理代谢过程均有影响。     

甜樱桃花粉原位萌发荧光显微镜观察

以"美早""早大果"和"斯坦拉"甜樱桃为试材,分别于自花、异花授粉后不同时间(27、51、75、99h)切取花柱,通过荧光压片法观察各授粉组合的花粉原位萌发及花粉管生长情况,以期为研究甜樱桃授粉机理提供依据。结果表明:3个甜樱桃品种的花粉均能在自花或异花柱头上萌发,且于授粉27h后趋于稳定,不同授粉组合间花粉萌发量只在数量上表现出差异,其结果并不会影响坐果率。在花粉管生长情况上,不同授粉组合表现出显著差异。授粉后51~99h,亲和花粉管不断向花柱基部延伸,进入子房;而不亲和花粉管在花柱中上部受到抑制,停止生长。同为自花授粉,"斯坦拉"自交的花粉管能够到达花柱基部,表现为自交亲和;而"美早"和"早大果"自交则表现为极强的不亲和性。异花授粉中,"斯坦拉"与"美早"和"早大果"均表现为亲和性较好。综上所述,"斯坦拉"无论是自花还是异花授粉,花粉管均能到达花柱基部,完成受精,是较为理想的授粉树。而"美早"和"早大果"只有在异花授粉时花粉管才能到达花柱基部,而自花授粉的花粉管在花柱中上部已停止生长,故在实际生产中需配置授粉树。     

转MLPK反义基因对甘蓝自交不亲和性的影响

对反义MLPK基因在甘蓝柱头特异启动子SLR的驱动下,通过农杆菌介导转化法将其导入高度自交不亲和甘蓝材料‘TF’。转基因甘蓝T0代植株定量PCR分析结果显示,不同的转MLPK反义基因单株内源MLPK mRNA积累量具有明显差异,其中转基因植株花期柱头内源MLPK mRNA积累量明显低于野生型对照。花粉原位萌发的荧光显微镜观察结果显示,转基因甘蓝植株花期自交后,吸附在柱头上的花粉粒大量萌发,且穿过柱头的花粉管明显增加,并导致花期自交结籽数上升,转基因植株花期和蕾期自交亲和指数均明显高于野生型对照植株。结果表明,下调MLPK基因表达能部分打破甘蓝自交不亲和,提高其花期自交结籽能力。     

基于SRK基因序列分析的甘蓝自交不亲和系单倍型鉴定及验证

根据甘蓝自交不亲和性雌蕊决定因子SRK基因保守序列设计简并引物,克隆23份甘蓝自交不亲和系SRK基因并测序。利用NCBI数据库进行克隆序列的Blast比较以及序列之间的相似性分析,初步确定23份甘蓝自交不亲和系分属于SRK3、SRK7、SRK8、SRK16、SRK28、SRK36、SRK45、SRK46、SRK58、SRK68等10种S单倍型。其中有5份甘蓝自交不亲和系属于SRK36单倍型,占参试自交不亲和系的22%;SRK7、SRK16和SRK58单倍型均只有1份甘蓝自交不亲和系。进一步对不同自交不亲和系之间花期杂交后花粉萌发及花粉管伸长情况进行荧光显微观察,并对20个杂交组合的花期杂交亲和指数进行调查分析,结果表明根据SRK基因序列所确定的相同S单倍型自交不亲和系之间花期授粉表现为不亲和,花粉在柱头上萌发受阻,花期亲和指数低;而不同S单倍型自交不亲和系之间花期授粉表现高度亲和,花粉管伸入雌蕊正常,花期亲和指数高。表明基于SRK基因序列分析确定甘蓝自交不亲和系所属单倍型是一种简单而可靠的快速鉴定方法,有利于育种时有针对性地设计甘蓝自交不亲和系杂交组合配制,从而提高育种效率。     

甘蓝BoMLPKn1的克隆及其拟南芥同源基因AtAPK1b的功能研究

在克隆甘蓝BoMLPK编码序列过程中,获得BoMLPKf1/2编码序列和1个新的转录文本(命名为BoMLPKn1)。BoMLPKf1/2和BoMLPKn1的c DNA大小分别为1 215、1 233和1 257 bp,分别编码含404、410和418个氨基酸残基的多肽链。与BoMLPKf1/2相比,BoMLPKn1有两个插入序列,一个是在1 102～1 114 bp之间有12个碱基的插入,另一个是在1 152～1 182 bp之间有30个碱基的插入。BoMLPKf1/2定位在甘蓝3号染色体上,BoMLPKn1定位在4号染色体上。氨基酸序列比对发现,BoMLPKf1和BoMLPKn1的N端均含典型的豆蔻酰化基序,BoMLPKf2的N端含疏水结构域。3个转录文本均具有1个高度保守的Ser/Thr蛋白激酶结构域。RT-PCR检测发现自交不亲和甘蓝自花授粉15min后BoMLPKf2相对表达量急剧升高,BoMLPKf1和BoMLPKn1在自花授粉15 min后相对表达量无明显变化。亚细胞定位检测到BoMLPKn1定位在细胞膜上。利用CRISPR-Cas9植物编辑系统对BoMLPKn1拟南芥直系同源基因AtAPK1b基因组进行定点敲除,获得突变体植株。与野生型相比,突变体植株均能够正常开花结籽。结果表明MLPKn1基因在整个十字花科进化中是高度保守的,不参与自交不亲和反应,这与MLPKf1/2不同。     

甘蓝自交不亲和系、自交系花粉、柱头蛋白质的等电聚焦电泳和游离氨基酸分析

结球甘兰(Brassica oleracea L. var. capitata)自交不亲和系的测定,通常是用田间自交法来进行,这种方法费工费时。自建立了用水溶性苯胺蓝显示花柱中花粉管的技术后,又逐渐发展了利用荧光染色法快速测定自交不亲和性的方法。此法根据柱头上花粉萌发的数量确定不亲和程度,尚欠精确。研究表明,孢子体自交不亲和系统的花粉与柱头的识别机制是由S等位基因编码的S蛋白质决定的。美、英、日等国已先后分离鉴定出了这类S蛋白质。本试验旨在通过对甘蓝自交不亲和系及自交系花粉、柱头的蛋白质和氨基酸组分的分析,探讨利用蛋白质特性来快速测定植物孢子体型自交不亲和性的可能性。 材料与方法 试材采用西南农大园艺系蔬菜育种教研室选育的甘蓝自交不亲和系‘二乌叶86057’、‘北黑大86035’,二系统均是多代自交、高度稳定的自交不亲和系,1983年以来田间自交亲和指数均接近于0;自交系‘虹桥86047’,该材料也为多代自交,但亲和性稳定,1986年田间自交亲和指数达13.06。 等电聚焦电泳和氨基酸分析均测试“花粉”(P)、“柱头”(S)和“受粉后柱头”( P S)三项。花粉:取自开花前套袋隔离的花枝;枝头:隔离袋内,开花前1-2天彻底去雄,     

新疆蔷薇科扁桃类植物自交不亲和性的分子机制

蔷薇科扁桃类植物是具有重要经济、研究价值的园艺果树类植物,该类果树植物家族均为自交不亲和性,自花授粉并不能正常结实,在其生长和生产过程中都需要进行异花授粉。扁桃类果树植物的自交不亲和属于配子型自交不亲和类型,是由花粉配子体核基因决定花粉与雄蕊的不亲和反应,即当花粉中的一个S等位基因与花柱中的一个等位基因相同时即表现不亲和。不亲和反应的细胞学特征是花粉管生长在花柱中受阻。该文对植物自交不亲和性方面的分子机制在蔷薇科扁桃类果树作物上的反映研究进展进行了综述,并着重阐述了新疆分布的独特的栽培扁桃和野生扁桃自交不亲和性S-位点基因的研究进展,以期为今后更深入的研究提供了重要的基础。