水分胁迫对向水性突变体rhe2根生长与响应的影响

利用非损伤测定技术对拟南芥强向水性突变体rhe2(根毛乙烯突变体)的根系进行离子组学的初步探究。发现在水分胁迫下,与野生型拟南芥WT相比,该突变体能够保持相对稳定的根部质子(H~+)流向与流速;在植物向水性反应的过程中,过氧化氢(H_2O~2)和生长素(IAA)可能在根生长的维持及其相关信号转导过程中扮演重要的角色。     

水分胁迫对向水性突变体 rhe2根生长与响应的影响

利用非损伤测定技术对拟南芥强向水性突变体 rhe2(根毛乙烯突变体) 的根系进行离子组学分的初步探究。本实验研究发现：在水分胁迫下,与野生型拟南芥WT相比,该突变体能够保持相对稳定根部质子(H )的流向与流速。在植物向水性反应的过程中,过氧化氢( H₂O₂)和生长素(IAA)可能在根生长的维持及其相关信号转导过程中扮演重要的角色。     

拟南芥突变体amos2对外源激素的响应特征研究

检测拟南芥突变体amos2对外源激素响应的结果表明,该突变体主根伸长对外源生长素有明显的抗性,其主根抗性强于拟南芥野生型(WT),但弱于已知的生长素突变体aux1-7和axr4-2。该突变体的主根伸长对生长素转运抑制剂TIBA也表现出较强抗性,而对一定浓度的ACC表现敏感,但主根伸长对外源6-BA和ABA的响应与野生型一致。外源添加生长素或乙烯抑制剂可同时增加amos2和野生型的可见侧根数量,但突变体的增加百分比要显著高于野生型。虽然amos2突变体的荚果败育率比野生型显著增加,但并未表现出其他生长素突变体特有的胚轴弯钩消失及根系向重性缺失的表型。上述结果暗示突变基因AMOS2在控制拟南芥生长发育的某些方面发挥重要作用。     

拟南芥抗致病疫霉突变体部分序列分析

目前获得拟南芥(Arabidopsis thaliana)突变体的主要方法是采用激活标签法(activation tagging)(Kakimoto,1996;Kardailsky et al.,1999)。本实验根据拟南芥突变体对致病疫霉表现的抗性差异,利用TAIL-PCR技术对感致病疫霉的拟南芥突变体进行遗传分析,为克隆拟南芥抗致病疫霉基因提供资料。     

拟南芥nos1突变体对盐胁迫阳离子和阴离子的响应

植物对阴离子和阴离子的吸引是植物括盐性调控的重要内容。为了阐明拟南芥对中性盐中阳离子和阴离子抗性机制,本试验以拟南芥nos1(nitric oxide synthase1)突变体为材料,用Na2SO4、Na Cl、K2SO4、KCl作为盐胁迫因子,研究了突变体的根弯曲百分率、根长、株高、鲜重、存活率以及渗透调节物质脯氨酸和丙二醛含量的变化。拟南芥nos1突变体在4种不同盐胁迫下,呈现出不同的抗性,Na2SO4和Na Cl中突变体的根长显著高于K2SO4和KCl处理的材料,KCl中突变体的株高和鲜重显著高于Na2SO4和Na Cl中。随着盐浓度升高,突变体存活率显著低于对照,KCl中突变体的存活率显著高于Na2SO4和Na Cl中。另外突变体在Na2SO4和Na Cl中脯氨酸含量和丙二醛含量显著高于K2SO4和KCl处理的样品。这些结果表明突变体对盐胁迫下的阳离子和阴离子抗性机制存在显著差异,阳离子相同时,突变体对SO42-盐胁迫更敏感,阴离子相同时,突变体对Na+盐胁迫更敏感。本试验为提高作物抗盐性和生物技术改良提供理论依据。     

LRR-RLKs亚家族基因RLK6在拟南芥开花过程中的作用

为研究LRR-RLKs亚家族基因RLK6(AT2G26730)在拟南芥生长发育过程中的作用,本研究构建了植物过表达载体p Super1300-RLK6,获得5个过表达突变体,其中2个独立株系(OE8,OE9)用于表型分析。通过对野生型(WT)、RLK6基因缺失突变体(rlk6-2、rlk6-3和rlk6-6)、过表达株系OE8和OE9生长发育过程的详细观察和分析发现,RLK6基因缺失突变体在整个生长发育过程中的表型与WT差异不明显,而过表达株系OE8和OE9比WT开花早。此外,利用实时定量PCR(qRT-PCR)检测各基因型植株中开花相关基因的表达情况,结果表明,相对于WT,OE8和OE9中的开花促进基因CO、SOC1和LFY的表达量显著升高,而开花抑制基因FLC的表达量显著下降。研究结果说明RLK6过表达促进了拟南芥的开花,这为后续深入研究RLK6的作用机制奠定了基础。     

At2g29080基因可能参与了拟南芥盐代谢的调节

为进一步阐明植物盐代谢机理，以哥伦比亚生态型（Columbia type)野生拟南芥（Arabidopsis thaliana)及其盐敏感突变性（salt overly sensitive2,sos2）为材料，50mmol/L NaCl处理3d，利用mRNA差异显著显示技术分离得到了只在野生型拟南芥中表达，而在sos2突变体中不表达的一个未知功能的At2g29080基因片段DD156。序列同源性分析表明，它是一类大的蛋白家族AAA ATPase（ ATPase associated to a variety of cellular activities)中一员。Northern blot显示，随着NaCl处理浓度的升高。该基因在野生型拟南芥中的表达量增加。而在sos2突变体中，该基因的表达一直处于很低水平。这是首次发现AAA ATPase与植物的盐代谢有关。进一步研究发现，线粒体细胞色素氧化酶活化的变化，与与该基因在野生型和sos2突变体中的表达呈密切相关。表明该基因的编码产物可能参与了拟南芥线粒体细胞色素氧化酶活性的调控。     

PCAM蛋白功能分析及其与油菜素内酯(BR)信号转导关系

为阐明油菜素内酯(BR)和Ca2+信号转导的关系及其在调控植物生长发育过程中的作用机理,本研究利用2D-DIGE技术结合质谱分析在水稻(Oryza sativa L.ssp.Japanica)BR不敏感突变体(d61-4)和BR合成突变体(brd1-3)中鉴定到一个与野生型水稻相比明显上调的蛋白质,通过质谱鉴定,此蛋白为一Ca2+信号转导相关蛋白(putative calmodulin,PCAM);在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中过表达PCAM后转基因株系表现为生长缓慢,植株矮小,整个植株的生长周期明显延长。在过表达PCAM转基因株系中BR信号转导关键基因SaurAC被明显下调。研究结果表明,PCAM参与到BR信号转导途径过程中,在BR调控的植物生长发育过程中起负调节作用,过表达PCAM的转基因植株是抑制BR生理作用的表型。     

黄瓜生长素受体同源基因CsAFB和CsTIR在拟南芥中的转化与功能表达

植物生长素受体是生长素信号通路中的重要因子.基于前期克隆得到了黄瓜(Cucumis sativus)生长素受体同源基因生长素信号F-box蛋白基因(auxin signaling F box protein,CsAFB)和转运抑制响应基因(transport inhibitor response,CsTIR),为进一步证实和研究这2个基因的功能,本研究利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)Col-0野生型和生长素受体编码基因功能缺陷突变体tirl-1为材料,导入黄瓜生长素受体同源基因,获取纯合转基因系.检测发现,拟南芥突变体tirl-1转入CsAFB/TIR基因后根系发育、外源生长素敏感性和细胞伸长反应均恢复至野生型水平.检测发现,野生型拟南芥中过量表达黄瓜CsAFB/TIR,尤其是Cs TIR基因,植株主根伸长明显受抑,侧根数量剧增,子叶下卷,叶柄上翘,真叶叶缘向离轴面弯曲,顶端优势明显.本研究表明,CsAFB/TIR基因功能类似拟南芥TIR1基因,为黄瓜生长素受体同源基因;过量表达该类基因通过增加生长素受体数量、扩大生长素信号的方式参与调控植物生长发育;为进一步在黄瓜中研究生长素受体功能及作用机理提供理论依据.     

拟南芥Nodulin MtN21家族At1g0938基因功能的初步研究

拟南芥Nodulin MtN21 蛋白家族含有1～2个DUF6结构域,具有内在膜蛋白的特性。推测该家族基因在小分子跨膜运输、信号转导和抗逆性等方面发挥作用。At1g09380是拟南芥Nodulin MtN21 基因家族成员。本研究通过PCR筛选获得At1g09380对应的T-DNA 插入纯合子,并通过RT-PCR鉴定该突变体为无效突变体。对突变体萌发和萌发后阶段进行盐胁迫和干旱胁迫分析,结果表明,At1 g09380 突变体萌发后对NaCl和干旱胁迫敏感,证明该基因参与拟南芥的盐和干旱胁迫响应过程。同时还发现在长日照条件下突变体植株比野生型植株早开花7d左右。以上研究结果为进一步分析该基因的生物学功能打下基础。     

拟南芥抗致病疫霉突变体T-DNA 侧翼序列分析

本文通过将致病疫霉不同菌株接种到拟南芥Col-0生态型激活标签突变体上，筛选出了感致病疫霉的类型，以筛选出的拟南芥感病突变体基因组DNA为模板，利用热不对称交错PCR方法(Thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR)，进行了抗性相关基因的研究。通过TAIL-PCR技术，获得了拟南芥T-DNA插入侧翼序列，利用拟南芥基因组全测序的优势，通过NCBI进行序列的同源性比对找到相应的基因。结果发现，TAIL-PCR可以有效地扩增T-DNA插入侧翼拟南芥基因组序列，AD1，AD2，和AD4是最佳随机引物。对8个TAIL-PCR特异产物测序分析，证明3个T-DNA插入在基因上。     

STMP在拟南芥分枝发育过程中的功能鉴定

拟南芥(Arabidopsis thaliana)中含有脂/固醇结合的相关脂转移蛋白结构域(steroidogenic acute regulatory related lipid transfer,START)的膜相关蛋白(START domain containing-membrane related protein,STMP),STMP是START保守域(第84～295位)功能未知的蛋白质,由440个氨基酸组成、具有跨膜片段、属于磷脂酰胆碱转运蛋白.为明确STMP在拟南芥发育调控过程中的作用,深入了解拟南芥发育调控的分子机理,本研究用35S强启动子启动START结构域,构建START结构域的过表达载体,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)侵染花序法把STMP的过表达载体转入野生型拟南芥,获得过表达STMP的转基因拟南芥,并用qRT-PCR技术进行验证;分析转基因拟南芥分枝发育状况,明确STMP在拟南芥分枝调控过程中的作用;用qRT-PCR技术分析STMP的时空表达特性;构建STMP和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的融合蛋白载体,把此载体转入野生型拟南芥中,对转基因拟南芥中GFP进行荧光观察,从而对STMP进行亚细胞定位.本研究获得了过表达STMP的转基因株系;过表达STMP的转基因拟南芥分枝比野生型明显增多,突变体stmp的分枝减少;STMP的时空表达特性分析表明,茎中STMP的表达量最高,STMP定位在细胞质膜和细胞质中.结果表明STMP可以促进拟南芥的分枝发育,本研究对完善拟南芥分枝调控机制具有重要的意义,可以为植物株型的定向设计提供理论依据.     

T-DNA插入突变在植物营养研究中的应用

随着拟南芥整个基因组序列测定的完成,T-DNA插入形成的功能缺失(Loss-of-function)突变体和功能获得型(Gain-of-function)突变体,已经越来越多地运用到植物的各种代谢研究中。它可以作为有效的工具从基因的结构、功能、表达上来了解植物营养机制,从而为遗传工程改良植物本身的营养特性来适应贫瘠、盐碱化、酸害以及重金属危害等不良的土壤环境提供了条件。本文综述了T-DNA的结构、转化过程、侧翼序列的获得,以及T-DNA插入诱变在植物营养胁迫研究中的应用。     

基于RHE元件和拟南芥转录组的根毛发育基因筛选

拟南芥根毛发育是分子发育生物学的重要模型。本试验通过分析拟南芥根毛突变体bst的芯片数据,并对筛选到的下调表达变化超过2倍的基因的启动子进行根毛顺式作用元件RHE(Root HairElement)的筛查,初步获得了根毛发育候选基因。结果表明,在bst中下调表达变化超过2倍的494个基因中,共有13个基因启动子中有RHE元件,其中5个为已报道的参与根毛发育基因,8个为本研究首次发现的参与根毛发育的候选基因。     

毛叶苕子磷饥饿响应基因VvPHR1的克隆及功能研究

【目的】磷饥饿响应因子PHR (phosphate starvation response)在植物根系发育和磷养分吸收中起重要作用,本研究主要阐明毛叶苕子VvPHR1基因生物学功能,为培育磷高效型绿肥作物提供理论依据。【方法】通过转录组测序获得毛叶苕子VvPHR1基因序列。采用酵母单杂交方法验证VvPHR1基因的转录激活功能,构建其过表达载体,利用花粉管通道法分别遗传转化野生型和突变体(Atphr1)拟南芥,获得超量表达VvPHR1基因和突变体功能回补转基因材料。对正常磷(1 mmol/L Pi)和低磷(1μmol/L Pi)的培养基中生长30天的拟南芥取样,采用实时荧光定量PCR对野生型和转基因拟南芥中VvPHR1及下游磷转运基因的表达进行分析,并对转基因材料进行表型分析,测定其主根长、鲜重、总磷及无机磷(phosphate,Pi)含量。【结果】毛叶苕子转录组中有13个PHR基因,转录本129590、96227、120424与拟南芥的PHR1相似度最高,其中转录本120424在低磷诱导下表达量最高,将该转录本命名为VvPHR1基因。该基因cDNA全长1008 bp,编码335个氨基酸...     

浙粳22类病斑突变体spl(t)特征及其基因定位

在浙粳22辐照的突变体库中,筛选出一个对环境不敏感的全生育期表达的类病斑突变体。遗传分析表明,该突变性状由1对隐性核基因spl(t)控制。利用SSR标记对类病斑突变体spl(t)与珍汕97B杂交构建的F2群体进行基因定位,把spl(t)基因定位在第12号染色体短臂端的着丝粒附近,位于SSR标记RM7195与RM27929之间的0.8cM区间内。锥虫蓝染色检测结果表明spl(t)类病斑的形成和发展是一个程序性细胞死亡的过程。进一步研究表明,这种程序性细胞死亡是由H2O2氧迸发而致。突变体经白叶枯病和稻瘟病鉴定,表明该突变体的抗病性与野生型品种浙粳22相仿。     

~(60)Co-γ射线诱导水稻卷叶突变体基因组缺失的分析

为探明60Co-γ射线诱导水稻卷叶突变体γ-rl产生的原因,对早期研究中分子标记定位区间内的4个候选基因进行PCR扩增分析,发现其中的OsF MO(t)基因在γ-rl突变体中不能扩增出特异条带。通过PCR扩增和Southern杂交进一步分析,证明γ-rl基因组中存在1个包含OsF MO(t)基因的最大范围约为16.47 kb的缺失区间,该结果为电离辐射可致植物基因组DNA产生较大范围的缺失提供了一个新的确凿证据。利用FGENESH软件对此缺失区间的DNA序列进行基因预测,发现除了OsF MO(t)基因外,该缺失区间内可能还包含1个编码类似拟南芥中假设的核糖核酸酶H基因、1个编码类似人类中E2调节蛋白基因和2个未知功能基因。这些基因的缺失可能是突变体γ-rl产生的主要原因。本研究结果为γ-rl突变体相关基因的克隆及功能分析提供了理论依据。     

利用GFP基因的黄瓜T-DNA插入突变体构建与快速鉴定

为促进黄瓜功能基因组学研究,本研究开展了黄瓜T-DNA插入突变体快速构建与鉴定方法的研究。基于对黄瓜遗传转化体系农杆菌侵染活力和共培养条件的优化,本研究以绿色荧光蛋白GFP基因为插入片段,进行黄瓜T-DNA插入突变体的创制,并利用荧光显微镜进行快速鉴定,最后采用TAIL-PCR技术对突变体进行分子鉴定,确定突变位点。结果表明,选取农杆菌侵染液在活化至12~18 h时具有最佳的活力和浓度,而最佳共培养温度为23℃。采用体式荧光显微镜快速鉴定,从2 978个转化外植体中鉴定得到3株表达GFP再生苗,转化率为1.00‰。TAIL-PCR成功鉴定了一个突变体,其插入位点位于CsaV3_1G032940基因的第10个外显子中,该基因在拟南芥中的同源基因为AT4G18950 (blue light-dependent H⁺-ATPase phosphorylation 1,BHP1),参与蓝光介导的气孔开放过程,但在正常栽培环境中该突变体的T0植株与野生型无差异。本研究结果对黄瓜功能基因组学研究具有重要意义。     

拟南芥中磷脂酶Dγ2的低温信号转导作用途径分析

磷脂酶D(PLD)的磷脂降解功能和信号转导功能均能影响植物的抗冻性。本研究以PLDγ2基因被敲除的拟南芥突变体及其野生型为材料,进行低温驯化和冻害胁迫处理,随后由这两种植株的表型及其离子渗透率等来分析PLDγ2基因对拟南芥抗冻性。结果发现,经直接冻害处理后,PLDγ2敲除型的抗冻性与野生型基本一致;但经过低温驯化后的冻害处理,PLDγ2敲除型的抗冻性弱于野生型,即表明PLDγ2基因参与了低温信号转导作用。进一步的实验结果表明PLDγ2基因介导脯氨酸调控的可溶性物质调控途径和过氧化物酶(POD)活性调控的抗氧化系统途径;但是与低温信号激素ABA不在同一条信号转导途径。     

油菜毛状体发育相关基因GLABRA2启动子的克隆与功能验证

GLABRA2(GL2)基因在拟南芥毛状体发育中具有重要作用.实验利用基因组步移巢式PCR的方法,通过两次步移克隆得到一个油菜(Brassica napus)GL2基因启动子序列,序列分析发现它与拟南芥GL2启动子同源性较差,但有一些共同的顺式作用元件如MYB结合位点、G box等,也有油菜GL2基因所特有的应答元件如E-box.将其中具有启动子的基本特征的序列GP1与GUS报告基因融合构建重组载体pBI121-GP1,转化拟南芥(Arabidopsis).用卡那霉素筛选得到10株阳性苗.在T2代转基因株系中有6个株系的绿苗与黄花苗的比例都接近3:1,推定T-DNA是以单拷贝的形式插入拟南芥基因组DNA.GUS组织化学染色表明,GP1调控下报告基因主要在子叶、真叶的表皮毛以及根部的幼嫩组织中表达,与拟南芥GL2基因启动子表达模式基本一致,但也有明显不同:油菜GL2启动子GP1只在表皮毛发育早期强烈表达,而拟南芥GL2启动子调控表皮毛发育的整个过程.