马铃薯A病毒RT-LAMP检测方法的建立

马铃薯A病毒(potatovirusA,PVA)是一种侵染马铃薯的病毒,严重影响马铃薯的经济价值和产量,为有效防止该有害生物的传入和扩散,建立马铃薯A病毒RT-LAMP检测方法,根据PVA的外壳蛋白基因序列设计RT-LAMP反应的特异引物,通过实验成功建立了PVA的RT-LAMP特异性检测方法。该方法检测快速,36min即可检测到扩增曲线;特异性强,可有效区分同样侵染马铃薯的马铃薯A病毒(PVA)、马铃薯V病毒(PVV)、马铃薯Y病毒(PVY)以及同属的百合斑驳病毒(LMoV);灵敏度高,比普通RT-PCR灵敏度高10倍;并可通过肉眼观察浊度或颜色反应直接进行结果判断。该方法适用于现场PVA的快速检测。     

半巢式RT-Realtime PCR检测马铃薯Y病毒脉坏死株系

马铃薯Y病毒脉坏死株系(Potato virus Y,PVYn)是马铃薯中一个非常重要的病毒病害.本文根据PVYn基因组中RNA依赖的RNA聚合酶基因序列保守区域,设计合成了3条巢式PCR引物和1条TaqMAN荧光探针,建立了半巢式RT-Realtime PCR检测PVYn的新方法.该方法采用E.Z.N.ATM陕速提取植物总RNA,并有机地结合了巢式PCR和TaqMAN探针检测技术.第二步半巢式RT-Realtime PCR既是对第一步信号的进一步放大,也是对第一步PCR产物的确认,因此,检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、Real time PCR等方法高.实验结果表明,该方法检测灵敏度可达4fg/μL植物总RNA.     

中国农科院烟草研究所在烟草马铃薯Y病毒抗性基因挖掘方面取得新进展

正日前,从中国农业科学院烟草研究所获悉,烟草马铃薯Y病毒病抗性基因挖掘研究取得新进展,揭示了烟草响应马铃薯Y病毒的生物学过程,锁定了6个重要抗性基因。烟草马铃薯Y病毒病是由马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)引起的一种烟草系统性侵染病害,该病毒是马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的典型成员,在生产中对烟草品质造成严重影响。近年来,     

4种病毒抑制剂对昭通烟草番茄斑萎病毒病和马铃薯Y病毒病的防治效果

番茄斑萎病毒病(Tomato spotted wilt virus, TSWV)和马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是云南烟草生产上的主要病毒病,本研究旨在筛选有效的药剂防控烟草番茄斑萎病毒病和马铃薯Y病毒病,从而减少烟草经济损失。通过小区试验,分别研究了1%香菇多糖水剂、3%超敏蛋白微粒剂、5%氨基寡糖素水剂和2%嘧肽霉素水剂对田间烟草番茄斑萎病毒病和马铃薯Y病毒病的防治效果。结果表明：试验所选的4种病毒抑制剂对烟草番茄斑萎病毒病和马铃薯Y病毒病均具有一定的防控作用,1%香菇多糖、3%超敏蛋白、5%氨基寡糖素和2%嘧肽霉素对烟草TSWV的防治效果分别为：31.11%~39.90%、54.34%~59.91%、8.69%~38.21%和22.75%~43.32%,4种药剂对烟草PVY的防治效果分别为55.08%~71.06%、68.10%~82.24%、37.76%~55.36%和58.07%~68.86%,其中,3%超敏蛋白的防效最好,其烟草TSWV和PVY防治效果分别高于50%和60%,其次是2%嘧肽霉素,对烟草TSWV和PVY防治效果分别高于22%和58%。防治烟草番茄斑萎病毒病和马铃薯Y病毒病以3%超敏蛋白微粒剂的防治效果最佳,其次是2%嘧肽霉素水剂。     

应用纳米磁珠实时荧光PCR检测非洲木薯花叶病毒

建立非洲木薯花叶病毒(African cassava mosaic virus, ACMV)灵敏快速的纳米磁珠实时荧光PCR检测技术,防止其传入中国。采用TaqMan探针结合纳米磁珠(magnetic nanoparticles, MNPs)技术,以外壳蛋白基因为目标基因,通过特异性及灵敏度试验建立MNP荧光PCR检测方法。成功建立了非洲木薯花叶病毒(ACMV)的MNP荧光PCR检测方法;该方法检测阈值约为13 pg DNA,比普通PCR及ELISA方法灵敏度高25倍;该方法具有良好的特异性,能够有效区分双生病毒属的ACMV、棉花曲叶病毒(CLCuV)、番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)及番茄严重曲叶病毒(ToSLCV)。MNP荧光PCR方法能够快速灵敏的检测茎叶样品中的ACMV,无需任何PCR后处理,交叉污染风险小,适于口岸检验检疫。     

半巢式RT-Reahime PCR检测马铃薯Y病毒脉坏死株系

马铃薯Y病毒脉坏死株系（Potato virus Y，PVY^n）是马铃薯中一个非常重要的病毒病害。本文根据PVY^n基因组中RNA依赖的RNA聚合酶基因序列保守区域，设计合成了3条巢式PCR引物和1条TaqMAN荧光探针，建立了半巢式RT—RealtimePCR检测PVY^n的新方法。该方法采用E．Z．N．A^TM．陕速提取植物总RNA，并有机地结合了巢式PCR和TaqMAN探针检测技术。第二步半巢式RT-Realtime PCR既是对第一步信号的进一步放大，也是对第一步PCR产物的确认，因此，检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、Realtime PCR等方法高。实验结果表明，该方法检测灵敏度可达4fg／μL植物总RNA。     

鸡传染性贫血病毒、网状内皮增生症病毒与禽白血病病毒基因芯片检测方法的建立

基于多重PCR技术,建立鸡传染性贫血病病毒(CAV)、禽网状内皮增生症病毒(REV)、禽白血病病毒禽(ALV)A、C、D亚群的基因芯检测方法。根据NCBI收录的鸡传染性贫血病毒(CIAV)、禽网状内皮增生症病毒(REV)与禽白血病病毒(ALV)A、C、D亚群参考毒株的序列,设计合成特异性扩增引物及探针,将下游引物进行Cy3荧光标记,制备基因芯片;分别提取几种病毒的基因组DNA,进行PCR扩增后与探针进行杂交,荧光检测仪扫描并分析结果。结果表明:制备的芯片能够同时检测CIAV、REV与ALV A、C、D亚群,该方法对病毒的最低检测限为106copies/m L,特异性试验结果表明,该方法与NDV、MDV和IBDV均无交叉反应,可快速鉴别ALV、REV、CIAV。为今后在临床应用中快速鉴别诊断CIAV、REV与ALV A、C、D亚群提供了可行性。     

应用纳米磁珠荧光PCR检测棉花曲叶病毒

 为了提供快速灵敏检测棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl virus, CLCuV)的技术以防止其传播扩散,本研究根据CLCuV外壳蛋白基因（Coat protein, CP）保守序列设计了引物和TaqMan探针,并结合纳米磁珠(Magnetic nanoparticles, MNPs)建立了该病毒的MNP实时荧光PCR (Real-time PCR)检测方法。该方法检测阈值约为525 fg·μL^-1 DNA。通过对CLCuV、非洲木薯花叶病毒、烟草线条病毒、黄瓜花叶病毒及番茄斑萎病毒的检测表明,该方法具有良好的特异性;同时该方法无需任何PCR后处理,交叉污染风险小。本方法可用于CLCuV的快速检测。     

番茄环斑病毒单克隆抗体的制备及检测

将纯化的番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)制剂免疫BALB/c小鼠,末次免疫后第3天取其脾细胞与SP2/0细胞融合,采用选择性培养基、有限稀释法克隆和间接ELISA方法进行筛选,成功获得了2株分泌ToRSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株并分别命名为1H8、1D4.用间接ELISA方法对所获得的2个杂交瘤细胞株进行亚型鉴定均为IgG1亚类.间接ELISA效价测定结果1H8为1:105,1D4为1:106.TAS-ELISA实验结果表明此2株杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体均能与本研究室保存的从德国引进的番茄环斑病毒分离物、从美国ATCC引进的番茄环斑病毒分离物PV-100、PV-174、PV-239发生特异性反应,而不与同属其它3种病毒:烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)、南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus,ArMV)、马铃薯黑环斑病毒(Potato black ringspot virus,PBRSV)发生反应.     

一步法RT-PCR和两步法RT-PCR对马铃薯病毒诊断研究的比较

本研究采用试剂盒和Total试剂两种方法从马铃薯叶片和茎秆中提取总RNA,同时设计了一步法RT-PCR和两步法RT-PCR的反应体系,依据马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒以及马铃薯卷叶病毒的基因组RNA保守序列设计特异性引物对,并运用两种RT-PCR反应体系对染病的马铃薯进行病毒检测,结果与报道的这五种马铃薯病毒核苷酸序列进行BLAST比对, 表明扩增的五种马铃薯病毒靶带的序列与靶序列完全一致。两种诊断方法对马铃薯病毒核酸进行浓度检测,结果证明,两步法RT-PCR具有较高灵敏性。但这两种方法均可快速、简便、有效地诊断马铃薯病毒。     

甘薯病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为了快速进行甘薯病毒田间检测和脱毒苗诊断,该研究建立了一个能够同时检测SPCSV、SPLV和SPFMV这3种病毒的多重RT-PCR检测方法。根据GenBank公示的甘薯病毒基因序列来设计3种甘薯病毒的引物,分别对模板浓度、退火温度、Mg2+浓度和循环次数进行优化,同时对模板浓度进行10倍梯度稀释,检测多重RT-PCR灵敏度。结果显示,模板浓度为19 ng/μL、退火温度为52℃、Mg2+浓度为0 mmol/L、循环次数为40次时,可以同时扩增出大小为276 bp、570 bp、425 bp三种病毒的基因片段,多重RT-PCR检测灵敏度为10-4,单一RT-PCR检测灵敏度为10-3,多重RT-PCR检测灵敏度是单一RT-PCR的10倍。该研究使用优化的多重RT-PCR检测技术可获得稳定、灵敏、准确、高效地和同时地检测田间复合侵染的3种甘薯病毒。     

双重检测马铃薯X和Y病毒试纸条制备技术研究

为了实现在马铃薯种薯生产田现场同时快速检测马铃薯X（PVX）和Y病毒（PVY）,利用胶体金标记和免疫层析技术研制了PVX-PVY双重检测试纸条。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,在波长526nm处有最大吸收值,金颗粒直径约25nm。同时标记PVX和PVY兔多克隆抗体,将抗体标记物喷射于玻璃纤维纸上,作为金标垫。将PVX和PVY抗体分别划线于硝酸纤维素膜上作为检测线,将羊抗兔抗体划线于硝酸纤维素膜上作为质控线,制备胶体金试纸条。结果表明,研制的双重试纸条能够在2min之内同时检出PVX和PVY。PVX病汁液检测稀释限度可达10⁶倍（W/V）,PVY可达10⁵倍（W/V）,其中对PVX检测更灵敏。用其他4种常见病毒（PVS、PLRV、PVA和PVM）检测,未出现交叉反应。在田间采集马铃薯叶片,分别利用试纸条与DAS-ELISA检测,结果一致性非常高。由此可知,该试纸条具有操作简便、反应快捷的特点,特别适用于田间及口岸一线对于马铃薯X和Y病毒的同时检测。     

菜豆荚斑驳病毒免疫捕获一步RT-PCR检测

【研究目的】建立快速、准确、简便的检测大豆种子上菜豆荚斑驳病毒的免疫捕获一步RT-PCR方法（一步IC-RT-PCR）。【方法】采用抗原捕获和一步RT-PCR相结合的方法,并通过反应条件优化,确定一步IC-RT-PCR的反应程序,同时对该方法的特异性及实际检测效果进行验证。【结果】成功建立了一步IC-RT-PCR检测菜豆荚斑驳病毒方法,能够从感染菜豆荚斑驳病毒的大豆种子上扩增出预期大小的特异性片段,而对其他病毒及健康大豆无特异性反应;应用该方法对不同产地大豆种子样品进行检测,结果从来自美国的大豆样品中检出菜豆荚斑驳病毒,检出率为50%。【结论】一步IC-RT-PCR方法可以快速、准确地检测大豆种子上的菜豆荚斑驳病毒,适用于口岸检验检疫。     

RT-PCR快速检测3种烟草病毒技术

为了快速提取植物叶片的总RNA,并对烟草病毒进行检测,对提取及检测方法进行了研究。结果表明：以黄瓜叶片、白肋烟叶片为试材,用TRIzol试剂盒在1 h内提取到纯度高、完整性好的总RNA。设计烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒的特异性引物,RT-PCR检测,从感病叶片中分别扩增出313,326,392 bp的目的片断,而健康叶片中无此扩增带。构建这3种病毒重组质粒,对核苷酸序列与GeneBank中报道的进行比较,同源性分别为99.36%,97.55%,98.21%。用这种方法快速、可靠,为烟草病毒的检测提供科学依据。     

马铃薯A病毒重组CP多克隆抗体的制备及其在DAS-ELISA检测中的应用

利用重组CP作抗原制备出马铃薯A病毒的多克隆抗体,并将其用于DAS-ELISA检测。以p ET22b(+)为起始载体,构建了PVA-CP基因的原核表达载体p ET22b-ACP,重组菌BL21(p ET22b-ACP)经IPTG诱导表达出了分子量为30 k Da的特异性重组CP。利用高纯度重组CP为抗原免疫家兔,制备出了效价为1∶512 k的抗血清。以PVA重组CP为抗原,用间接ELISA与直接ELISA分别测定重组CP纯化抗体(Ig G)及其碱性磷酸酶标记物(Ig G-AP)的活性,用DAS-ELISA测定2种抗体的活性,目测及OD值测定结果表明3种ELISA测定反应都呈阳性。以PVA病毒阳性标准物为抗原,在上述3种ELISA测定中也呈阳性反应,重组CP多克隆抗体及其酶标抗体与PVA有较强的反应信号。利用重组CP制备的多克隆抗体及其酶标抗体达到了马铃薯A病毒DAS-ELISA检测的要求。     

甘薯病毒病检测技术研究进展

简要概述了侵染甘薯的羽状斑驳病毒(SPFMV)、潜隐病毒(SPLV)、轻斑驳病毒(SPFMMV)、退绿矮缩病毒(SPCSV)、脉花叶病毒(SPVMV)等10余种病毒种类;着重综述了检测甘薯病毒常用的生物学、血清学、分子生物学等几种主要检测技术的原理和特点。生物学方法是依据病毒侵染后在甘薯或指示植物上的外观症状进行识别,但检测速度慢,易受季节限制;血清学技术是利用病毒外壳蛋白的抗原性,据特异性的抗体抗原免疫学反应检测病毒存在,但制备抗血清需时间长,对含量少和无蛋白外壳的病毒无法检测;分子生物学方法是以核酸为基础,通过检测病毒核酸来证实病毒的存在,该技术具有灵敏度高、特异性强、适应范围广等特点。     

陕西省甘薯病毒病害(SPVD)发生现状及种类鉴定

为明确陕西省甘薯病毒病害发生范围及严重程度等,以陕西省西安、咸阳、渭南、榆林、商洛、安康和宝鸡等7市采集到的98个疑似甘薯病毒病害样品,用多重RT-PCR检测方法对甘薯病毒病害(Sweet potato virus disease, SPVD)进行快速检测。结果显示,样品病毒总检出率为52.04%,38个样品检测到甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV),占38.78%;25个样品检测到甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV),占25.52%;检测到病毒的51个样品中,有38个样品为单一病毒侵染,13个样品为两种病毒复合侵染,即SPVD检出率为13.27%;除咸阳市没有检出SPFMVCH2株系外,其余6个地市均检测到SPCSV及SPFMV-CH和CH2株系。46个育种材料中,2个材料检测到SPCSV,检出率为4.35%。说明SPVD已在陕西省普遍发生,且发病情况较为严重。