草莓miR156靶基因SPL9的克隆与表达分析

 【目的】从草莓中克隆SPL(SQUAMOSA promoter binding protein-like)转录因子基因SPL9,并分析其在草莓植株不同生长时期的表达水平及与miR156的表达关系,探讨SPL9在草莓植株生长发育中的作用。【方法】根据苹果SPL基因家族的保守序列设计简并引物,以草莓叶片为试材,利用RT-PCR克隆草莓SPL9基因片段,在此基础上利用RACE方法克隆SPL9的cDNA全长。利用实时定量RT-PCR技术分析草莓叶片中SPL9及miR156的表达水平。【结果】从草莓（Fragaria×ananassa）品种‘全明星’中克隆出SPL9基因的cDNA全长序列,命名为FaSPL9。其CDS长度为1 143 bp,编码381个氨基酸,与拟南芥AtSPL9、葡萄VvSPL9、枳PtSPL9、苹果MdSPL9以及玉米ZmSPL9的氨基酸序列同源性分别为：40.30%、64.57%、56.09%、70.33%,38.35%。FaSPL9有着高度保守的SBP结构域和一个双向核定位信号KRXXXRRRK。FaSPL9基因序列中包含miR156的靶位点,实时定量RT-PCR结果表明,在草莓植株的不同生长时期FaSPL9的表达量不同,且与miR156呈现相反的表达模式。【结论】从草莓中分离出FaSPL9基因,其作为miR156的靶基因,推测FaSPL9对草莓植株的生长发育具有重要的调控作用。     

油松PtNF-YC1基因鉴定及其调控球花发育的作用机制研究

【目的】针叶树中NF-Y核因子调控球花发育的研究尚未见报导,对油松PtNF-YC1基因克隆、表达特性及功能分析,旨在为针叶树NF-Y基因家族在球花生殖发育中的功能研究提供依据。【方法】（1）利用系统进化树分析油松PtNF-YC1与拟南芥NF-YC亚家族蛋白的亲缘关系;（2）瞬时转化烟草检测PtNF-YC1的亚细胞定位;（3）根据转录组数据分析PtNF-YC1在油松不同组织中的表达特性;（4）PtNF-YC1异源转化拟南芥,分别比较长日照和短日照条件下转基因拟南芥不同株系的开花时间,并对长日照下各株系进行转录组测序,筛选响应PtNF-YC1调控开花的相关基因;（5）通过Y2H和BiFC验证PtNF-YC1与候选蛋白之间互作。【结果】PtNF-YC1基因的开放阅读框为897 bp,编码299个氨基酸,含有典型NF-YC保守结构域,与AtNF-YC3/4/9具有较高同源性。亚细胞定位结果显示,PtNF-YC1定位在细胞核和细胞质。PtNF-YC1在针叶、营养芽、雌雄花芽和根中都能表达,但在雄球花中表达丰度最高。PtNF-YC1异源转化拟南芥可推迟其短日照下开花时间。Y2H和BiFC证明PtN...     

龙眼SPL基因家族全基因组鉴定及表达分析

【目的】鉴定龙眼SPL(DlSPL)基因家族所有成员,并对其成员进行表达分析,为探究SPL在龙眼生长发育中的功能研究提供参考。【方法】采用生物信息学方法对龙眼SPL基因家族成员进行鉴定,并对其基本理化性质、基因结构、系统进化关系、启动子顺式作用元件、FPKM值进行分析;利用qRT-PCR技术检测其在非胚性愈伤组织(nonembryonic callus,NEC)、胚性培养物及不同激素处理下的胚性愈伤组织(embryonic callus,EC)中的表达情况。【结果】DlSPL基因家族共有14个成员,其基因结构和蛋白结构均高度保守且只有一个SBP结构域,DlSPL启动子存在大量的光反应元件、组织特异性调控元件、激素应答元件、胁迫响应元件和植物生长发育有关的顺式调控元件。RNA-seq表达量分析(FPKM值)表明,11个DlSPL成员在不同光质处理的EC中表达,只有DlSPL8在蓝光和白光处理下的EC中呈下调表达趋势;11个DlSPL成员在激素2,4-D和KT中表达,其中DlSPL3和DlSPL13在2,4-D和激动素(kinetin,KT)共同处理下的表达量高于2,4-D和KT分开处理;有13个DlSPL成员在非胚性及胚性培养物中表达,其中7个成员在NEC阶段表达量最高。qRT-PCR结果表明,在不同胚性培养物中,DlSPL1和DlSPL14在EC阶段表达最高,DlSPL5、DlSPL7和DlSPL13在不完全胚性紧实结构(incomplete embryonic compact structure,ICpEC)阶段表达量最高;DlSPL1、DlSPL5、DlSPL7和DlSPL13成员响应脱落酸(abscisic acid,ABA)信号并显著下调;DlSPL5响应茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)信号且呈上调表达趋势,其他3个成员呈下调表达趋势。【结论】共鉴定出龙眼SPL基因家族成员14个,均含有一个高度保守的SBP结构域;DlSPL可能参与龙眼体胚的形态建成,并响应ABA和MeJA的应答。     

龙眼SPL基因家族全基因组鉴定及表达分析

【目的】鉴定龙眼SPL（DlSPL）基因家族所有成员,并对其成员进行表达分析,为探究SPL在龙眼生长发育中的功能研究提供参考。【方法】采用生物信息学方法对龙眼SPL基因家族成员进行鉴定,并对其基本理化性质、基因结构、系统进化关系、启动子顺式作用元件、FPKM值进行分析;利用qRT-PCR技术检测其在非胚性愈伤组织（nonembryonic callus,NEC）、胚性培养物及不同激素处理下的胚性愈伤组织（embryonic callus,EC）中的表达情况。【结果】DlSPL基因家族共有14个成员,其基因结构和蛋白结构均高度保守且只有一个SBP结构域,DlSPL启动子存在大量的光反应元件、组织特异性调控元件、激素应答元件、胁迫响应元件和植物生长发育有关的顺式调控元件。RNA-seq表达量分析（FPKM值）表明,11个DlSPL成员在不同光质处理的EC中表达,只有DlSPL8在蓝光和白光处理下的EC中呈下调表达趋势;11个DlSPL成员在激素2,4-D和KT中表达,其中DlSPL3和DlSPL13在2,4-D和激动素（kinetin,KT）共同处理下的表达量高于2,4-D和KT分开处理;有13个DlSPL成员在非胚性及胚性培养物中表达,其中7个成员在NEC阶段表达量最高。qRT-PCR结果表明,在不同胚性培养物中,DlSPL1和DlSPL14在EC阶段表达最高,DlSPL5、DlSPL7和DlSPL13在不完全胚性紧实结构（incomplete embryonic compact structure,ICpEC）阶段表达量最高;DlSPL1、DlSPL5、DlSPL7和DlSPL13成员响应脱落酸（abscisic acid,ABA）信号并显著下调;DlSPL5响应茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）信号且呈上调表达趋势,其他3个成员呈下调表达趋势。【结论】共鉴定出龙眼SPL基因家族成员14个,均含有一个高度保守的SBP结构域;DlSPL可能参与龙眼体胚的形态建成,并响应ABA和MeJA的应答。     

猕猴桃褪黑素合成相关基因AcTDC、AcT5H和AcSNAT的克隆与表达分析

【目的】探明猕猴桃中褪黑素合成的相关基因对非生物逆境的响应机制。【方法】利用RT-PCR技术从猕猴桃中克隆了3个褪黑素合成相关基因AcTDC、AcT5H和AcSNAT，并用qRT-PCR技术分析了它们在不同组织和逆境胁迫下的表达。【结果】AcTDC、AcT5H和AcSNAT的ORF区长度分别为1 506、618和579 bp，编码501、205和192个氨基酸，亚细胞定位预测分别在线粒体、内质网和叶绿体中。AcTDC仅在幼果中表达，在根、茎和叶中不表达；AcT5H在幼果中表达量相对较高，茎次之，根和叶较低；AcSNAT在叶中表达量极高，是其他部位表达量的几十至几百倍。测定逆境胁迫下叶片中各基因的表达量，AcTDC仍不表达，AcT5H表达量在脱落酸处理后下调幅度较大，AcSNAT表达量在各处理后下调幅度均较为明显。【结论】3个基因编码的蛋白都较为保守且表达量均具有组织特异性，为进一步研究褪黑素在猕猴桃中的抗逆机制提供了理论基础。     

甘薯、番茄、拟南芥中SPL转录因子的生物信息学分析

对甘薯、番茄、拟南芥中63个SPL基因家族进行了系统进化树分析、保守蛋白基序(Motif)分析,筛选归纳出同源性较高的2个分支的12个SPL基因进行理化性质分析、核定位预测等,氨基酸序列比对结果表明这些基因的功能可能较为保守.通过对番茄中的SPL基因Solyc05g015510.2、Solyc10g078700.1进行表达量分析,发现这2个基因可能参与调控果实成熟衰老进程.另外,通过对非生物胁迫下的转录水平进行分析得知,拟南芥中的AT5G43270可能参与对盐胁迫、热胁迫条件下的响应,AT1G27360、AT1G27370可能参与热胁迫条件下的响应,AT2G42200可能参与冷胁迫条件下的响应,而AT3 G57920在非生物胁迫条件下表达量没有特别明显的变化,表明AT3 G57920可能不参与非生物胁迫下的响应.     

miRNA-145、Oct4和Sox2基因在小鼠早期胚胎发育分化中的表达情况

【目的】揭示miRNA-145、Oct4和Sox2基因与早期胚胎细胞表型间可能存在的关联,为阐明miRNA-145调控早期胚胎发育分化的分子机制奠定基础。【方法】利用手术法收集SPF级昆明小白鼠体内生产的2-细胞胚胎和囊胚,采用SYBR Green I实时荧光定量PCR检测小鼠2-细胞胚胎和囊胚中miRNA-145、Oct4和Sox2基因的表达情况。【结果】在小鼠早期胚胎由2-细胞胚胎发育至囊胚的过程中,miRNA-145在囊胚中的表达量显著高于在2-细胞胚胎中的表达量（P〈0.05,下同）,而Oct4和Sox2在囊胚中的表达量显著低于在2-细胞胚胎中的表达量。【结论】miRNA-145基因表达量上调与Oct4、Sox2基因表达量下调是随着小鼠早期胚胎发育分化的进行同时发生。     

桑树SPL转录因子家族全基因组鉴定及特征分析

SQUAMOSA启动子结合类蛋白质(SQUAMOSA promoter binding protein-like,SPL)是一类植物生长发育和应对胁迫相关的重要转录因子。利用生物信息学方法,从川桑(Morus notabilis)基因组中鉴定到15个SPL基因,进化分析将其归为8个聚类组,其具有保守的基因结构和氨基酸基序,在拟南芥和水稻中存在多个直系同源基因,预测到7个MnSPLs基因的表达受miR156/157调控,MnSPLs在桑树多个组织中检测到表达,其中6个基因在5类组织中均有较高表达量,部分基因主要在冬芽和雄花中有较高表达量,MnSPL基因存在组织表达特异性,在桑树生长发育过程中发挥重要作用。     

唐菖蒲GhAOS基因的表达特性及其在拟南芥中的过表达分析

【目的】分析唐菖蒲AOS基因的表达模式及其对JAs生物合成的影响,研究GhAOS基因对伤害胁迫的应答机理。【方法】利用基因枪的方法进行GhAOS的亚细胞定位分析;运用Real-time RT-PCR技术分析GhAOS基因的表达模式,采用农杆菌介导的侵染拟南芥花粉法进行GhAOS基因的过表达分析。【结果】GhAOS定位在叶绿体的内囊体膜上;该基因在唐菖蒲各组织中均表达,其中在籽球和匍匐茎中表达量最高;经过0.1-0.5 mmol•L-1的茉莉酸甲酯（MJ）处理后,逐渐提高了GhAOS在球茎中的表达量和内源MJ含量;在拟南芥中过量表达该基因,提高了拟南芥的耐盐性和抗旱性;经过机械损伤后提高了转基因拟南芥相关基因的表达水平和内源MJ含量。【结论】GhAOS促进了唐菖蒲茉莉酸类化合物（JAs）的生物合成,提高了拟南芥的耐盐性和抗旱性;转基因拟南芥机械损伤后提高了相关抗性基因的表达水平以及内源MJ的含量。     

拟南芥细胞分裂素受体AHK3亚细胞定位信号的研究

【目的】研究细胞分裂素受体在细胞内定位分布的具体信号及其机制。【方法】构建拟南芥细胞分裂素受体蛋白——组氨酸蛋白激酶3(Arabidopsis histidine kinase 3,AHK3)的一系列亚细胞定位相关表达载体,转化到拟南芥原生质体细胞中进行瞬时表达后,采用激光共聚焦显微镜观察研究AHK3的亚细胞定位信号。【结果】AHK3定位于内质网(Endoplasmic reticulum,ER);AHK3的N端和C端均含有ER定位序列。【结论】AHK3在ER中实现对细胞分裂素的感知及受体蛋白之间的相互应答,并进行下游的信号转导;AHK3含有多段ER驻留信号。     

SBP-box/SPL基因在植物表皮毛发育中的作用

植物表皮毛作为表皮细胞的特有组织在分类、减少热量和水分散失、抵御昆虫和微生物侵害方面发挥作用,同时也是生长发育时相转换的一个重要指标.而且表皮毛在提高产量等农艺性状方面也发挥重要作用,如棉花纤维组织的产量和品质.SBP-box/SPL基因是植物特有的一个较小的基因家族,在生长发育多个方面扮演重要角色,涉及花期、育性、果实成熟、蓝光信号传导、器官大小等性状.其中,在调控植物"年龄"相关的时相转换中作用明显.本文对表皮毛发育调控中SPL基因功能、涉及的microRNA,及它们与其他表皮毛发育调控途径的关系进行综述,以期为植物表皮毛发育的深入研究及应用奠定基础.     

番木瓜pds基因时空表达的荧光定量PCR分析

以番木瓜黄果肉品种Dwarf solo和红果肉品种Sunrise solo为材料,利用实时荧光定量PCR技术,对2个番木瓜品种的不同组织器官以及果实发育成熟过程中5个时期的八氢番茄红素脱氢酶基因(pds)表达进行分析.结果表明,在2个番木瓜品种的果实、花、叶片中,pds转录水平上均有表达,但不同组织部位pds表达量存在差异,在成熟果实中最高,其次为花、叶;在2个番木瓜品种的果实成熟过程中,pds的表达逐渐增加,以在红果中的增加变化更为明显,且pds在红果肉中的表达量高于黄果肉.因此,pds基因可能在调控番木瓜果肉颜色形成中起重要作用.今后将对番木瓜果实中psy、zds、lcy-e等基因的表达进行分析,以全面研究番木瓜类胡萝卜素合成及果肉颜色形成的机理.     

三年生枳砧丘陵坡地椪柑丰产栽培研究

本试验采用半矮化枳砧(Poncirus trifoliata(L.)Raf.)嫁接椪柑(Citrus reticuala Ponkan)良种“东13号”,在红壤丘陵坡地进行了密植早结丰产栽培研究。结果表明,在每亩坡地上密植180株,采用适当的控梢整形、灌水施肥、促花保果及病虫害防治等技术,三年生枳砧椪柑可获得平均亩产2714公斤的产量。本文对丘陵坡地枳砧椪柑密植、早结丰产栽培的主要技术作了探讨。     

三叶木通生物学特性研究

在人工栽培条件下，研究了三叶木通的生物学特性。结果表明，三叶木通一年内可萌发三次新梢，春梢和夏梢的生长期分别为１１０，１３０天左右，当年能进行花芽分化；秋梢因寒害多为枯尖死亡。其花期为３０天左右。     

李、杏优良新品种的落花落果规律及保花保果措施研究

[目的]研究李、杏优良新品种的落花落果规律和保花保果措施。[方法]大蕾期调查花朵数,每隔4～5d观测1次花果数量的变化情况,直到果实采收期。于盛花期喷施营养元素、激素。[结果]李树在盛花后第5天开始落花,第8天达落花高峰;杏树在盛花后第4天开始落花,第8天达落花高峰,不同品种存在差异,极早熟品种骆驼黄杏盛花后第4天即达落花高峰,并持续5d。李树在盛花后第24天达落果高峰;杏树晚熟品种在盛花后第24～25天达落果高峰,早熟品种在盛花后第22天达落果高峰。大石早生李以花期喷硼砂或赤霉素骆驼黄杏以花期喷赤霉素或1200倍稀土串枝红杏以花期喷赤霉素或1200倍稀土、磷酸二氢钾、硼砂,丰仁杏、国仁杏均以花期喷磷酸二氢钾或硼砂提高坐果率效果显著。[结论]李、杏树在果实采收前均会出现2次落花落果高峰,为花后4～8d和花后22～25d。于盛花期喷施营养元素或激素可显著提高坐果率。     

Navelate脐橙的落花落果规律研究

[目的]对Navelate脐橙（Citrus sinensisOsbeck cv.′Navelate′）的落花落果情况进行观察研究,为制定合适的保花保果措施提供依据。[方法]选择树势中庸一致的2株树,2008年从4月7日开始,2009年从3月24日开始,每天调查其落花落果数量,探讨其落花落果规律。[结果]2008年Navelate脐橙的落花从4月上旬开始,持续到4月下旬,2次落花的高峰期为4月12-14、16日。生理落果从4月下旬开始,持续到6月下旬,第1次生理落果从4月下旬持续到5月下旬,落果高峰为5月14、89日;第2次生理落果从5月中旬开始持续到6月下旬,落果的高峰期为5月16-20日。2009年Navelate脐橙的落花从3月下旬开始持续到4月下旬,2次落花高峰为3月28-31日和4月10-17日。落果从4月下旬开始,持续到6月中旬,第1次生理落果从4月下旬持续到5月下旬,落果高峰期为4月25-28日和5月5-10日;第2次生理落果从5月中旬开始,持续到6月中旬,落果高峰为5月10-18日。在2008、2009年,Navelate脐橙的坐果率为1.09%-2.30%,脐黄落果率为19.00%39.20%,裂果率为11.80%-14.80%。[结论]该研究弄清了Navelate脐橙的落花落果、脐黄和裂果规律,可为保花保果提供科学依据。     

一个新的枳NAC基因cDNA全长的克隆及其亚细胞定位分析

以拟南芥的NAC1 cDNA序列作为模板,对柑橘EST数据库进行同源检索筛选,利用生物信息学方法克隆了柑橘NAC1基因的cDNA序列。以枳(Poncirus trifoliata)花的cDNA为模板,根据以上cDNA序列设计特异性引物,利用5'RACE和3'RACE技术,分别获得了NAC1基因的5'和3'末端,序列拼接后获得枳的NAC1 cDNA全长,命名为Pt-NAC1。Pt-NAC1全长为1351 bp,含有1个1047 bp完整的开放读码框(ORF),5'末端起始密码子ATG起始于25 bp,3'末端非翻译区为280 bp。该cDNA推导编码348个氨基酸,与苹果、拟南芥、杨树中相应序列的同源性分别为64.8%、57.0%、61.3%。生物信息学分析结果表明:Pt-NAC1 cDNA序列中有miRNA164的识别位点,还有高度保守的NAC结构域。构建Pt-NAC1亚细胞定位载体35S-GW-GFP-FJ619349,用基因枪转化洋葱表皮细胞,亚细胞定位结果表明:Pt-NAC1均定位于细胞膜中。     

修剪与化控相结合调节四季蜜龙眼夏季成花坐果试验

［目的］ 为四季蜜龙眼的示范推广提供理论依据和技术指导。［方法］ 以四季蜜龙眼为试材,通过田间试验研究了不同调控措施对四季蜜龙眼夏季成花坐果的影响。［结果］ 各处理的末次梢成花率分别为80.33%、93.96%、96.12%和70.52%,分别比对照增加了0.38、0.62、0.66和0.21倍。各处理的末次梢成花整齐率分别为67.32%、81.97%、93.33%和72.05%,分别比对照增加了0.52、0.84、1.10和0.62倍。各处理的平均单株产量分别为7.80、8.02、10.71和6.73 kg/株,分别比对照增加了1.10、1.16、1.89和0.81倍。各处理的单穗果粒数分别为31.7、47.5、48.1和33.5粒/穗,分别比对照增加了2.7、18.5、19.1和4.5粒/穗。各处理的平均单穗重分别为233.04、349.26、367.18和265.53 g,分别比对照增加了19.04、135.26、153.18和51.53 g。［结论］ 在2-3月修剪和在结果母枝充分成熟时喷施乙烯利0.012%＋多效唑0.008%对四季蜜龙眼夏季成花坐果的调控效果最佳。