ISSR和SRAP标记技术在兰花植物种质资源研究中的应用

分子标记技术在兰花种质资源的亲缘关系鉴定与遗传多样性分析、分子遗传图谱的构建与目的性状基因的标记定位、基因库的构建和基因克隆、辅助育种选择及品种纯度鉴定等研究领域被广泛利用与推广.现从简单重复序列间扩增(Inter-simple sequence repeat,ISSR)和相关序列扩增多态性(SRAP)分子标记技术的基本原理、方法、特点以及在兰花植物种质资源的遗传育种中的应用现状和前景进行了综述与探讨.     

AFLP分子标记在果树上的应用

AFLP（扩增片段长度多态性）是一种新的DNA分子标记技术。该文主要对其基本原理进行了简要介绍,并从果树种质资源、果树遗传育种等方面,概述了AFLP标记在果树上的应用进展,评述了其存在的问题和应用前景。     

与梨黑星病抗性基因连锁的AFLP标记筛选及SCAR标记转化

以‘鸭梨’（Pyrus bretschneideri）ב雪青’梨（P. bretschneideri × P. pyrifolia）F1代群体（97株）为试材,采用扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism,AFLP）技术和集群分类法（bulked segregant analysis,BSA）筛选与梨抗黑星病基因连锁的分子标记。通过64对AFLP标记引物在亲本和分离群体中的筛选和验证,获得与梨抗黑星病基因紧密连锁标记两个,即ACA/CAA-179和AAC/CAG-198。它们与抗黑星病基因的遗传距离分别为5.2和8.3 cM。对AFLP标记片段的克隆和测序结果显示其长度分别为179和198 bp。根据序列信息设计特异引物,在杂交后代群体上的PCR分析表明AFLPACA/CAA-179标记被成功转换成SCAR标记,命名为SCAR-117。本研究结果将有助于对抗黑星病梨品种资源的分子鉴定及杂种后代的早期辅助选择。     

中国石斛属植物遗传资源的AFLP分析

中国是世界石斛属（Dendrobium）植物分布中心,其主要分布在云贵川等地区。采用扩增片段长度多态性（AFLP）分子标记方法,研究了石斛属92个种质的遗传多样性和亲缘关系。从24对引物组合中筛选出10对引物组合进行扩增,共扩增出2 329个位点,其中多态位点2 307个,占总扩增位点的99.04%。聚类分析将92个石斛种质,分为4个类群,种间遗传分化显著。AFLP分子标记将菱唇石斛和西畴石斛划为石斛组、金耳石斛划为寡花组,且研究结果表明,茎的形态和质地为石斛分类的重要性状,花的唇瓣和茎节的膨大非石斛分类的主要因素。     

分子标记技术在果树育种研究中的应用

1分子标记技术分子标记是一种以生物体内遗传物质——核酸（DNA）的多态性为基础的遗传标记，是随着各种生物技术的不断创新而进步和发展的，经历了从基于酶切的限制性片段长度多态性（Restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP），到基于微卫星的简单重复序列（Simplesequencerepeat，SSR），     

SSR标记在植物种质资源鉴定的应用进展

简单重复序列标记(Simple Sequence Repeat,SSR)是一种基于串联重复序列两侧的保守序列设计引物进行PCR扩增,电泳分析扩增产物长度多态性的分子标记。该标记重复性好、多态性丰富、通用性高,近年来在植物种质资源鉴定方面的应用深入而广泛。本研究综述了SSR标记在遗传多样性与亲缘关系评价、品种鉴定与纯度分析、遗传连锁图谱及指纹图谱构建等方面的应用进展,以期为SSR分子标记进一步的研究与应用提供参考。     

基于SSR标记的黄桃种质资源亲缘关系分析

利用SSR标记技术对12个黄桃品种（系）进行遗传多样性检测.结果发现,SSR标记能够揭示材料间的遗传多样性,从蔷薇科苹果属35对SSR引物中筛选出8对扩增稳定的特异性引物,构建其指纹图谱.8对SSR引物共扩增出78条DNA片段,其中44条具有多态性,多态性比率为54.6％,材料间的遗传相似系数在0.64 ～0.88之间,平均为0.759.通过聚类,从分子水平对黄桃品种（系）的遗传关系进行分析,并对12份黄桃种质材料进行了SSR标记分类,为黄桃种质资源的研究利用提供参考.     

一个与辣椒细胞核雄性不育性状连锁的高分辨率熔解曲线（HRM）标记的开发

雄性不育性状被用在植物育种中,以降低种子生产成本。雄性不育分为细胞核雄性不育（GMS）和细胞质雄性不育（CMS）2种类型,在辣椒商业育种中都有应用。因为缺少恢复源,细胞质雄性不育系统在诸如甜椒等一些辣椒品种上并不适用。因此,细胞核雄性不育对于甜椒的种子生产而言就非常重要。本研究构建了一个F：分离群体,利用集群分离分析法（BSA）和扩增片段长度多态性（AFLP）技术获得了一个与甜椒细胞核雄性不育连锁的标记。我们分析了1024对AFLP引物,发现EcoRIACG／MseIGTF引物扩出了多态性。对多态性AFLP标记所扩增的395bp片段重新设计引物,进行高分辨率熔解曲线分析（HRM）。在92个Fz单株中,有87个单株的性状和HRM标记表型相一致。这个HRM标记被定位在AC99连锁图的第5号染色体上。     

AFLP及其在果树中的应用

通过对AFIP技术（扩增片段长度多态性）的基本原理、技术特点的介绍，综述了利用AFLP标记技术开展果树遗传图谱构建、指纹图普绘制与品种鉴定、遗传多样性分析及基因定位等方面的研究。     

杏杂合位点共显性标记的分离方式及连锁图谱构建

以‘串枝红’ב金太阳’杏的F1代为材料,在分析共显性标记分离方式的基础上利用简单重复序列（SSR）和相关序列扩增多态性（SRAP）标记,构建了两张杏分子连锁图谱。‘串枝红’图谱共14个连锁群,包含37个SSR标记和32个SRAP标记,连锁群总长度为1086.6cM,每连锁群平均长度77.6cM,标记间平均连锁距离为1...     

西瓜隐性核雄性不育基因的RAPD标记

 应用RAPD分子标记技术, 采用BSA法对西瓜隐性核不育材料Se18的不育基因进行了分子标记研究。结果表明, 220个引物中, 只有引物S1167、S357在不育株DNA中扩增出了多态性特异片段, 在可育株DNA中未扩增出多态性片段。验证结果表明, 引物S1167在12个不育材料中的138个不育株全部扩增出特异性片段, 可以区分不育株与可育株。对特异性片段进行回收、克隆和测序, 其结果表明, S1167扩增特异片段有2 391个碱基对。     

白菜型油菜和菜薹的InDel 标记开发及其RILs群体遗传连锁图谱的构建

 通过白菜型油菜‘R-O-18’和菜薹‘L58’的基因组重测序数据与白菜基因组的参考序列（‘Chiifu-401-42’的基因组序列）的比对,在全基因组范围内检测到了18 479 个短插入缺失变异位点（≤5 bp）。从中挑选了500 个插入/缺失片段为4 ~ 5 bp 的InDel 变异位点,将其设计成InDel 分子标记并进行试验验证,结果有452 个标记通过PCR 扩增出单一条带,但仅有106 个在‘R-O-18’和‘L58’间表现出多态性,346 个没有多态性,48 个在PCR 中没有扩增。亲本间具有多态性的106 个InDel 标记可用来检测以‘R-O-18’和‘L58’为亲本构建的RILs 基因型,并构建了一张包含99 个标记的遗传连锁图谱。     

利用重组自交系群体构建番茄AFLP 遗传连锁图谱

 以普通栽培番茄（Solanum lycopersicum）99165-30为母本,野生多毛番茄（Solanum habrochaites）LA1777为父本进行杂交,通过单粒传得到了含有80个F_5︰6家系的重组自交系分离群体,利用荧光AFLP分子标记技术构建番茄分子遗传连锁图谱。AFLP标记采用MseⅠ和EcoRⅠ两种内切酶及荧光标记（IRD-700或IRD-800）的E + 3和非荧光标记的M + 3引物组合进行选择性扩增,扩增结果经95 ℃预变性后在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳2.5 h,运用LICOR 公司的NEN Global Edition IR² DNA Analyzer（Model 5200 LI-COR Biosciences,Lincoln,NE）荧光扫描检测DNA多态性。对RILs群体中产生分离的274个AFLP标记运用JoinMap 3.0软件分析,得到一张番茄分子遗传连锁图谱,图谱总长度为662 cM,共包括18个主要连锁群,125个多态性分子标记。每条连锁群上的标记数在3 ~ 22个之间,连锁群的长度在14.0 ~ 58.0 cM的范围内,平均图距在 2.27 ~ 13.3 cM。总平均距离5.3 cM,本研究中构建的番茄永久遗传图谱,为番茄分子辅助育种及重要农艺性状的定位奠定了基础。     

越橘反转录转座子插入多态性分子标记开发及品种鉴别

从蔓越橘（Vaccinium macrocarpon Ait.）品种‘Ben Lear’基因组序列中发掘了398 014 bp的长末端重复序列反转录转座子（LTR-RT）,占整个基因组序列的11.17%;鉴别出228条Ty1-Copia家族成员和137条Ty3-Gypsy家族成员。以45个越橘（Vaccinium spp.）品种和1个蔓越橘品种为材料,从53对基于LTR-RT插入位点开发的引物中筛选出17对多态性引物,建立了越橘品种的LTR-RT插入多态性（RBIP）分子标记。使用RBIP标记对46个品种进行了亲缘关系分析和分子身份证构建,其中多态性最高的位点是Vmrg1,最低的位点是Vmrg14。其PCR产物的大小变化范围为200 ~ 463 bp,最小长度片段和最大长度片段分别出现在位点Vmrc19和Vmrc3。46个品种基于遗传距离聚为6组,组Ⅰ包括3个北高丛越橘品种,蔓越橘单独聚为组Ⅵ,其他4组中北高丛越橘、南高丛越橘或兔眼越橘混杂在一起。利用17个位点组成的“1”、“0”字符串构建了45份越橘品种和1份蔓越橘品种的唯一分子身份证,为越橘品种的鉴别提供了参考。     

石斛属植物遗传多样性RAPD分析

应用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术,对石斛属植物16个种进行了基因组DNA多态性分析.从82个随机引物中筛选出20个多态性好的引物进行RAPD扩增,扩增DNA片段数据用UPGMA聚类法构建系统发育树.20条引物共扩增出142条带,多态性带118条,约占总数的83.1%.聚类结果显示RAPD分子标记构建的系统发育树与经典分类系统一致.RAPD标记可为石斛属植物的系统分类研究提供分子生物学依据.     

茎瘤芥(榨菜)主要品种SSR分子标记差异性研究

选取6个茎瘤芥品种为试材,在芸薹属SSR公共引物中初筛获得引物的基础上,选择9对条带清晰、表现稳定的多态性引物,利用SSR荧光标记技术开展了茎瘤芥品种SSR分子标记的差异性研究,初步构建了品种的分子身份证。结果表明,共筛选到7对多态性引物,检测到20个等位位点,平均每对引物2.2个;扩增得到20个带型,平均每对引物2.2个,扩增片段长度在126～397 bp;构建了6个茎瘤芥品种的分子身份证,并进行了合理区分;在分子水平上,浙江品种间差异最为显著,浙渝两地品种差异次之,重庆品种间差异最小,但各品种均拥有独立身份代码,研究结果为茎瘤芥品种资源的鉴定、亲缘关系分析、遗传基础研究等各项工作提供了依据。     

RAPD技术与果树种质资源及育种研究

自60年代以来，分子标记技术迅速发展，极大地加深了人们对生物遗传规律的认识。在众多的DNA分子标记中，由Willims等（1990）和Welsh等（1990）建立起来的RAPD（RandomAmplifiedPoly-mbrphicDNA，随机扩增多态性DNA）技术，以其快速、准确、灵敏度高等特点，一开始就受到生物学家的重视，在分类研究（Taxonomy）、品种鉴定（Va-rietyIdentification）、系谱分析（Pedigree）、遗传图谱构建（GeneticMapping）、基因f＄1己（GeneticTag-ging）等方面得到广泛应用。本文简要介绍RAPD技术的原理、特点及其在果树种质资源和育种研…     

Multi#ex—CAPS技术及其在番茄遗传鉴定中的应用

 ：应用Multiplex—PCR和CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence)原理研究建立了Mutiplex—CAPS技术。该技术包括：(1)在PCR扩增反应体系加入2对、3对或多对核苷酸引物，经30～40个扩增循环后得到每对引物的特异扩增片段；(2)应用同一种限制性内切酶消化这些不同引物经扩增后获得的特异片段；(3)琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭染色检测酶切片段长度的多态性。利用该技术对番茄(Lycopersicon es—cdentum)TA517及其近等基因系的分析表明，Multiplex—CAPS能同时检测2个、3个或多个CAPS标记的多态性，其效果等同于每个CAPS标记的多态性的叠加，重复性好，分析效率高，降低成本数倍。     

SSR与AFLP标记在甜瓜连锁图谱上的分布

利用3-2-2×TopMark杂交组合,得到152株重组自交系群体,构建甜瓜分子遗传图谱。该图谱包括71个SSR标记和94个AFLP标记,由17个连锁群构成,覆盖基因组总长度1 222.9 cM,标记之间平均距离为7.41 cM。筛选了428对SSR分子标记（其中360对为EST-SSR引物,68对为g-SSR引物）,得到94对具有多态性的SSR标记,其片段大小在150～300 bp之间,多态性比例占21.29 %;筛选了256对EcorI/MseI AFLP引物组合,得到22对AFLP多态性引物,共含有146个AFLP多态性位点,其片段大小在100～600 bp之间。SSR标记较平均的分布在染色体上,AFLP标记在LG1、LG12及LG14上出现聚集现象。     

山楂（Crataegus pinnatifida Bge.)遗传多样性的RAPD和ISSR标记分析

 利用RAPD和ISSR标记对35份山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）资源进行了DNA多态性分析。12个RAPD引物共扩增出110条清晰的谱带,其中89条显示多态性,平均每个引物扩增出7.4条多态性谱带。13个ISSR引物共扩增出110条清晰的谱带,其中94条显示多态性,平均每个引物扩增出7.2条多态性谱带。基于RAPD和ISSR标记,利用UPGMA分别构建了35份山楂资源的聚类树状图。距离系数分别为0～0.62（RAPD）和0～0.64（ISSR）,表明山楂具有较高的遗传多样性。