基于非理性设计的肺炎克雷伯氏杆菌甘油脱水酶的分子定向进化

1,3-丙二醇是一种具有广泛应用前景和巨大市场潜力的平台化合物。在生物体转化甘油合成1,3-丙二醇的代谢途径中,甘油脱水酶是代谢途径的限速酶,然而自然界中的甘油脱水酶却存在着诸多的不足。本研究采用易错PCR技术对来源于肺炎克雷伯氏杆菌的甘油脱水酶进行非理性设计的分子定向进化,通过高通量筛选方法筛选获得了一个酶学性质得到了改善的突变酶γ-F97G。当以甘油作为酶催化的底物时,突变酶的酶比活力为（583.8±49.4）U/mg,相比较野生型的酶比活力提高了约94%;当以1,2-丙二醇作为酶催化底物时,突变酶的酶比活力为（147.9±5.5）U/mg,相比较野生型的酶比活力提高了约72%。经分析酶蛋白的三维结构后发现酶蛋白发生突变的位点属于远距离突变位点,实验结果表明远距离突变有时同样是一条优化和改善酶的酶学性质的好途径。     

大黄欧文氏菌蔗糖异构酶控制产物特异性基序的定点突变

大黄欧文氏菌（Erwinia rhapontici）蔗糖异构酶催化蔗糖异构为异麦芽酮糖和海藻酮糖,具有一个可能控制产物特异性的325RLDRD329基序。本研究以定点突变方法对该基序的带电荷氨基酸进行突变,共构建R325D、R328A、R328D、R328Q和D329N5个突变体。通过对突变体的酶学特性及突变体转化蔗糖的产物组成分析,结果显示所构建突变体的Km值上升约2～5倍,比活力下降至野生型SI比活力的11.8%～25.3%。HPLC分析显示Arg325和Arg328分别突变为Asp,导致产物中异麦芽酮糖/海藻酮糖的比例从6.93分别降至0.96和2.92,并伴随一个未知寡糖出现。Arg328突变为Ala和Gln同样导致反应产物中海藻酮糖比例上升,异麦芽酮糖比例下降。但是突变体D329N反应产物比例没有变化。以上结果表明325RLDRD329基序对大黄欧文氏菌蔗糖异构酶的酶活具有重要作用,并对酶的产物特异性产生影响。本研究结果将为该酶的作用机理研究奠定基础。     

基于易错PCR技术的中性内切葡聚糖酶基因的定向进化

纤维素酶的工业应用一直受酶活性低,成本高的限制,为了提高中性内切葡聚糖酶的活性,本研究利用易错PCR技术对来自枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis )C-36的内切葡聚糖酶基因进行定向进化研究,在酶分子水平上改造内切葡聚糖酶分子.实验获得了最佳突变株b-15和b-28,其内切葡聚糖酶活力比亲本酶分别提高了2.1和3.6倍.序列分析表明:突变体b-15有6个碱基发生了突变,分别是A360G、T402A、A419T、T648A、A1208G和A1397T,导致4个氨基酸突变,分别是N134K、Q140L、N403S和Q466L;b-28只有1个碱基发生了突变,导致了398位Lys突变为Arg.通过SWISS-MODEL服务器模拟酶的三维结构,分析表明,b-15改变的4个氨基酸分别位于催化结构域的第4和第5个α螺旋之间的转角和结合结构域的第5个β折叠及第9和第10个β折叠之间的转角;b-28的突变位于结合结构域的第4个β折叠.同时,对获得的两株突变株b-15和b-28用正交试验优化产酶条件,优化后的酶活分别达到4.542和5.136 U/mL,是优化前的2.2和1.5倍.实验获得了酶活性提高的内切葡聚糖酶菌株,为进一步在分子水平研究内切葡聚糖酶的功能和其应用打下了基础,也为高酶活酶分子在其他高表达系统的表达提供了基础材料.     

利用等位基因特异性PCR技术检测番茄高色素基因hp1和hp2的SNP

摘要：番茄高色素基因hp1和hp2突变体与野生型基因相比均发生了单碱基的点突变,常规PCR技术很难把它们区分开。本试验对碱基错配类型和位置与特异性PCR的关系进行了研究。结果表明：引入TA-TG双碱基错配的引物,退火温度在49.3+0.1℃时能把hp1基因的突变位点和野生型的对应位点区分开来。引入T-C碱基错配的引物,退火温度在53.5+0.1℃时能把hp2基因的突变位点和野生型的对应位点区分开来。错配碱基在引物3′端的位置对PCR的特异性影响不大。     

利用CAPS标记推测花生品种(系)FAD2位点基因型的研究

以5个高油酸含量花生品种(系)和2个普通油酸含量花生品种为试材,利用CAPS标记对这些品种(系)的FAD2位点基因型进行分析.结果表明:5个高油酸含量花生品种(系)的油酸含量均在80％以上,普通油酸含量品种花育22号和花育28号油酸含量分别为51.62％和41.38％.基于CAPS标记在7个品种(系)中的扩增产物及酶切带型分析推测,AhFAD2A位点花育28号为野生型,其他6个品种(系)符合448 G＞A突变类型;AhFAD2B位点花育28号和花育22号为野生型,开农H03-3、花育32号、P76和F18符合441-442insA突变类型,而06B16在该位点不符合441-442insA突变类型.     

枯草芽胞杆菌ZJF-1A5的β-葡聚糖酶热稳定性改造及酶学性质分析

利用定向进化技术对来自枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)ZJF-1A5的β-葡聚糖酶基因进行改造,并对野生酶和突变酶的酶学性质进行研究。获得了2株可以产较高热稳定性酶的突变体,分别被命名为EGs1和EGs2。酶学性质分析结果显示,与野生酶相比,EGs1和EGs2突变酶的半失活温度分别提高了3和5℃,达到了65.5和67.5℃;突变酶的最适反应温度也提高了5℃,达到了60℃;2个突变酶对地衣多糖的水解能力分别提高28%和降低21.6%;对地衣多糖的亲和力未见改变;野生酶和EGs1突变酶最适pH6.5,而EGs2突变酶最适pH7.0;野生型和突变型β-葡聚糖酶都有较宽的pH稳定范围,在pH6.0～8.5的范围内放置48h,仍保持80%以上的酶活力。遗传稳定性检验结果表明,突变株的遗传稳定性良好。     

β-葡聚糖酶的热稳定性改造及酶学性质分析

为了获得热稳定性有所提高的β-葡聚糖酶，本研究利用定向进化技术对β-葡聚糖酶基因进行改造，并对野生酶和突变酶的酶学性质进行研究。结果获得了两株热稳定性有所提高的突变体，分别命名为EGs1和EGs2；酶学性质分析结果显示：与野生酶相比，EGs1和EGs2突变酶的Tm值分别提高了3℃和5℃，达到了65.5℃和67.5℃；突变酶的最适反应温度也提高了5℃，达到了60℃；两个突变酶对地衣多糖的水解能力分别被提高28％和降低21.6％；对地衣多糖的亲和力未见改变；野生酶和EGs1突变酶的最适pH值为6.5，而EGs2突变酶的最适pH值为7.0；野生型和突变型-葡聚糖酶都有较宽的pH稳定范围，在pH 6.0-8.5的范围内放置48小时，仍保持80％以上的酶活力；遗传稳定性检验结果表明突变株的遗传稳定性良好。这一结果说明了定向进化在改善酶性质方面是比较有效的策略。     

崂山奶山羊骨桥蛋白基因(OPN)部分片段多态性及其与生产性状的关联分析

骨桥蛋白(osteopontin,OPN)是一种分泌型糖基化磷蛋白,在介导骨组织细胞与骨基质的连接过程中发挥重要作用.为了加快奶山羊的遗传进展,为奶山羊生产性状的标记辅助选择提供理论依据,本研究利用DNA混合池技术和高分辨率熔解曲线分析技术,检测了崂山奶山羊(Capra hircus)泌乳母羊的OPN基因多态性,并采用最小二乘方法分析其与泌乳和生长性状之间的关联效应.在所有174只样本中共检测到2个SNPs,即位于第5内含子I355位点的C/T(以C/r表示)和第7外显子E341位点的C/T(以M/N表示),其多态信息含量(PIC)分别为0.2773和0.3267,其等位基因和基因型频率在育种场(F)和育种户(P)群体中的分布不均衡,I355位点的P群体偏离Hardy-Weinberg平衡状态(P＜0.05),其他均处于平衡状态(P＞0.05).在与泌乳性状的关联分析中,P群体除电导性状以外的所有性状表型值均极显著(P＜0.01)高于F群体;I355位点上,CC基因型个体的脂肪含量显著(P＜0.05)高于CT和TT基因型个体,灰分和冰点性状显著(P＜0.05)高于CT基因型个体；E341位点上,等位基因N为非脂肪物、乳糖率、乳密度、乳蛋白率、冰点以及灰分6个性状的有利等位基因,所有性状差异均不显著(P＞0.05).在与生长性状的关联分析中,F群体的体重和体长均极显著(P＜0.01)高于P群体；P群体的尻宽和尻长极显著(P＜0.01)高于F群体;I355位点上,TT基因型个体的体重极显著(P＜0.01)大于CC基因型个体；E341位点上,等位基因M为体高和胸围的有利等位基因,MM和MN基因型个体的体重和尻宽极显著(P＜0.01)高于NN基因型个体,MM基因型个体的体长极显著(P＜0.01)高于NN基因型个体,MM基因型个体的体高、胸围显著(P＜0.05)高于NN基因型个体.本研究发现OPN基因突变位点I355与乳中脂肪和碳水化合物的含量相关,突变位点E341与奶山羊的生长发育性状有显著的关联效应,可以作为奶山羊部分生产性状的分子遗传标记.     

猪TNNC2基因的克隆及其融合蛋白在大肠杆菌中的表达

根据GenBank上猪TNNC2（Fast skeletal muscle troponin C2）基因序列（GenBank accession No. DQ629177）设计一对引物,采用RT-PCR方法克隆得到617 bp TNNC2 cDNA片段（GenBank accession No. EF673726）,包括完整的开放阅读框（ORF）,与GenBank上公布的猪TNNC2基因（GenBank accession No. AY575058）的ORF核苷酸序列同源性达99 %,并发现开放阅读框内的5个点突变,319位点T→C,320 位点G→A,321位点C→T,导致氨基酸107位Ala（丙氨酸）→Met（蛋氨酸）,322位点A→G为同义突变,433位点A→T,导致氨基酸144位Glu（谷氨酸）→Asp（天冬氨酸）。根据已获得的TNNC2基因开放阅读框序列,重新设计引物扩增得到包含BamH I和EcoR I酶切位点的完整阅读框,将其首先克隆到pMD18-T载体中,经菌液PCR筛选和酶切鉴定后,用BamH I和EcoR I将目的片段切下,再克隆到原核表达载体pRSET A中构建重组表达质粒pRSET A-TNNC2。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG不同诱导条件诱导表达,经SDS-PAGE电泳和Western blot分析证实重组表达质粒pRSET A-TNNC2表达出24 kD左右的融合蛋白,最佳诱导时间为4 h,最佳的IPTG诱导浓度为0.6 mmol/L,表达产物以可溶性蛋白的形式存在。     

粪肠球菌来源内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的重组表达及催化特性

内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(endo-β-N-acetylglucosaminidase,Endo/ENGase,EC3.2.1.96)是一类特异性识别并切割N-连接聚糖核心结构中两个N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine,Glc NAc)之间的β-1.4-糖苷键的糖苷酶,广泛应用于蛋白质N-糖基化分析。为表征粪肠球菌(Enterococcus faecalis)来源的内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的酶学特性,本研究通过PCR扩增粪肠球菌内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因endoEf,并通过无缝克隆的方式构建原核表达载体pET-28a-endoEf,在实现重组表达和纯化的基础上对EndoEf蛋白的催化特性及关键催化残基进行分析。结果表明,EndoEf可在大肠杆菌中以可溶形式高效表达,经钴离子亲和层析可获得高纯度的目标蛋白,每升菌液可纯化202.1 mg目标蛋白;以RNase B为底物,其比活力为1.0×10~4U/mg。EndoEf包含保守基序DXDXE,属于糖苷水解酶18(glycoside hydrolases 18,GH18)家族,可以酶切天然及变性状态下的核糖核酸酶B(ribonuclease B,RNase B)和鸡卵清蛋白(ovalbumin,Ova);基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)进一步证明了EndoEf对RNase B上N-连接糖链的水解。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)显示,EndoEf表观分子量为30.2 kD。酶学性质分析表明,EndoEf最适温度为40℃,最适pH范围为5.0~7.0;在温度为40~50℃、pH 7.0~9.0之间具有较好的稳定性,可耐受1 mol/L NaCl、100 mmol/L DTT、2%SDS和2%Triton X-100。定点突变技术构建EndoEf的3个突变体D125N、D127N和E129Q,并对突变体酶活性进行分析表明,E129Q活性几乎完全丧失,D127N丧失大部分水解活性,而D125N没有明显活性改变,说明EndoEf的129位谷氨酸是催化必须氨基酸。EndoEf重组表达体系的建立和酶学性质的分析为其在糖蛋白研究中的实践应用提供了科学依据。     

阴沟肠杆菌B29菌株脂多糖合成基因（waaL,waaG）缺失突变株的构建及分析

脂多糖（LPS）在革兰氏阴性细菌中的功能作用在不同菌株中已有研究,但尚未有对肠杆菌属LPS结构与功能的报道。本研究试图构建能引起肥胖的阴沟肠杆菌B29菌株waaL和waaG基因的缺失突变株,以了解突变体菌株产生的LPS结构与活性与野生菌株产生的LPS的差异。根据同源重组技术原理,利用广宿主自杀性质粒构建成敲除载体pKNG101△waaL和pKNG101△waaG,转化E.coli SM10菌株,并与B29菌株进行双亲杂交,再以抗生素和蔗糖筛选条件筛选waaL和waaG基因缺失突变株;利用多重PCR、ERICPCR、PCR-DGGE、DNA测序结果均证实突变株B29△waaL和B29△waaG构建成功;最后,对野生菌株B29与两个突变株生物学特性的差异进行了比较。银染实验结果表明野生型B29菌株的脂多糖为光滑型结构,突变株的LPS结构明显缺失O抗原,B29△waaG突变株同时还缺失了外部核心部分;用鲎试剂法检测LPS的内毒素活性显示,突变株的内毒素活性与野生型相比有较大幅度下降;B29△waaL突变株的生长速率与野生型相当,而B29△waaG突变株的生长速率则相对降低。本研究成功构建两种内毒素活性下降的突变株,为下一步利用突变株研究B29菌株在肥胖发生中的机制奠定基础。     

三个马棘突变体营养品质和利用价值的比较研究

以野生型马棘为对照,对比研究了紫叶、黄叶和高黄酮三个突变体的主要营养品质。结果表明:高黄酮突变体叶片的蛋白质含量为26.54%,比野生型高24.31%,粗纤维含量比野生型低18.92%,铁、铜、锰、锌含量分别比野生型高72.34%、7.02%、21.01%和38.75%,氨基酸总量(TAA)、必需氨基酸(EAA)分别比野生型高27.85%和27.68%;紫叶和黄叶突变体蛋白质含量低于野生型,含钙量分别比野生型提高15.22%和25.46%。研究结果表明,高黄酮突变体具有很高的饲用价值,紫叶和黄叶突变体也同样具有一定的饲用价值。     

Phosphate solubilization by a wild type strain and UV-induced mutants of Aspergillus tubingensis

Phenotypic mutants of Aspergillus tubingensis were obtained by UV irradiation and phosphate solubilization ability of these mutants were studied and compared with the wild type strain. Low phosphate solubilizing mutant was also selected in this study. Among the different mutants, AtM-5 and AtM-2 showed highest P solubilization when tri-calcium phosphate and rock phosphate were used as P source compared to the wild type strain and other mutants. These mutants also showed maximum acid phosphatase and phytase activity. These results suggest that P solubilization by these isolates is due to lowering of pH of the culture filtrate and also the activity of acid phosphatase and phytase.     

Effects of designed sulfhydryl groups and disulfide bonds into soybean proglycinin on its structural stability and heat-induced gelation

The gel-forming ability of glycinin is one of soybean's most important functional properties. The proglycinin A1aB1b homotrimer was engineered to introduce sulfhydryl groups and disulfide bonds, and their effects on the structural stability and the heat-induced gelation were evaluated. On the basis of the crystal structure, five mutants were designed and prepared: R161C and F163C forming an interprotomer disulfide bond with the inherent free cysteine residue of Cys377, N116C/P248C forming a new intraprotomer disulfide bond, and N116C and P248C introducing a new sulfhydryl group. Mutants of R161C, F163C, and N116C/P248C formed a new disulfide bond as expected. N116C/P248C was significantly more stable than the wild type against chemical and thermal denaturation and more resistant to alpha-chymotrypsin digestion, whereas F163C showed significantly increased thermal stability. All mutants exhibited greater hardness of heat-induced gels than wild type, and in particular, N116C/P248C gave the hardest gel. This result indicates that it is possible to increase hardness of glycinin gel by introduction of cysteine residues using protein engineering.     

水稻淡黄叶突变体xws的光合特性与基因定位

为了解析水稻叶绿体发育和高光效育种中光合作用的机理,本研究以不育系P88S群体中发现的一株淡黄叶自然突变体xws为试验材料,对该突变体进行表型鉴定和光合特征分析,并对其进行精细定位和候选基因分析。结果表明,xws在整个生育期叶片、茎和穗均呈淡黄色。与野生型相比,xws叶片、茎和穗的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量均显著下降。透射电镜观察结果发现,与野生型相比,xws嗜锇小体消失,类囊体数量减少。xws的净光合效率、气孔导度、蒸腾速率、胞间CO₂浓度和叶绿素荧光参数与野生型相比均降低。以xws与R032杂交的F₂群体作为定位群体,将基因精细定位至水稻第3号染色体分子标记WY242和WY119之间,其物理距离为51.7 kb。本研究结果为进一步研究水稻叶绿体发育,从而提高水稻光合作用和分子调控网络途径提供了理论支撑。     

谷子黄叶色突变体光合特性研究

为解析谷子黄叶色突变体高光合特性机理,以野生型豫谷1号为对照,分析了谷子全生育期黄叶色突变体ylm-1和ylm-2的光合色素、光合速率、气孔特性、荧光参数、光合关键酶活性和产量性状。结果表明,突变体光合色素含量为野生型豫谷1号的50%~60%,强光下突变体光合速率(Pn)较野生型显著提高,且无明显的“午休睡眠现象”;ylm-1和ylm-2气孔导度(Gs)显著增加。荧光参数结果显示,与野生型相比,突变体的光能利用效率和转化效率明显增加,光合关键酶1,5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)活性明显降低,而ylm-1和ylm-2磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)和苹果酸酶(NADP-ME)活性分别增加了23.3%、24.4%和12.9%、15.5%。产量相关性状分析表明,突变体单穗质量、穗粒质量及千粒质量较野生型显著增加。本研究结果为谷子高光效及分子标记辅助选择育种提供了重要的理论依据。     

拟南芥突变体amos2对外源激素的响应特征研究

检测拟南芥突变体amos2对外源激素响应的结果表明,该突变体主根伸长对外源生长素有明显的抗性,其主根抗性强于拟南芥野生型(WT),但弱于已知的生长素突变体aux1-7和axr4-2。该突变体的主根伸长对生长素转运抑制剂TIBA也表现出较强抗性,而对一定浓度的ACC表现敏感,但主根伸长对外源6-BA和ABA的响应与野生型一致。外源添加生长素或乙烯抑制剂可同时增加amos2和野生型的可见侧根数量,但突变体的增加百分比要显著高于野生型。虽然amos2突变体的荚果败育率比野生型显著增加,但并未表现出其他生长素突变体特有的胚轴弯钩消失及根系向重性缺失的表型。上述结果暗示突变基因AMOS2在控制拟南芥生长发育的某些方面发挥重要作用。     

野生型水稻及其低硅突变体中植硅体和植硅体碳的含量与分布特征

【目的】水稻是典型的富硅植物,植硅体沉积在水稻体内可封存有机碳。本文分析不同吸硅能力基因型水稻植硅体含量、形态、分布及其固碳特征,探究水稻植硅体固碳机理。【方法】盆栽试验在浙江大学玻璃房内进行。供试材料为水稻低硅突变体Lsi1和Lsi2及其野生型,所有施肥和管理措施一致。于成熟期,取水稻地上部茎、叶、鞘样品,常规方法测定硅、植硅体、植硅体碳含量。【结果】1)不同基因型水稻体内硅含量、植硅体含量、生物量干物质植硅体碳含量存在显著差异,均表现为突变体显著低于其野生型,大小依次为Lsi1野生型> Lsi2野生型> Lsi2突变体> Lsi1突变体,Lsi1和Lsi2突变体水稻植硅体碳含量显著高于其野生型,大小依次为Lsi1突变体> Lsi2突变体> Lsi2野生型> Lsi1野生型。2)野生型水稻硅与植硅体含量为鞘>叶>茎,而突变体水稻硅与植硅体含量为叶>鞘>茎,水稻叶片中的植硅体碳与生物量干物质植硅体碳含量最高,植硅体碳含量整体分布趋势为叶>茎>鞘,生物量干物质植硅体碳含量整体变化趋势为叶>鞘>茎。3)水稻植硅体含量与硅含量之间呈极显著正相关(P <0.01),高吸硅的水稻植硅体含量高,且形成的植硅体比表面积小,表明植硅体含量及其形态受其遗传特性的影响。植硅体含量与生物量干物质植硅体碳含量之间呈极显著正相关(P <0.01),植硅体碳含量与生物量干物质植硅体碳含量之间呈极显著负相关(P <0.01),表明生物量干物质植硅体碳含量除了受植硅体含量影响,还受植硅体所包裹的有机碳浓度影响。4) Lsi1及Lsi2野生型水稻生物量、植硅体储量、植硅体碳储量显著高于其突变体。【结论】具有高吸硅能力的野生型水稻与其突变体相比,生物量、硅、植硅体、生物量干物质植硅体碳含量增加,分布不同,虽然植硅体碳含量降低,但植硅体碳储量增加。Lsi1及Lsi2野生型水稻比低硅突变体水稻具有更高的固碳潜力。     

硝酸还原酶基因启动子NRE2元件缺失对烟草氮代谢的影响

为了探究硝酸还原酶基因启动子中硝酸盐响应元件NRE2缺失对烟草植株氮代谢的影响,以烤烟品种K326为材料,采用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了烟草NIA11和NIA2基因启动子中NRE2元件缺失的突变体材料,并于同一氮素营养条件下培养,测定烟草植株氮代谢相关生理指标.结果表明,与野生型相比,单突变体和双突变体叶...