樱桃病毒A外壳蛋白基因克隆及其原核表达

为制备樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA)抗血清,克隆CVA外壳蛋白基因(CP),构建原核表达载体,优化蛋白表达条件。根据CVA全基因组序列(NC_003689.1)设计特异引物,RT-PCR方法扩增CVA外壳蛋白基因,克隆、测序,构建原核表达载体pET30a-CVACP,转化大肠杆菌BL21(DE3)株系,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达。序列分析显示,该区段长为603 bp,编码201个氨基酸,与法国分离物PF(HQ267856.1)的同源性为96.8%,与印度分离物JKSPMi-5(FN669548.1)同源性为86.3%。成功构建了原核表达载体pET30a-CVACP,SDS-PAGE电泳分析显示,转pET30a-CVACP载体的BL21(DE3)菌株表达分子量约24 kDa的重组蛋白,该重组蛋白在37℃、1.5 mmol/L IPTG、诱导4 h条件下表达量最大。     

草莓轻型黄边病毒CP基因的克隆、序列分析及原核表达

克隆草莓轻型黄边病毒CP基因,并构建其原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达CP蛋白。利用SMYEV的检测引物,通过RT-PCR技术筛选带SMYEV的草莓植株;根据NCBI中SMYEV序列设计扩增CP基因全长引物,通过RT-PCR获得SMYEV沈阳分离物CP基因全长序列;将CP基因克隆到原核表达pGEX-6P-1上,利用IPTG诱导CP基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达蛋白。利用RT-PCR扩增获得SMYEV分离物SY05的CP基因全长序列,由729个核苷酸组成,编码242个氨基酸残基。SY05与其他SMYEV分离物的核苷酸同源性为80.1%～97.4%,氨基酸同源性为92.1%～99.6%,其中,与SMYEV分离物SY03的氨基酸一致性为98.3%。将SY05的CP基因成功克隆到原核表达载体pGEX-6P-1上,构建了重组表达载体p6P-EV-CP,并将其导入大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE分析表明,IPTG诱导SMYEV分离物SY05的CP基因在大肠杆菌中表达出分子量为52.0 kDa的融合蛋白。克隆出SMYEV分离物SY05的CP基因,实现了其在原核细胞中的表达,为SMYEV抗血清的制备奠定了重要基础。     

番茄褪绿病毒CP基因克隆、序列分析及原核表达

为制备番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,To CV)抗血清,以番茄病叶为试验材料,提取总RNA,根据To CV CP基因设计特异性引物,利用RT-PCR方法克隆目的基因,构建原核表达载体p ET32a-To CVCP,在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中表达CP蛋白。结果表明:To CV CP基因(Gen Bank登录号:KT809400)全长774 bp,编码257个氨基酸,与Gen Bank中其他地区分离物核苷酸序列同源性为97.2%~99.6%,推导的氨基酸序列同源性为97.3%~100.0%。核苷酸序列保守位点占全部位点的91.3%,氨基酸序列保守位点占全部位点的88.3%,表明不同地理来源的番茄褪绿病毒的CP基因保守性较高。将To CV CP基因克隆到原核表达载体p ET-32a(+)上,并在体外条件下诱导表达出融合蛋白。SDS-PAGE分析表明,转p ET32a-To CVCP载体的大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株表达了分子量约33 k Da的重组蛋白。该重组蛋白在37℃,1.0 mmol/L IPTG、诱导6 h,表达量最大。     

鸭梨PbChiⅡ的克隆与表达分析

为明确几丁质酶在鸭梨抗病过程中的作用,以鸭梨为试材,提取总RNA,采用RT-PCR方法克隆几丁质酶基因PbChiⅡ,分析PbChiⅡ在梨黑星病菌诱导下的表达模式,构建原核表达载体pET30a-PbChiⅡ,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达PbChiⅡ蛋白,分析重组蛋白在非生物胁迫下的生长能力。结果表明:PbChiⅡ基因全长(基因登录号:KP876485)969bp,实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)分析显示,PbChiⅡ基因的表达受病原菌的调控,在供试的96h内,梨黑星病菌可诱导该基因表达,且表达量在48h达到最高。将PbChiⅡ基因成功克隆到原核表达载体pET30a上,SDS-PAGE分析表明,该重组蛋白在37℃,1.0mmol/LIPTG诱导2h,表达量最大。转pET30a-PbChiⅡ载体的大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达了分子量约35.53kDa的重组蛋白。诱导的蛋白可增强菌体在NaCl、CuCl_2、CdCl_2和ZnSO_4等非生物胁迫下的生长能力。为进一步探索PbChiⅡ基因的功能提供了基础资料。     

烟草花叶病毒南瓜分离物CP基因的克隆、序列分析及其原核表达

为从分子水平鉴定山东聊城的一表现明显花叶、黄化、蕨叶及果实畸形的南瓜病毒病的病原.采用RT-PCR的方法,用TMV外壳蛋白(CP)基因的特异引物,对该样品进行了检测,克隆到的基因序列进行分析,并使其在大肠杆菌中表达.结果表明,从该样品中扩增到了TMV的CP基因,说明该样品受到TMV的侵染,首次发现TMV自然侵染南瓜.对CP基因序列测定及分析表明,与GenBank上其他TMV分离物CP基因核苷酸序列的同源性为86.5%～99.0%,推导的氨基酸序列同源性为93.7%～99.4%.根据完整CP 基因核苷酸序列构建的系统进化树显示:32个TMV分离物可分为5个组,其中TMV-liaocheng与Nakron Pathom、Fujian、017等分离物属于Ⅳ组.TMV-liaocheng可能发生过重组.将TMV-liaocheng CP基因与原核表达载体pET-22b(+)连接,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS诱导表达出分子量约20 kDa的融合蛋白,并用Ni2+ -NTA His · Bind(R)树脂纯化,纯化后的蛋白可直接用于制备特异性的抗血清,为准确、快速地检测TMV奠定了基础.     

小麦TaNADP-ME1基因在大肠杆菌中的融合表达及可溶蛋白纯化

NADP依赖的苹果酸酶(NADP-ME)是C4光合途径关键酶。为了确定TaNADP-ME1基因的功能,利用重组技术将前期克隆到的TaNADP-ME1基因构建到原核表达载体pET32a,双酶切和PCR鉴定阳性克隆,CaCl2法转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导融合蛋白表达,Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化融合蛋白。成功获得了重组原核表达载体pETE1,TaNADP-ME1基因在BL21(DE3)pLysS中得到了融合表达,SDS-PAGE表明,融合蛋白分子量为80 kDa,并成功纯化到融合蛋白。     

香蕉果实凝集素基因的克隆及原核表达

【研究目的】植物凝集素具有重要的生理功能,通过原核表达香蕉凝集素基因(BanLec)并探讨其功能具有重要意义。【方法】提取了巴西蕉果肉总RNA,利用RT-PCR方法扩增BanLec cDNA 全长序列,并对该序列进行分析。将BanLec克隆至表达载体pET-30a,并将筛选到的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行诱导表达。【结果】克隆到的BanLec cDNA 序列为460bp,开放读码框为426bp,编码142个氨基酸。与其它已知的香蕉凝集素基因相比较,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为94%和93%以上。SDS-PAGE 分析结果表明,经IPTG诱导,BanLec基因以融合蛋白形式表达,相对分子量约为20kD。【结论】该研究为探讨香蕉凝集素的活性及生化功能等奠定基础。     

甘薯病毒G(SPVG)外壳蛋白基因的克隆、表达及其抗血清的制备

根据已报道的甘薯病毒G(Sweet Potato Virus G ,SPVG)外壳蛋白（CP）基因的核苷酸序列合成引物,利用RT-PCR方法克隆了SPVG河南分离物（SPVG-HN）的CP基因,序列分析表明,SPVG-HN CP基因由1065个核苷酸组成（GenBank登录号为DQ399861）,编码355个氨基酸残基。与GenBank中Egypt1(AJ515380)、LSU-1(AY178991)和LSU-3(AY178990)分离物的核苷酸序列相似性为98%左右,与中国广东分离物SPVG-CH（X76944）和SPVG-CH2（Z83314）的相似性分别为98.1%和85.5%。将CP基因克隆到原核表达载体pET-30a（+）上,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导, CP基因在大肠杆菌BL21(DE3) pLysS中得到了高效表达。以表达的蛋白为抗原,免疫家兔,制备了SPVG外壳蛋白的特异性抗血清。间接ELISA检测结果表明,制备的抗血清可用于田间甘薯样品的检测。     

瓜类黄化褪绿病毒上海分离物外壳蛋白的原核表达及其抗血清的制备

利用RT-PCR技术扩增得到瓜类黄化褪绿病毒(cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)上海市嘉定分离物的外壳蛋白(coat protein,cp)。序列分析结果表明,cp基因的核苷酸序列长度为753 bp,编码250个氨基酸,与已报道的CCYV其他分离物的cp核苷酸相似性均高于95%。将此基因克隆到原核表达载体pET32a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3)后IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blotting分析表明,CCYV cp在大肠杆菌中可表达出含有6-His标签的分子量约46 kDa的蛋白。纯化表达蛋白后免疫家兔制备抗血清,间接酶联免疫吸附测定(ID-ELISA)结果显示,制备的抗血清可用于检测田间感病样品中的CCYV。     

绵羊FecB基因的原核表达及其抗体制备

为了进一步研究FecB基因,利用PCR-RFLP技术筛选出FecB基因,PCR扩增FecB基因编码区序列1509bp,利用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ定向插入原核表达载体pET30a(+),构建原核表达载体pET30a(+)-FecB,诱导表达纯化重组蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体,WesternBlot检测重组蛋白的免疫活性,ELISA检测抗体效价。结果表明,成功的构建了绵羊FecB基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达目的蛋白,经过4次免疫后,获得多克隆抗体,ELISA方法检测小鼠抗体免疫效价达到1∶32000,纯化的蛋白具有免疫活性。为研究绵羊FecB基因蛋白的功能提供参考。     

鸭梨苹果茎痘病毒外壳蛋白基因克隆及原核表达

为了进一步明确苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)的分子变异及株系分化,制备相应特异性抗血清.本研究以库尔勒地区种植的感染ASPV的鸭梨(Y)枝条韧皮部为试材,采用RT-PCR技术扩增ASPV CP基因,克隆、测序,获得了鸭梨分离物外壳蛋白(ASVP CP-Y)基因,将该CP基因连...     

棉花GhEPSPS基因的原核表达载体的构建及诱导表达

目的在于构建棉花GhEPSPS基因的原核表达载体,并在宿主大肠杆菌中成功诱导表达。利用RT-PCR技术从陆地棉苏棉18中克隆获得GhEPSPS基因的开放阅读框序列,连接到p EASY-Blunt平端载体,构建获得重组载体p EASY-Blunt-GhEPSPS;以该重组载体为模板,PCR获得两端含有Eco RⅠ和XhoⅠ酶切位点的GhEPSPS基因CDS序列,通过这2个酶切位点插入到p ET32a载体,构建获得原核表达重组载体p ET32a-GhEPSPS,转化到宿主菌株BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测目的基因的表达情况。研究结果表明,成功克隆获得了棉花GhEPSPS基因的CDS序列,并成功构建了该基因的原核表达载体,目的基因能够在宿主菌中被诱导大量表达。该研究结果将为深入研究棉花EPSPS酶的结构、功能以及酶学特性提供重要的研究基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点的克隆及原核表达载体的构建

【研究目的】对猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点进行克隆和原核表达载体的构建。【方法】参考GenBank上公布的TGEV S基因A抗原位点序列,应用Primer6.0设计一对含酶切位点的引物,用于RT-PCR扩增A抗原位点目的片段,将扩增产物连接于paesy-T克隆载体上构建克隆载体,用EcoR I和Xhol I对表达载体PET-32a（+）和重组质粒进行酶切,将酶切产物亚克隆至PET-32a（+）多克隆位点上,连接、转化至BL21(DE3),构建A位点的原核表达载体,并对阳性重组质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。【结果】所扩增的目的片段的大小为534bp,与原核表达载体连接后,经核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其它猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,说明成功地构建了TGEV S 基因A抗原位点的原核表达载体。【结论】TGEV S 基因A抗原位点原核表达载体的成功构建,填补了中国国内单独针对此位点进行研究的空白,也为TGEV诊断方法的建立提供良好的技术基础。     

口蹄疫病毒AF72株 3D聚合酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用RT—PCR方法扩增口蹄疫病毒（FMDV）AF72株的3D聚合酶基因,并将其克隆至pGEM—Teasy载体,测序分析结果表明,AF72 3D聚合酶基因与GenBank中公布的其他4个参考序列均具有较高的同源性。将目的基因插入原核表达载体pET-30a（＋）中,构建了重组表达质粒pET-3D,鉴定后转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导,3D聚合酶基因在大肠杆菌中获得了正确表达,目的蛋白的分子量为46ku。Western blot检测结果显示,表达产物可以与抗A型FMDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。     

猪α1干扰素基因的克隆与原核表达

根据猪α1干扰素(pocine interferon-alpha1,poIFN-α1)的全基因序列(EU364896)设计合成1对特异引物,通过RT-PCR从三元杂交仔猪外周血淋巴细胞扩增出poIFN-α1全基因,将该基因克隆到pGEM-T载体,构建重组质粒pGEM-T-poIFN-α1,进行测序。以pGEM-T-poIFN-α1为模板,经PCR扩增带有酶切位点的poIFN-α1基因,将其定向克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建重组表达载体pGEX-6P-poIFNα1,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白诱导表达和鉴定,并确定蛋白最佳表达条件。序列分析表明,克隆的poIFN-α1基因全长546bp,编码181个氨基酸,前23个氨基酸组成信号肽,无糖基化位点。SDS-PAGE和Western blotting证实重组表达菌经IPTG诱导后,可表达相对分子质量约46ku的融合蛋白(GST-poIFN-α1)。当以1.0mmol/L的IPTG于37℃下诱导表达9h时,蛋白表达量最高。poIFN-α1基因的克隆与表达为进一步研究其抗病毒活性,开发病毒治疗和疫苗免疫增强用生物制剂奠定了基础。     

Bacillus subtilis FS321的α-淀粉酶基因的克隆与表达

耐热α-淀粉酶被广泛用于食品等诸多行业,本研究从中国北方高温堆肥分离的枯草芽孢杆菌FS321中克隆了一中度耐热α-淀粉酶基因,并实现在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达。通过PCR技术克隆Bacillus subtilis FS321的α-淀粉酶编码基因(BSA),该基因全长1980 bp。并构建重组表达质粒pET-28a/BSA,转化大肠杆菌E. coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测到大小约为73.0 kDa的重组融合蛋白,可溶性淀粉平板检测结果表明BSA在大肠杆菌中实现了有效表达。该重组α-淀粉酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为7.5。     

苹果果实中细胞质型苹果酸酶基因 （NADP-ME）的克隆与表达分析

【研究目的】从苹果果实中克隆细胞质型NADP-苹果酸酶（NADP-ME）基因，并且从基因转录水平上研究该基因与苹果果实酸度的关系。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆NADP-ME基因，半定量RT-PCR分析该基因在高酸和低酸个体不同发育时期果实中的转录情况，并进行原核表达分析。【结果】成功克隆了细胞质型NADP-ME基因的cDNA全长序列，命名为Mal-ME (GenBank注册号：DQ280492)；该基因表达一个约66kD的蛋白；半定量RT-PCR分析表明：不同发育时期的果实中Mal-ME的转录与苹果酸含量呈负相关，即随着Mal-ME转录水平的增强果实含酸量下降。【结论】成功从苹果果实中克隆了细胞质型Mal-ME基因，Mal-ME在果实发育过程中对苹果酸的积累起负调控作用。