棉铃虫对Bt杀虫蛋白抗性测定方法的研究

对饲料混合法 ,体重抑制率法 ,浸叶接虫法进行比较研究 ,结果表明 ,饲料混合法比较稳定 ,比较适宜作为抗性测定的方法。用饲料混合法测定比较不同龄期幼虫的测定结果 ,确定 2龄作供试幼虫为宜。比较不同处理天数下的生测结果 ,确定 Bt粉剂对 2龄幼虫的适宜处理时间为 5d,Cry1Ac为 14d。用改进稀饲料隔离饲养供试幼虫的方法后 ,得到理想的生测数据 ,生测时间延长到 14d,对照死亡率也能控制在 2 0 %以下。从我们 1998年对棉铃虫的抗性监测结果说明 ,尽管田间棉铃虫对 Bt ICP未达抗性水平 ,但对 Cry1Ac型蛋白敏感性已有降低 ,值得引起重视。     

新疆地区棉铃虫自然种群对Bt棉的抗性频率监测

为监测新疆棉区棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)田间种群对Bt棉的抗性频率,在2010年和2011年分别采集石河子和喀什地区莎车的棉铃虫单雌系,以Cry1Ac毒蛋白作为人工饲料,用单雌系F1/F2代法进行棉铃虫种群抗性个体检测。2010年筛选了123个石河子的棉铃虫单雌系,2 011年筛选了152个莎车的棉铃虫单雌系。两地的棉铃虫种群均没有筛选到相对平均发育级别≥0.8的抗Bt棉个体,估算出石河子和莎车的棉铃虫种群的抗性频率低于10-3。莎车F2单雌系与其对应的F1单雌系相对平均发育级别有明显差异。研究表明新疆石河子地区田间棉铃虫种群仍保持敏感状态,喀什地区田间棉铃虫种群对Bt棉的耐受性增高。     

棉铃虫Bt抗性种群的RAPD-PCR初步分析

经室内筛选获得了棉铃虫对Bt杀虫剂、Bt毒蛋白和转Bt基因棉的抗性种群。利用RAPD技术 ,成功地扩增得到 105条多态性条带 ,经过聚类分析发现 ,棉铃虫对Bt产生抗性后在基因水平发生了变异。RAPD技术不仅可以用来鉴定棉铃虫对Bt是否产生抗性 ,而且可以区分不同的Bt抗性种群     

棉铃虫Bt毒素受体蛋白—氨肽酶N与抗性的关系

随着我国转基因棉花种植面积的日益增加,主要目标害虫—棉铃虫的抗性问题越来越被大家所关注。氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)是一类昆虫中肠内Bt毒素的受体蛋白,其结构、结合位点的改变或基因突变可能是昆虫对Bt毒素产生抗性的重要原因。本文通过分析Bt毒素的作用方式,从生化、生理、分子生物学等方面探讨了棉铃虫Bt毒素受体蛋白APN与抗性的关系。     

棉铃虫围食膜中Bt抗性相关蛋白的分离与鉴定

棉铃虫是世界性的重要农业害虫。围食膜作为昆虫抵御病原微生物入侵及有害物质的第一道天然保护性屏障,其上可能存在与Bt抗性相关的受体蛋白。本研究以Bt Cry1Ac抗性和敏感品系的棉铃虫围食膜为对象,采用NuPAGE电泳技术、配体杂交、质谱鉴定和生物信息学分析等技术,测定了围食膜蛋白含量,鉴定了蛋白质的组成及与Bt Cry1Ac毒素的结合能力。结果表明敏感品系围食膜中蛋白含量为22.19%,抗性品系围食膜中蛋白含量为26.99%。抗、感品系棉铃虫围食膜上存在与Cry1Ac毒素结合的6个差异蛋白,推测其中棉铃虫羧酸酯酶蛋白和血影蛋白是2个有意义的抗性相关蛋白,2个新蛋白可能参与Bt抗性。研究证明棉铃虫围食膜上存在Bt结合蛋白且与抗性相关,为进一步明确Bt抗性机制、制定合理的Bt抗性治理策略提供了理论依据。     

种子生测法鉴定转Bt基因棉抗虫性

通过室内应用单粒种子生测法鉴定转Bt基因棉抗虫性,明确了单粒棉种室内生测鉴定转Bt基因棉抗虫性的最佳生测条件。将转Bt基因棉种子25℃萌动72 h后匀浆,与0.45 g饲料混匀,以2日龄棉铃虫幼虫为试虫,测定其死亡率。建立了相应的抗性标准:棉铃虫幼虫校正死亡率小于25％为中抗,处于25％-50％为抗,50％-65％为高抗,大于65％为特高抗。准确性验证表明,种子生测法同叶片生测法的结果相符,具有较好的准确性。     

Bt抗性和敏感棉铃虫钙黏蛋白及氨肽酶N1表达量的比较

棉铃虫体内的钙黏蛋白（CAD）和氨肽酶N1（APN1）是Bt的主要作用靶标,两种受体蛋白的变化也是棉铃虫对Bt产生抗性的主要原因。本文利用实时荧光定量PCR技术比较了Bt抗性和敏感棉铃虫CAD和APN1的表达量变化,分析受体蛋白表达量变化与抗性的关系。结果表明,与敏感品系相比,抗性品系棉铃虫CAD和APN1的表达量明显降低,1、2龄幼虫的差异达到极显著。在敏感品系中,CAD和APN1的表达量随龄期的增加呈现“V”字形变化,1、2龄幼虫的表达量最高,3、4龄时显著降低,到5龄时表达量又有所增加。抗性品系中CAD和APN1的表达量提前降低,与表达量最高的1龄幼虫相比,2、3龄时表达量显著降低,到4、5龄时又略有回升。说明棉铃虫中肠钙黏蛋白、APN1表达量的下降与抗性相关,且不同龄期棉铃虫幼虫表达量不同。     

我国棉铃虫对Bt蛋白Cry1Ac抗性现状及分子机制研究进展

棉铃虫Helicoverpa armigera是一种全球性的重要农业害虫,主要为害棉花、玉米和大豆等作物。长期种植单价Bt棉花（表达Cry1Ac蛋白）会使棉铃虫田间种群承受单一、持续的选择压力,必然会导致棉铃虫对Cry1Ac的抗性发生演化。该文概述我国棉铃虫田间种群对Cry1Ac的抗性现状、自然庇护所对棉铃虫Cry1Ac抗性演化的延缓作用以及棉铃虫对Cry1Ac抗性的遗传多样性,并对今后我国关于棉铃虫Bt抗性的治理对策进行了展望。     

新疆棉铃虫种群对三种化学药剂的抗性

棉铃虫Helicoverpa armigera是经济作物和粮食作物主要害虫之一。为有效防治棉铃虫,新疆维吾尔自治区(简称新疆)大面积种植Bt棉,同时采用化学药剂进行防治,但是化学药剂的大量长期使用势必使棉铃虫产生抗性。武万峰等(2010)研究结果显示新疆棉铃虫种群已对三氟氯氰菊酯和甲维盐表现低水平抗性。为全面掌握新疆棉铃虫种群对这2种药剂及对氯虫苯甲酰胺新型化学药剂的抗性水平,本研究于2015-2018年自新疆阿克苏、博乐和哈密市等5个市采集棉铃虫,监测该害虫对这3种化学药剂的抗性,以期为Bt棉有效利用和化学药剂的合理施用提供理论基础。     

重组增效蛋白对Bt和氯氰菊酯防治棉铃虫的增效作用

前期在大肠杆菌中表达得到具有显著生物活性的含粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白C端818个氨基酸的融合蛋白P96。以毒饲料法研究P96对苏云金芽孢杆菌和氯氰菊酯杀棉铃虫敏感、抗性品系的增效作用。结果表明：P96对Bt杀棉铃虫敏感、低抗、中抗品系的增效比分别为3．34、4．72和9．82；对氯氰菊酯杀棉铃虫敏感、低抗、中抗品系的增效比分别为2．53、3．38和6．24。随棉铃虫抗性升高，P96的增效作用愈为明显。单对汰选是快速选育棉铃虫抗Bt品系的有效方法。     

Cry1Ac和Cry2Ab蛋白对大草蛉生长发育及酶活力的影响

为明确转Cry1Ac和Cry2Ab基因棉花对大草蛉的影响,运用Bt蛋白与人工饲料混合的方法,以大于转基因棉花叶片中蛋白含量20倍的剂量饲喂大草蛉初孵幼虫,初步研究了Cry1Ac和Cry2Ab对大草蛉生物学参数和消化酶、解毒酶活性的影响。结果表明：取食含Bt蛋白饲料的大草蛉幼虫的发育历期、体重、蛹重、成虫体重、羽化率等生物学参数与对照相比均没有显著差异;在大草蛉幼虫体内可以检测到含量较高的Cry1Ac和Cry2Ab蛋白,分别为974.92~1 282.39 ng/g鲜重和5 592.62~6 082.92 ng/g鲜重,而在大草蛉成虫体内检测到的Cry1Ac和Cry2Ab蛋白含量非常低,分别为0.29~0.39 ng/g鲜重和50.34~56.71 ng/g鲜重;取食含Bt蛋白的饲料对大草蛉幼虫的类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶、氨肽酶和谷胱甘肽-S-转移酶活性有一定的影响,但对大草蛉成虫影响与对照差异不显著。表明大草蛉取食含Bt蛋白的人工饲料后,虽然体内可以检测到一定含量的Bt蛋白,但对大草蛉的生长发育并没有显著的直接不利影响。     

转Bt基因植物对不同抗性棉铃虫的生长抑制作用

采用转Bt基因的烟草和棉花 ,对经转Bt单基因、转Bt与CpTI双基因烟草汰选 1 8代和常规烟草处理的棉铃虫种群进行生长抑制作用的比较测定。结果表明 ,转Bt烟草对以汰选后的抗Bt单基因汰选棉铃虫种群的体重抑制作用显著低于转双基因烟草汰选种群和对照种群 ;转Bt棉花对单基因种群的杀虫活性、体重、龄期发育以及化蛹率的抑制作用亦显著低于双基因种群和对照种群     

转 Bt基因抗虫棉对棉大卷叶螟抗性的研究

:转Bt基因抗虫棉对棉铃虫有很好的抗性,对棉大卷叶螟(SyleptaderogataFabricius)的抗性未见报道。作者研究表明,棉大卷叶螟在棉田为聚集分布型,低龄幼虫有集中为害习性;抗虫棉对其有很好的抗性,平均虫株率为2.2%,较常规棉中棉所12降低96.6%;百株虫量为133.8头,较常规棉降低88.4%。     

转Bt cry1Ab基因水稻花粉对中华 草蛉成虫产卵和寿命的影响

用ELISA法测定了转Bt基因水稻克螟稻1号(KMD1)和克螟稻2号(KMD2)花粉中Cry1Ab含量.将转Bt基因水稻和其亲本对照秀水11(XS11)花粉加入到草蛉人工干粉饲料中,评价了对中华草蛉Chrysoperla sinica Tjeder成虫产卵和寿命等参数的影响.结果显示,转Bt基因水稻"克螟稻"花粉中表达cry1Ab杀虫蛋白,且表达量较高.分别用含5%KMD1、KMD2和XS11花粉的人工饲料饲喂中华草蛉初羽化成虫,发现两类Bt水稻花粉对该虫产卵前期、产卵量、产卵天数和成虫寿命等参数均无显著影响.人工饲料中水稻花粉的比例上升至20%和80%后,KMD1、KMD2和XS11花粉饲料处理中的草蛉均出现产卵前期延长、产卵量减少和产卵天数缩短的趋势,但在同一花粉比例下这些参数在3个花粉饲料处理间均无显著差异.结果表明,Bt水稻花粉中cry1Ab杀虫蛋白对该草蛉成虫产卵和寿命等参数无显著的负面影响.     

Interaction of Cry1Ac toxin (Bacillus thuringiensis) and proteinase inhibitors on the growth, development, and midgut proteinase activities of the bollworm, Helicoverpa zea

Potential resistance development to Bt cotton in certain lepidopterans has prompted research to develop strategies that will preserve this environmental-friendly biotechnology. Proteinase inhibitors are potential candidates for enhancing Bt toxicity against lepidopteran pests and for expanding the spectrum of control for other insects. Interactions of Bt toxin from Bacillus thuringiensis and proteinase inhibitors were investigated by monitoring growth, development, and gut proteinase activities of the bollworm, Helicoverpa zea. Several proteinase inhibitors were combined with Bt protoxin Cry1Ac in artificial diet and fed to newly molted 3rd-instar bollworm larvae to determine effects on larval body weight and length, pupation progress, and mortality rate. Major midgut proteinase activities, including caseinase, tryptic, and chymotrypsin activities, were examined after treatment. A concentration of Bt at a level causing minimal mortality (<10%), was mixed with the following proteinase inhibitors: benzamidine, phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), and N-α-tosyl-l-lysine chloromethyl ketone (TLCK). When compared with controls, the synergistic effect of Bt toxin and proteinase inhibitors caused significant decreases in mean larval weight and length over time. Midgut samples tested against the substrates azocasein, α-benzoyl-dl-arginine-p-nitroanilide (BApNA), and N-succinyl-alanine-alanine-proline-phenylalanine-p-nitroanilide (SAAPFpNA) showed significant decreases in the protease activity of larvae fed Bt plus inhibitor versus control. Interaction of Bt and proteinase inhibitors significantly retarded larval growth and resulted in developmental delay and up to 20% mortality.     

The role of phytoalexins in resistance to fusarium wilt in pigeon pea (Cajanus cajan)

Mechanisms of resistance to fusarium wilt (Fusarium udum) were investigated in pigeon pea cultivars from Malawi. Wilt-susceptible (Malawi local) and wilt resistant (ICP 9145) plants were stem-inoculated with a spore suspension containing 2·10⁶ conidia/ml of the pathogen. Occlusion of a small proportion of infected vessels was observed, but the resistant reaction appeared to depend mainly on rapid phytoalexin synthesis. Four fungitoxic isoflavonoid phytoalexins—hydroxygenistein, genistein, cajanin and cajanol-were isolated from plants 15 days after inoculation. Cajanol was identified as the main antifungal compound. The concentration of cajanol was 329·4 μg/g in the resistant cultivar as against 88·6 μg/g in the susceptible cultivar 15 days after inoculation. Crude extract from the resistant plants sampled at 24 h after inoculation contained 34·8 μg ml of cajanol. The LD₅₀ value of cajanol for spore germination was determined as 35μg/ml. The cajanol content of fungus-infected ICP 9145 10 days after inoculation totally inhibited conidial germination of F. udum.     

棉铃虫对Cry1Ac抗性的稳定性及其对适合度的影响

为明确棉铃虫Helicoverpa armigera（Hübner）对苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis（Bt）Cry1Ac毒蛋白抗性的稳定性及其适合度变化,利用生物测定的方法研究了Cry1Ac抗性品系棉铃虫转到正常饲料饲养后的抗性衰退及再次筛选后抗性的恢复情况,并比较了敏感、抗性和抗性衰退后各品系间的适合度差异。在失去选择压的情况下,高抗品系棉铃虫对Cry1Ac的抗性迅速衰退,经过4代后抗性水平由最初的3626.67倍下降到1436.67倍;到第12代时抗性水平已低于10倍,随后品系保持较稳定的低抗水平;当重新进行抗性再筛选时,其抗性水平可快速恢复,抗性倍数快速回升,5代后恢复到1123.33倍。与敏感品系相比,高抗棉铃虫品系的适合度明显降低,相对适合度仅为0.33,但转到正常饲料连续饲养14代后,棉铃虫适合度明显上升,相对适合度为0.87,主要表现为卵孵化率和幼虫存活率等显著提高。     

荧光增白剂对Cry1Ac抗感棉铃虫围食膜的影响及增效作用

为了提高Bt的杀虫活性,运用扫描电镜、SDS-PAGE电泳和生物测定技术,研究了荧光增白剂FB28对棉铃虫Cry1Ac抗性和敏感品系围食膜的影响及对Cry1Ac杀虫蛋白的增效作用。结果表明,正常棉铃虫围食膜表面光滑致密,没有空洞和缝隙。用含1%FB28的人工饲料饲喂刚蜕皮的5龄棉铃虫幼虫2 h后,抗感棉铃虫围食膜表面均出现许多空洞,且敏感棉铃虫的空洞明显大于抗性棉铃虫;随着处理时间的延长,围食膜上的空洞逐渐变小,13 h后恢复正常。用1%FB28离体或活体处理抗、感品系棉铃虫,均可造成围食膜蛋白被降解。用1%FB28与Cry1Ac杀虫蛋白混合饲喂抗、感棉铃虫初孵幼虫,可明显提高棉铃虫的死亡率,且对抗性品系的增效作用明显大于敏感品系,对敏感和抗性品系棉铃虫的增效比分别为2.23和9.34;1%FB28还可以明显增加对抗、感品系3龄棉铃虫幼虫的生长抑制作用。