miR-33a靶向Lipin1和IRS2调节绵羊前体脂肪细胞分化的研究

旨在揭示miR-33a在绵羊前体脂肪细胞分化中的生物学功能。本研究以15日龄雄性绵羊背部皮下前体脂肪细胞为试验材料,所有的试验均设立3个重复;利用生物信息学软件预测miR-33a的靶基因,并通过双荧光素酶报告试验对预测的潜在靶基因进行验证;用qPCR和Western blotting分别检测miR-33a、Lipin1和IRS2及其编码蛋白的表达,以揭示miR-33a与其靶基因在绵羊前体脂肪细胞分化中的表达规律;慢病毒介导实现miR-33a的过表达和干扰后,检测Lipin1、IRS2和成脂标志基因的表达,并用油红O染色检测脂滴沉积能力,以解析miR-33a对其靶基因的调节机制。生物信息学分析发现,miR-33a与Lipin1和IRS2 3'-UTR都存在结合位点,miR-33a显著下调Lipin1和IRS2野生型双荧光质粒的相对荧光活性（P<0.05）;在绵羊前体脂肪细胞分化中,miR-33a与Lipin1和IRS2的表达趋势相反;过表达miR-33a后,显著下调了Lipin1（P<0.01）和IRS2（P<0.05）及其编码蛋白以及成脂标志基因的表达;干扰miR-33a后,这些基因和蛋白的表达则显著上调;过表达miR-33a减少了脂滴沉积,干扰miR-33a促进了脂滴沉积。在绵羊前体脂肪细胞分化中,miR-33a与Lipin1和IRS2的表达呈负相关。miR-33a靶向Lipin1和IRS2的3'-UTR抑制绵羊前体脂肪细胞分化和脂滴沉积。     

miR-128-1-5p对绵羊前体脂肪细胞增殖和分化调节作用的研究

旨在研究miR-128-1-5p对绵羊前体脂肪细胞增殖与分化的调节作用。本研究经理论预测和试验研究验证miR-128-1-5p的靶基因;过表达miR-128-1-5p后,用qPCR检测增殖标志基因的表达,CCK-8和EdU检测细胞增殖情况;用qPCR和Western blotting检测miR-128-1-5p和其靶基因在前体脂肪细胞分化中的表达趋势;通过过表达或抑制miR-128-1-5p研究其对绵羊前体脂肪细胞分化的调节机制;用油红O染色检测成脂能力。结果表明,KLF2是miR-128-1-5p的靶基因。前体脂肪细胞增殖过程中,过表达miR-128-1-5p后,增殖标志基因的表达量显著或极显著降低(P0.05或P0.01),细胞活力显著或极显著降低(P0.05或P0.01),新生细胞数显著减少(P0.05)。前体脂肪细胞分化过程中,miR-128-1-5p与KLF2的表达呈负相关;过表达miR-128-1-5p极显著下调了KLF2 mRNA的表达量(P0.01),显著下调了KLF2蛋白的表达量(P0.05),显著或极显著上调了分化标志基因mRNA的表达(P0.05或P0.01),产生更多脂滴;抑制miR-128-1-5p则结果相反。综上所述,miR-128-1-5p与KLF2存在结合位点。miR-128-1-5p抑制绵羊前体脂肪细胞的增殖,在分化过程中通过靶向抑制KLF2的表达,促进前体脂肪细胞分化和脂滴沉积。     

microRNA-425-5p对3T3-L1前体脂肪细胞增殖、分化的影响

为了探究miR-425-5p对小鼠3T3-L1前体脂肪细胞增殖、分化的影响效应,本试验采用实时荧光定量PCR检测miR-425-5p组织和细胞表达水平;运用CCK8、EdU、油红染色、甘油三酯含量分析等分别检测miR-425-5p对前体脂肪细胞增殖、分化的影响;利用生物信息学软件和双荧光素酶报告试验分别预测、验证miR-425-5p调控前体脂肪细胞分化的靶基因。结果表明,miR-425-5p在肥胖小鼠脂肪组织中低表达,在前体脂肪细胞增殖、分化过程中动态表达;与阴性对照相比,过表达miR-425-5p可促进前体脂肪细胞增殖,抑制脂肪细胞分化标志基因(PPARγ、C/EBPα、FAS等)表达,减少脂滴和甘油三酯积累;抑制miR-425-5p表达可抑制前体脂肪细胞增殖,阻止前体脂肪细胞诱导分化。在前体脂肪细胞分化过程中,过表达或抑制miR-425-5p可分别抑制或促进IGF1基因表达;与阴性对照相比,过表达miR-425-5p可抑制IGF1基因3′-UTR荧光活性,而突变miR-425-5p种子序列与IGF1基因3′-UTR的绑定位点可解除该抑制效果。综上所述,miR-425-5p可促进3T3-L1前体脂肪细胞增殖,并可直接靶向IGF1负向调控其分化。     

miR-132-3p靶向UCP2调节绵羊前体脂肪细胞分化的研究

旨在研究miR-132-3p对绵羊前体脂肪细胞中UCP2基因的表达调控机制。本研究以绵羊皮下脂肪细胞为研究对象,检测miR-132-3p与UCP2在绵羊前体脂肪细胞中的作用机制;利用生物信息学软件预测miR-132-3p与UCP2的结合位点,并通过双荧光素酶报告试验验证miR-132-3p与UCP2的靶标关系;在绵羊前体脂肪细胞中过表达miR-132-3p,用RT-qPCR、Western blotting技术检测过表达后UCP2mRNA和蛋白的表达水平;最后,采用RT-qPCR检测绵羊前体脂肪细胞分化过程中UCP2和miR-132-3p的表达。结果表明,miR-132-3p在UCP2 3′-UTR上存在结合位点,并显著下调UCP2 3′-UTR重组双荧光质粒的相对荧光活性(P0.05);过表达miR-132-3p显著下调UCP2mRNA的表达(P0.05),且明显降低UCP2蛋白的表达量;绵羊前体脂肪细胞分化中期miR-132-3p与UCP2的表达存在负相关关系。综上表明,miR-132-3p通过特异性结合UCP2 3′-UTR抑制UCP2在mRNA和蛋白水平的表达,在一定程度上促进绵羊前体脂肪细胞的分化。     

microRNA-425-5p对3T3-L1前体脂肪细胞增殖、分化的影响

为了探究miR-425-5p对小鼠3T3-L1前体脂肪细胞增殖、分化的影响效应,本试验采用实时荧光定量PCR检测miR-425-5p组织和细胞表达水平;运用CCK8、EdU、油红染色、甘油三酯含量分析等分别检测miR-425-5p对前体脂肪细胞增殖、分化的影响;利用生物信息学软件和双荧光素酶报告试验分别预测、验证miR-425-5p调控前体脂肪细胞分化的靶基因。结果表明,miR-425-5p在肥胖小鼠脂肪组织中低表达,在前体脂肪细胞增殖、分化过程中动态表达;与阴性对照相比,过表达miR-425-5p可促进前体脂肪细胞增殖,抑制脂肪细胞分化标志基因(PPARγ、C/EBPα、FAS等)表达,减少脂滴和甘油三酯积累;抑制miR-425-5p表达可抑制前体脂肪细胞增殖,阻止前体脂肪细胞诱导分化。在前体脂肪细胞分化过程中,过表达或抑制miR-425-5p可分别抑制或促进IGF1基因表达;与阴性对照相比,过表达miR-425-5p可抑制IGF1基因3′-UTR荧光活性,而突变miR-425-5p种子序列与IGF1基因3′-UTR的绑定位点可解除该抑制效果。综上所述,miR-425-5p可促进3T3-L1前体脂肪细胞增殖,并可直接靶向IGF1负向调控其分化。     

miR-128-1-5p对绵羊前体脂肪细胞增殖和分化调节作用的研究

旨在研究miR-128-1-5p对绵羊前体脂肪细胞增殖与分化的调节作用。本研究经理论预测和试验研究验证miR-128-1-5p的靶基因；过表达miR-128-1-5p后，用qPCR检测增殖标志基因的表达，CCK-8和EdU检测细胞增殖情况；用qPCR和Western blotting检测miR-128-1-5p和其靶基因在前体脂肪细胞分化中的表达趋势；通过过表达或抑制miR-128-1-5p研究其对绵羊前体脂肪细胞分化的调节机制；用油红O染色检测成脂能力。结果表明，KLF2是miR-128-1-5p的靶基因。前体脂肪细胞增殖过程中，过表达miR-128-1-5p后，增殖标志基因的表达量显著或极显著降低（P<0.05或P<0.01），细胞活力显著或极显著降低（P<0.05或P<0.01），新生细胞数显著减少（P<0.05）。前体脂肪细胞分化过程中，miR-128-1-5p与KLF2的表达呈负相关；过表达miR-128-1-5p极显著下调了KLF2 mRNA的表达量（P<0.01），显著下调了KLF2蛋白的表达量（P<0.05），显著或极显著上调了分化标志基因mRNA的表达（P<0.05或P<0.01），产生更多脂滴；抑制miR-128-1-5p则结果相反。综上所述，miR-128-1-5p与KLF2存在结合位点。miR-128-1-5p抑制绵羊前体脂肪细胞的增殖，在分化过程中通过靶向抑制KLF2的表达，促进前体脂肪细胞分化和脂滴沉积。     

miR-215-5p通过靶向NCOA3基因抑制固始鸡腹部前脂肪细胞的增殖和分化

为揭示miR-215-5p在固始鸡腹部脂肪沉积中的作用机制,本研究采用实时荧光定量PCR,分析了miR-215-5p在14周龄固始鸡8种组织和腹部前脂肪细胞分化过程的表达特征;通过miR-215-5p mimics和inhibitors转染试验,利用CCK-8、EdU、油红O染色、甘油三酯含量测定等方法,分别评价了miR-215-5p对固始鸡腹部前体脂肪细胞增殖和分化的影响。结果表明:miR-215-5p在固始鸡腹脂和皮脂等组织中高表达,在前脂肪细胞分化过程具明显时序表达特征;当转染miR-215-5p mimics后,前体脂肪细胞中增殖标志基因CDK1和PCNA表达水平极显著下降(P0.01)、细胞周期阻滞因子p21表达水平极显著升高(P0.01),EdU阳性细胞比例和前脂肪细胞总数极显著降低;同时,可显著抑制脂肪细胞分化标志基因PPARG、CEBPA、FABP4和LPL的表达,减少脂肪细胞内脂滴生成和甘油三酯含量。与此不同,miR-215-5p inhibitors转染前脂肪细胞后,在增殖和分化上获得与miR-215-5p mimics转染后相反的结果。同时,采用双荧光素酶报告基因系统,验证了mi-R-215-5p的靶基因,过表达miR-215-5p可抑制核受体辅激活因子3 (nuclear receptor coactivator 3, NCOA3)基因3′-UTR区荧光活性,而突变NCOA3基因3′-UTR区与miR-215-5p种子序列的结合位点可解除其抑制效果。上述结果证明,miR-215-5p可抑制固始鸡腹部前脂肪细胞的增殖和分化,且在脂肪细胞分化过程中直接靶作用于NCOA3。因此,miR-215-5p是固始鸡腹部脂肪形成的一个负调控因子。     

miR-130b靶向PPARγ抑制家兔前体脂肪细胞分化

旨在探究miR-130b是否可通过靶向PPARγ抑制家兔前体脂肪细胞的分化。采集初生新西兰仔兔肾周脂肪细胞进行原代培养,鸡尾酒法诱导分化后,用RT-qPCR分别测定前体脂肪细胞分化第0、第2、第6、第10天miR-130b表达量及PPARγ(Peroxisome Proliferators-Activated Receptorγ,PPARγ)和C/EBPα(CCAAT/enhancer binding proteinα,C/EBPα)mRNA的表达量,生物信息学软件鉴定miR-130b的同源性,预测miR-130b的靶基因;前体脂肪细胞转染miR-130bmimic和miR-130binhibitor后,检测miR-130b、PPARγ和C/EBPα的表达差异,用油红O染色鉴定前体脂肪细胞分化程度。结果表明:1)在前体脂肪细胞分化过程中,miR-130b、PPARγ和C/EBPα表达量存在差异;分化第8天时,油红染色发现大量橘红色脂滴;生物信息学软件预测PPARγ可作为miR-130b的靶基因,且miR-130b在哺乳动物中具有较高的同源性。2)过表达miR-130b后,mimic组PPARγ和C/EBPα的表达量极显著低于NC组(P0.01)。3)抑制表达miR-130b后,inhibitor组PPARγ的表达量极显著高于inhibitor NC组(P0.01),inhibitor组C/EBPα表达量显著高于inhibitor NC组(P0.05)。4)油红O染色显示分化程度:inhibitor组NC组mimic组。综上所述,miR-130b在家兔前体脂肪细胞分化过程中差异表达,且可通过靶向PPARγ抑制前体脂肪细胞分化。     

miR-142和miR-144靶向FoxO1基因调节绵羊前体脂肪细胞分化的研究

旨在预测并验证调节FoxO1基因表达的关键miRNAs及其调节脂肪分化的机制。本研究利用4个在线软件预测与FoxO1基因具有潜在靶标关系的miRNAs。用双荧光素酶报告系统检测荧光活性。用荧光定量PCR、Western blotting和油红O染色,分别在mRNA和蛋白水平上检测miRNA对FoxO1表达的影响以及对绵羊前体脂肪细胞分化的调节作用。结果表明,miR-142和miR-144与FoxO1具有靶标关系。过表达miR-142和miR-144显著抑制了双荧光素酶报告载体的荧光活性,下调了FoxO1mRNA(P0.01)及其编码蛋白的表达(P0.05)。miR-142和miR-144均可促进绵羊前体脂肪细胞分化,加快脂滴形成。由此证明,miR-142和miR-144靶向负调节FoxO1的表达,进而通过FoxO1对PPARγ的负调节促进绵羊前体脂肪细胞的分化。     

miR-138靶向PGC-1α调控牦牛肌内前体脂肪细胞增殖及分化

旨在分析miR-138在牦牛前体脂肪细胞分化过程中的调控作用。本研究设计合成miR-138 mimics和inhibitor以对细胞进行miR-138过表达及抑制表达,并通过油红O染色分析miR-138对牦牛肌内前体脂肪细胞脂质沉积的影响;利用CCK-8、划痕和流式细胞技术分析miR-138对细胞增殖的影响;通过对bta-miR-138进行生物信息学分析,筛选其在脂质沉积过程中的相关潜在靶基因;利用RT-qPCR测定miR-138潜在靶基因mRNA表达水平,并通过双荧光素酶报告试验确定靶向关系。结果显示,过表达miR-138后,细胞内脂滴沉积水平显著低于对照（NC）组（P<0.01）,而抑制miR-138表达则显著增强脂肪细胞脂质沉积（P<0.01）;RT-qPCR结果表明,过表达miR-138可显著抑制脂肪分化标志基因PPARγ和c/EBPα的表达（P<0.01）,抑制miR-138则上调PPARγ和c/EBPα表达水平（P<0.05）;此外,过表达miR-138后,潜在靶基因PTPN11、CREB1和ADCYAP1R1表达水平显著下调（P<0.05）,而PGC-1α和SNAP25表达极显著下调（P<0.01）;抑制miR-138后MXLIP和SNAP25表达显著上调（P<0.05）,PGC-1α和PTPN11表达极显著上调（P<0.01）;CCK-8和划痕试验结果表明,过表达miR-138后24~36 h,细胞增殖活性显著低于对照组（P<0.05）,而抑制miR-138则表现为细胞增殖活性增强;流式分析结果显示过表达miR-138后,细胞出现G1-S期阻滞,细胞周期相关基因CCND1、CCNB1和增殖标志基因Ki67的mRNA表达显著降低;生物信息学分析预测获得263个miR-138公共靶基因,KEGG富集结果显示靶基因主要参与“轴突导引”、“胰岛素抵抗”、“胰岛素分泌”及“RNA降解”等通路,GO分析主要富集于“RNA聚合酶Ⅱ启动子对转录的正向调控”、“核染色质”、“染色质DNA结合”和“I型肺细胞分化”等功能;双荧光素酶报告试验结果显示,共转染miR-138 mimics和PGC-1α-Wt-PGL3-basic可显著降低细胞荧光强度（P<0.01）。以上结果表明,miR-138可通过靶向结合PGC-1α 3'UTR序列,降低PGC-1α的mRNA表达水平,抑制牦牛肌内前体脂肪细胞分化和脂质沉积,降低细胞增殖活性。本研究为阐明牦牛肉质性状的潜在分子机制提供参考。     

莱芜猪前体脂肪细胞的原代培养及诱导分化研究

为了建立莱芜猪前体脂肪细胞的体外培养体系,探索猪脂肪组织增生的生物学特征。本研究采集1日龄莱芜猪仔猪颈、背部皮下脂肪组织,采用胶原酶与胰蛋白酶相结合的方法,分离原代前体脂肪细胞,进行前体脂肪细胞的原代和传代培养,以及前体脂肪细胞诱导分化的研究,并采用Real-time PCR方法检测前体脂肪细胞分化过程中关键基因PPARγ的表达。结果表明,分离的猪原代前体脂肪细胞约8h后开始贴壁,贴壁的细胞呈短梭形或不规则的三角形,第3天多数细胞进入指数生长期,呈成纤维细胞样形态,细胞生长曲线近似S形;诱导培养结果显示,少量细胞在第2天开始出现脂滴,大多数细胞在第3天出现脂滴,第7～8天小脂滴逐渐融合成大脂滴,在第12天左右融合成大脂滴,油红O染色呈橘红色。在前体脂肪细胞分化过程中PPARγ基因mRNA的表达量逐渐增加,在诱导后的48h表达量最高,随后其表达丰度逐渐下降。本试验成功建立了莱芜猪前体脂肪细胞培养体系和体外诱导分化模型,为进一步研究莱芜猪前体脂肪细胞增殖与分化机制和猪体脂肪的沉积奠定基础。     

Wnt10b对山羊前体脂肪细胞分化相关基因表达的影响

旨在利用RNA干扰技术,明确Wnt10b基因对山羊前体脂肪细胞分化的影响。设计合成山羊Wnt10b siRNA序列,利用胶原酶消化法获得山羊皮下和肌内前体脂肪细胞。利用有效的siRNA序列干扰山羊皮下和肌内前体脂肪细胞Wnt10b基因表达后,检测其对细胞分化及脂肪细胞分化标志基因表达的影响。结果表明,筛选获得有效的山羊Wnt10bsiRNA序列,转染山羊皮下和肌内前体脂肪细胞后,Wnt10b被显著干扰,其mRNA表达量分别下调63%(P0.01)和67%(P0.01);油红O染色结果显示,干扰Wnt10b基因可明显抑制山羊皮下和肌内脂肪细胞的脂滴积聚;且干扰Wnt10b基因后,在皮下前体脂肪细胞分化过程中C/EBPβ、PPARγ、SREBP1和Pref1基因出现极显著下调(P0.01),LPL出现显著下调(P0.05);而在肌内前体脂肪细胞分化过程中,AP2和LPL基因出现极显著下调(P0.01),C/EBPβ出现显著下调(P0.05),Pref1出现极显著上调(P0.01)。本试验发现,Wnt10b基因可能通过调控C/EBPβ、PPARγ、SREBP1和LPL的表达来促进山羊皮下前体脂肪细胞分化,通过调控AP2、LPL、C/EBPβ和Pref1的表达来促进山羊肌内前体脂肪细胞分化。     

秦川肉牛脂肪细胞PLIN2基因干扰siRNA筛选及过表达载体效率检测

试验旨在获得秦川牛肉用新品系（以下简称"秦川肉牛"）具有高干扰效率的脂肪细胞分化相关蛋白2（PLIN2）基因干扰siRNA及高过表达效率的基因超表达载体,为后续研究PLIN2基因在秦川肉牛脂肪细胞分化过程中的功能提供试验依据。通过采用siRNA介导的靶基因沉默技术合成靶向牛PLIN2 mRNA序列的si-PLIN2及构建真核pcDNA3.1（+）-PLIN2过表达载体,利用FuGENE6低毒性转染试剂配制转染复合物,转染秦川肉牛脂肪细胞并进行诱导分化。采用实时荧光定量PCR检测技术检测各试验组与对照组中PLIN2基因的相对表达量,并计算目的基因干扰及过表达效率;采用Western blotting方法检测蛋白水平的表达情况;采用BODIPY脂滴染色的方法观察表型。结果表明,转染秦川肉牛前体脂肪细胞后干扰组3对si-PLIN2（si-PLIN2_01、si-PLIN2_02和si-PLIN2_03）与对照组（si-PLIN2-NC）相比,PLIN2基因表达量下降（P<0.01）,干扰效率分别为71%、54%和50%;蛋白水平检测发现,si-PLIN2_01、si-PLIN2_03组蛋白水平表达与对照组（si-PLIN2-NC）相比出现下降趋势;脂滴染色后发现,干扰组与对照组相比,脂滴数目明显减少。过表达组pcDNA3.1（+）-PLIN2与对照组相比,PLIN2基因表达量显著上调,达35倍,脂滴数目明显增多。综上所述,siRNA介导的PLIN2基因沉默或pcDNA3.1（+）介导的体外表达载体均可以成功实现对PLIN2基因在秦川肉牛脂肪细胞分化过程中的干扰或超表达,并影响脂肪细胞分化过程中脂滴的形成数量。本研究为进一步探究PLIN2在秦川肉牛脂肪细胞分化过程中的功能奠定基础。     

miR-106b-5p靶向KLF4调控山羊肌内前体脂肪细胞分化

旨在明确miR-106b-5p对山羊肌内前体脂肪细胞分化的影响,并确定这种作用是通过靶向KLF4来实现的。本研究利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术检测miR-106b-5p在山羊肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达模式,通过脂质体转染技术将miR-106b-5p mimic和miR-106b-5p inhibitor转入体外培养的山羊肌内前体脂肪细胞,油红O染色法从形态学验证miR-106b-5p对脂肪细胞中脂滴积聚的影响,qRT-PCR检测预测的靶标基因KLF4和脂肪分化标志基因的表达情况,利用双荧光素酶报告系统鉴定miR-106b-5p与KLF4的靶标关系。qRT-PCR结果显示,miR-106b-5p在山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化第3天时表达量最高。在山羊肌内脂肪细胞中干扰miR-106b-5p后油红O染色显示脂滴聚积减少,过表达miR-106b-5p后脂滴聚积增加。在山羊肌内前体脂肪细胞中转染miR-106b-5p inhibitor后PPARγ表达量显著降低(P0.05),而KLF4表达量极显著升高(P0.01);转染miR-106b-5p mimic后LPL和PPARγ表达量极显著升高(P0.01)。荧光素酶活性试验结果显示,过表达miR-106b-5p可显著抑制KLF4荧光活性。miR-106b-5p通过靶向并负调节KLF4的表达促进山羊肌内脂肪细胞分化。     

miR-106b-5p靶向KLF4调控山羊肌内前体脂肪细胞分化

旨在明确miR-106b-5p对山羊肌内前体脂肪细胞分化的影响，并确定这种作用是通过靶向KLF4来实现的。本研究利用实时荧光定量PCR （quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技术检测miR-106b-5p在山羊肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达模式，通过脂质体转染技术将miR-106b-5p mimic和miR-106b-5p inhibitor转入体外培养的山羊肌内前体脂肪细胞，油红O染色法从形态学验证miR-106b-5p对脂肪细胞中脂滴积聚的影响，qRT-PCR检测预测的靶标基因KLF4和脂肪分化标志基因的表达情况，利用双荧光素酶报告系统鉴定miR-106b-5p与KLF4的靶标关系。qRT-PCR结果显示，miR-106b-5p在山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化第3天时表达量最高。在山羊肌内脂肪细胞中干扰miR-106b-5p后油红O染色显示脂滴聚积减少，过表达miR-106b-5p后脂滴聚积增加。在山羊肌内前体脂肪细胞中转染miR-106b-5p inhibitor后PPARγ表达量显著降低（P<0.05），而KLF4表达量极显著升高（P<0.01）；转染miR-106b-5p mimic后LPL和PPARγ表达量极显著升高（P<0.01）。荧光素酶活性试验结果显示，过表达miR-106b-5p可显著抑制KLF4荧光活性。miR-106b-5p通过靶向并负调节KLF4的表达促进山羊肌内脂肪细胞分化。     

脂肪沉积相关的miRNA在3T3-L1前体脂肪细胞分化过程中的表达模式

miRNA是一类广泛存在于动植物中的内源性单链非编码RNA,长20~25 nt,通过与特异的靶mRNA结合在转录后水平调控基因表达。脂肪细胞是由前脂肪细胞分化并聚集脂滴形成,多种成脂基因参与其中。本实验旨在研究2个miRNA在分化后的3T3-L1脂肪细胞中表达量的变化,为进一步研究miRNA对脂肪细胞的调控打下基础。本试验使用"鸡尾酒"法诱导3T3-L1分化,在诱导细胞分化后0 d、2 d、4 d、6 d、8 d分别观察细胞形态并进行油红-O染色,同时采用q-PCR技术对3T3-L1细胞分化后5个时间点中的miR-103、miR-21进行相对定量,从而找出这些miRNA在3T3-L1前脂肪细胞分化中的动态变化。实验结果表明:随着诱导分化时间的增加,3T3-L1细胞逐渐由梭形变成圆形,且胞内出现脂环,说明细胞诱导分化成功;其次miRNA在脂肪细胞分化过程中表达量有不同程度的差异,miR-103表达量为先升高后降低,整体呈上升趋势;miR-21表达量为先急剧升高,后缓慢上升,也就是说这些miRNA对脂肪细胞的分化起到调控作用。     

miR-18b-3p靶向SCD调控绵羊前体脂肪细胞分化的研究

本实验旨在研究miR-18b-3p及其靶基因SCD调控绵羊前体脂肪细胞分化的作用机制。采集3日龄公羊背最长肌,培养绵羊前体脂肪细胞并进行诱导分化,采用油红O染色检测细胞分化情况;通过TargetScan预测miR-18b-3p的靶基因,通过qRT-PCR测定miR-18b-3p、靶基因SCD以及分化标志基因PPARγ、CEBPα在分化过程中的时序性表达;分别转染miR-18b-3p过表达载体(mimics)或抑制载体(inhibitor)及阴性对照至前体脂肪细胞后,通过qRT-PCR及Western blot检测miR-18b-3p对SCD以及分化标志基因表达量的作用;采用双荧光素酶证明miR-18b-3p是否靶向SCD基因。结果表明:miR-18b-3p在分化过程中的表达量先上升后下降,在第6天表达量最高;SCD表达量低于阴性对照组(P0.01),PPARγ及CEBPα基因表达量均低于阴性对照组(P0.05),SCD蛋白表达量低于阴性对照组(P0.01),油红O染色面积减少(P0.05);转染miR-18b-3p inhibitor后,SCD、CEBPα基因表达量均高于阴性对照组(P0.01),PPARγ基因表达量高于阴性对照组(P0.05),SCD蛋白表达量高于阴性对照组(P0.01),油红O染色面积增加(P0.05);miR-18b-3p对SCD基因具有直接靶向作用。本实验首次在绵羊上证明miR-18b-3p可以通过靶向SCD抑制前体脂肪细胞分化,为绵羊选育给予分子育种技术支撑。     

共培养体系中猪骨骼肌卫星细胞对肌内前体脂肪细胞脂质沉积的影响

本试验旨在研究共培养体系中猪骨骼肌卫星细胞对肌内前体脂肪细胞脂质沉积的影响。试验分离培养了猪骨骼肌卫星细胞和肌内前体脂肪细胞,2种细胞分离培养鉴定后,接种于Transwell细胞小室共培养板进行共培养,待细胞密度达到90%以上分别进行诱导分化。骨骼肌卫星细胞诱导分化8 d后,检测肌内前体脂肪细胞分化水平、分化标志基因的表达以及脂质代谢关键酶的表达。结果显示:与肌内前体脂肪细胞单独培养相比,共培养体系内肌内前体脂肪细胞的脂滴数量和脂滴面积极显著减少(P0.01),肌内前体脂肪细胞增殖分化转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ和CCAAT增强子结合蛋白的基因和蛋白表达水平极显著下降(P0.01),肌内前体脂肪细胞的乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合成酶的基因和蛋白表达水平极显著下降(P0.01)。由此可见,共培养体系中猪骨骼肌卫星细胞对肌内前体脂肪细胞脂质沉积具有抑制作用。     

猪微小RNA-15b前体突变对其生物学加工过程及前体脂肪细胞分化的影响

基于在猪微小RNA-15b(miR-15b)前体（pre-miR-15b）基因位点第58位碱基上发现了1个C>T突变（+58C>T）,本试验旨在探究此突变对微小RNA(miRNA)生物学加工过程以及对猪前体脂肪细胞分化的影响。试验通过构建野生型（pmR-miR-15bW）和突变型（pmR-miR-15bM）miR-15b过表达载体,分别转染猪原代前体脂肪细胞进行miR-15b的过表达试验,然后利用实时荧光定量PCR对比2组细胞pre-miR-15b和miR-15b成熟体的表达量,在体外细胞水平明确+58C>T对miR-15b生物学加工过程的影响;随后,诱导转染了不同基因型miR-15b过表达载体（pmR-miR-15bW和pmR-miR-15bM）的猪前体脂肪细胞成脂分化,利用实时荧光定量PCR对比2组细胞miR-15b靶基因叉头框蛋白O1(FOXO1)（可抑制脂肪细胞分化）以及成脂分化相关基因的相对表达量,同时结合油红O染色,明确此突变对猪前体脂肪细胞分化的影响。结果表明：2组细胞miR-15b初级转录本（pri-miR-15b）的表达量没有显著差异（P>0....     

调控牛CEBPA基因表达的miRNA筛选及对肌内前体脂肪细胞增殖和分化的影响

旨在筛选并验证调控牛增强子结合蛋白A(CCAAT/enhancer binding protein alpha,CEBPA)表达的miRNA及其对肌内前体脂肪细胞增殖和分化的影响。本研究综合运用多个在线软件筛选与CEBPA基因具有潜在调控关系的miRNA,运用qRT-PCR技术检测CEBPA基因在关岭牛各类组织中的表达水平;构建CEBPA-3′UTR-WT和CEBPA-3′UTR-MUT双荧光素酶报告载体,通过双荧光素酶报告系统验证候选miRNA与CEBPA基因的结合关系;分离培养关岭牛肌内前体脂肪细胞,利用qRT-PCR、Western blot、油红O染色和CCK-8探究调控CEBPA的miRNA对牛肌内前体脂肪细胞分化与增殖的影响。生物信息学分析发现,bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a、bta-miR-181b、bta-miR-181c、bta-miR-181d与CEBPA基因具有潜在结合关系;qRT-PCR结果表明,CEBPA基因在关岭牛内脏组织、肌肉组织、脂肪、下丘脑以及部分生殖器官中均有表达,在2岁牛背最长肌的表达量极显著高于1日龄犊牛(P0.01);双荧光素酶报告系统结果表明,bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a能直接结合牛CEBPA基因3′UTR;细胞试验结果表明,CEBPA基因在牛肌内前体脂肪细胞分化中的表达水平随时间逐渐升高,bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a在分化0 d表达水平极显著高于其他时期(P0.01),整个分化时期bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a与CEBPA基因表达趋势相反;过表达miR-23a、miR-23b-3p、miR-181a均能极显著降低CEBPA基因mRNA和蛋白表达量(P0.01),并降低牛肌内前体脂肪细胞中脂滴含量;bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a能阶段性促进细胞增殖。结果表明,bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a能阶段性的促进牛肌内前体脂肪细胞增殖,并通过直接负调控CEBPA的表达来间接影响该细胞分化。