FASN基因的功能及调控机制研究进展

脂肪酸合酶(Fatty Acid Synthase,FASN)是哺乳动物脂肪酸合成过程中的关键酶,在机体复杂的代谢调控过程中起着极其重要作用。以往有关其功能及作用机制的研究多集中于转录组mRNA水平,而随着现代分子生物学技术的发展,真核生物转录后水平的基因表达调控越来越受到人们的关注。在综述了近些年FASN基因参与调控家畜乳脂、肉质、脂肪沉积等生产和屠宰性状,以及人类癌症发生、发展的基础上,对该基因在转录和转录后水平上的表达调控机制研究进行总结,为FASN基因影响机体生长发育的网络调控机制研究提供依据。     

大白菜LACS家族基因鉴定与表达分析

长链脂酰辅酶A合成酶(LACS)能催化游离的脂肪酸形成酰基辅酶A,是脂肪酸激活、转运、氧化及储存脂合成等生化途径的关键酶，在许多生物过程中发挥重要作用。本研究利用生物信息学方法鉴定大白菜LACS家族基因成员，分析其亲缘关系、蛋白质理化性质、染色体定位、共线性关系、基因结构、蛋白保守结构域和基因表达模式。结果表明，从大白菜全基因组共鉴定到13个BrLACS基因成员，分成4组，不均匀地分布在7条染色体和1个Scaffold上。BrLACSs的蛋白长度和分子量分别为199～1 072 aa和23.10～121.10 kDa。与拟南芥AtLACS1、AtLACS5和AtLACS6共线性的BrLACS基因发生了扩张，出现了双拷贝(BrLACS5a、BrLACS5b和BrLACS6a、BrLACS6b)及三拷贝(BrLACS1a、BrLACS1b和BrLACS1c)。表达模式分析表明，BrLACS4和BrLACS8基因在大白菜不同器官/组织中表达量最高，尤其在控制花器官蜡质性状中起着重要作用，在有蜡粉大白菜中的表达量显著高于无蜡粉大白菜。本研究结果为解析大白菜LACS基因在控制大白菜蜡质性状中的分...     

辛酸钠对奶牛乳腺上皮细胞脂肪酸合成相关酶表达的影响

为研究辛酸钠对奶牛乳腺上皮细胞脂肪酸合成关键酶乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)和硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)表达的影响,采用0.5、1.0、2.0mmol/L的辛酸钠处理体外培养的奶牛乳腺上皮细胞,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测ACC、FAS、SCD基因相对表达丰度,Western blot检测ACC、FAS、SCD蛋白相对表达水平。结果显示:与不添加辛酸钠组相比,辛酸钠以浓度依赖的方式显著抑制ACC、FAS、SCD的表达。辛酸钠能抑制奶牛乳腺上皮细胞脂肪酸合成关键酶和硬脂酰辅酶A去饱和酶的表达。     

不同产脂能力猪脂肪合成相关基因表达谱分析

旨在筛查不同产脂能力猪脂肪合成的相关差异表达基因,分析其与猪THRSP基因表达的关联性。实验采集5头瘦肉型和3头脂肪型猪的肝脏,提取总RNA,利用基因表达谱芯片技术检测猪肝脏全基因组表达谱,分析THRSP基因与脂肪代谢相关差异表达基因之间的关联性。结果表明,相对瘦肉型猪,脂肪型猪脂肪酸合酶(FASN)、葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)(P0.01)和乙酰辅酶A羧化酶α(ACACA)(P0.05)基因的表达显著上调,小GTP酶中Rab32和Rab4a显著上调,Rab27a则表现显著下调(P0.05);相关性分析显示GLUT4、FASN和ACACA基因表达的变化与THRSP基因呈显著正相关,Rab27a基因为显著负相关,Rab32和Rab4a基因则相关性不明显。     

乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的结构与功能

乙酰辅酶A羧化酶(ACC)催化乙酰辅酶A形成丙二酸单酰辅酶A的羧化作用,是在脂肪酸合成和代谢中起重要作用的中间代谢物。ACC包括ACCα和ACCβ两种形式,被不同的基因编码。ACC(α265 kDa)主要在脂肪生成活跃的肝脏、脂肪组织和乳腺中表达。ACC(β275 kDa)主要在β-氧化作为主要能量来源的骨骼肌和心脏中表达。对ACC的结构特点和基本功能进行了探讨。     

哺乳动物ACCα基因启动子结构特征及调控

乙酰辅酶A羧化酶(ACC)在哺乳动物脂肪酸合成和分解代谢中发挥着重要作用.ACC包括ACCα和ACCβ2种形式,由不同基因编码,其中ACCα主要在脂肪酸合成过程中起作用.哺乳动物ACCα基因的启动子主要包括3个:PⅠ、PⅡ和PⅢ,而反刍动物和啮齿动物还包括第4个启动子PIa,各启动子具有不同的结构特征.     

延边黄牛和延黄牛脂肪组织FASN基因mRNA表达水平与肉质的关系

为了探讨不同品种牛不同脂肪沉积部位FASN基因mRNA表达水平与肉质的关系,采用荧光定量PCR技术检测延边黄牛和延黄牛皮下脂肪、腹部脂肪、肾周脂肪与其他器官的FASN基因mRNA表达水平。结果表明,2个牛品种的FASN基因mRNA在不同脂肪组织中表达量均高于背最长肌,而延黄牛皮下脂肪和腹部脂肪中FASN基因mRNA表达量都高于延边黄牛。通过对肺、小肠、肾脏、肝脏和心脏中FASN基因mRNA研究发现,延边黄牛和延黄牛肺中FASN基因mRNA的表达量高于其他脏器。由此可见,FASN是影响脂肪酸合成的关键酶,与肉质相关,其中皮下脂肪和腹部脂肪是脂肪酸合成的主要部位。     

中国荷斯坦牛FASN基因部分序列PCR-SSCP多态性与泌乳性状的相关性

【目的】研究奶牛脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FASN)基因多态性对产奶量和乳成分的影响,为中国荷斯坦牛的优化育种提供相应的分子遗传学依据。【方法】以464头中国荷斯坦牛为研究材料,参照奶牛生产性能测定(Dairy herd improvement,DHI)方法采集产奶量和乳成分数据;采集试验牛血样,提取DNA,PCR扩增FASN基因,用单链构象多态性(Single-strand conformation polymorphism,SSCP)技术并结合测序确定基因型;用最小二乘法进行基因多态性与泌乳性状的关联性分析。【结果】FASN基因外显子34存在2个等位基因、2种基因型,A、B等位基因频率分别为0.813 9和0.186 1,试验群体在这一位点上极显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.01),遗传杂合度(He)和多态信息含量(PIC)分别为0.372 3和0.257 0。测序结果显示,与普通黄牛FASN基因序列(GenBank登录号:AF285607)相比,B等位基因在第16 024和16 039位核苷酸处分别发生了A→G和C→T碱基突变,其中A→G突变导致苏氨酸变成丙氨酸,C→T突变导致精氨酸变为色氨酸;A等位基因与AF285607序列相同。最小二乘法分析表明,AA型个体305d乳脂量显著高于AB型个体(P<0.05),等位基因A为高乳脂量优势基因。【结论】FASN基因外显子34突变位点可作为高乳脂的分子遗传标记应用于中国荷斯坦牛的标记辅助选择育种中。     

柞蚕性信息素合成相关基因的表达研究

[目的]明确与性信息素合成相关基因的组织分布及其在性腺中的发育表达。[方法]利用荧光定量PCR方法,对柞蚕乙酰辅酶A羧化酶、超长链脂肪酸、醇脱氢酶、酯酶、脂肪酶基因在不同组织分布及性腺中的发育表达进行分析。[结果]乙酰辅酶A羧化酶、超长链脂肪酸2个基因在性腺中的表达量显著高于其他组织;醇脱氢酶、酯酶和脂肪酶3个基因在中肠或脂肪体等组织中表达量高于性腺。乙酰辅酶A羧化酶、超长链脂肪酸、醇脱氢酶、脂肪酶4个基因在羽化后2 d性腺中的表达量显著高于羽化前2 d。酯酶基因在羽化后2 d性腺中的表达量显著低于于羽化前2 d。[结论]明确了柞蚕性信息素合成相关的5个基因的组织分布和发育表达,为进一步研究这些性信息素合成相关基因的功能奠定基础。     

毛果杨中链酰基辅酶A合成酶的克隆及酶学分析

中链酰基辅酶A合成酶(MACS)属于腺苷酸合成酶超基因家族,催化中链脂肪酸与辅酶A结合形成相应的中链酰基辅酶A。本研究通过同源检索毛果杨基因组数据库中的4CL基因,克隆得到毛果杨PtMACS1的基因序列(基因编号:estExt_fgenesh4_pg.c_640066)。通过序列分析可知,Box I和Box II两个在4CL中保守的结构域在该蛋白中并不保守。将PtMACS1与原核表达载体 pET-30a(+) 构建融合表达载体PtMACS1- pET-30a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白进行表达。镍柱纯化重组蛋白后进行酶学活性分析,研究结果表明该蛋白对中链脂肪酸己酸、壬酸、癸酸显示出明显活性:Kcat分别为(1302.65)、(1933.46)、(2015.51) mol/(minmg),以该蛋白的最适底物癸酸测得该蛋白的最适反应温度为37 ℃,最适反应pH为7.0。该结果表明,PtMACS1属于毛果杨中链酰基辅酶A合成酶家族一员,为后续毛果杨腺苷酸合成酶超基因家族的鉴定及分类分析提供资料。      

奶山羊SCD基因CDS区的克隆、序列分析及过表达

【目的】研究奶山羊硬脂酰辅酶A去饱和酶基因（stearoyl-CoA desaturase,SCD）在乳腺上皮细胞中对不饱和脂肪酸合成过程相关基因的调控及对细胞脂肪酸组成的影响。【方法】用RT-PCR方法从西农萨能羊乳腺组织中扩增SCD基因,进行序列分析和组织表达谱分析;构建重组腺病毒质粒,进行包装和扩增后,感染体外培养的奶山羊原代乳腺上皮细胞,实时定量检测相关基因的表达,western blotting检测蛋白变化,气相色谱-质谱联用分析细胞内脂肪酸组成变化。【结果】①获得了全长1 080 bp的山羊乳腺SCD基因CDS（GenBank登录号：GU947654）并对其进行了生物信息学分析;②奶山羊SCD基因在乳腺、肺和皮下脂肪组织中高表达,而在心脏、瘤胃和卵巢组织中的表达量较低;③成功构建了奶山羊SCD基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度的重组病毒液,重组腺病毒感染原代乳腺上皮细胞后,检测结果表明细胞中SCD基因过表达极显著,FASN、H-FABP、LEPR和LXRα等基因表达下调,而PPARγ和LPL基因的表达量显著性增加;④棕榈酸和硬脂酸的含量下降,不饱和脂肪酸含量上升。【结论】SCD基因在奶山羊乳腺中发挥着重要作用,FASN、H-FABP、LEPR、LXRα、PPARγ和LPL基因的表达与其相关,这些基因共同影响乳脂中脂肪酸的组成。     

惠阳胡须鸡LPL、FASN基因多态性的研究

以惠阳胡须鸡为研究对象,分别以LPL、FASN基因为脂肪性状相关的候选基因,采用限制片段长度多态性(RFLP)检测这2个候选基因在惠阳胡须鸡中的多态性。研究结果表明,(1)用限制性内切酶HinfⅠ对LPL基因第8内含子进行RFLP分析,发现76.3%为已报道的BB型,另发现了两种新的基因型,分别占1.7%和22%,无AA型;(2)用限制性内切酶HaeⅢ对FASN基因进行RFLP分析,发现BB基因型比例为64.8%,BC型12.24%,CC型基因型比例23.4%。B等位基因频率为0.7041,C等位基因频率为0.2959,B等位基因频率明显高于C等位基因频率。     

西农萨能羊FAS基因shRNA序列筛选及其腺病毒载体的构建

山羊脂肪酸合酶(Fatty acid synthase,FAS)是脂肪酸合成的关键酶,对乳腺短、中链脂肪酸合成起重要调控作用。设计了shRNA-5544、shRNA-5936s、hRNA-6132 3条针对FAS基因不同区域的小发夹RNA(Short hairpin RNA,shRNA)及一条阴性对照序列shRNA-NC,并构建表达这4条shRNA序列的入门载体及其靶基因与红色荧光蛋白基因的融合表达载体,二者共转染HEK 293细胞进行有效序列筛选,结果显示shRNA-5544和shRNA-5936序列具有明显的干扰效果。在LR Clonase-Ⅱ重组酶作用下,分别将pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-5544、pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-5936及pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-NC入门载体与腺病毒骨架载体pAd/PL-DEST进行LR重组,经氨苄青霉素及氯霉素抗性筛选后成功获得3个重组腺病毒载体,ScaⅠ酶切鉴定及测序分析证实所构建的重组腺病毒载体中插入序列与设计序列一致。重组腺病毒载体经PacⅠ酶切线性化后,利用Lipofectamine 2000转染HEK 293细胞,10~12 d后收集病毒,在HEK 293细胞中反复扩增3次后,获得高滴度的重组腺病毒,利用TCID50法测定重组腺病毒滴度分别为6×108PFU/mL(表达shRNA-5544序列)、5×108PFU/mL(表达shRNA-5936序列)及6×108PFU/mL(表达shRNA-NC序列),为进一步在原代培养的山羊乳腺上皮细胞中进行FAS基因的RNA干扰研究奠定基础。     

Myristic Acid (MA) Promotes Adipogenic Gene Expression and the Differentiation of Porcine Intramuscular Adipocyte Precursor Cells

Intramuscular fat (IMF) content is considered to be a key factor that affects the marbling, tenderness, juiciness and flavor of pork. To investigate the effects of myristic acid (MA) on the differentiation of porcine intramuscular adipocytes, cells were isolated from longissimus dorsi muscle (LDM) and treated with 0, 10, 50 or 100 μmol L-1 MA. The results showed that MA significantly promotes the differentiation of intramuscular adipocytes in a dose-dependent manner. MA also led to a parallel increase in the expression of peroxisome proliferator activated receptor-γ (PPARγ) and adipose-related genes, such as glucose transporter 1 (GLUT1), lipoprotein lipase (LPL), adipocyte fatty acid binding protein 4 (FABP4/aP2), fatty acid translocase (FAT), acetyl-CoA carboxylase α (ACCα), adipose triglyceride lipase (ATGL) and fatty acid synthase (FASN). However, no significant effects of MA were observed on the expression of CAAT enhancer binding protein-α (C/EBPα) or hormone sensitive lipase (HSL). The expression of pyruvate dehydrogenase kinase 4 (PDK4) was increased by MA during the early stages of differentiation (day 1-3). In addition, MA also increased the absolute content of C14 (P<0.001) and saturated fatty acids (SFA) (P<0.05) to varying degrees, but no effects were observed on other fatty acids. These results suggest that MA might be able to enhance the IMF content of pork and increase the accumulation of myristic and myristoleic acid in muscle, which might have beneficial implications for human health.     

黄花蒿醇提物对奶牛乳腺细胞中共轭亚油酸 合成相关酶基因表达的作用

目的 通过奶牛乳腺上皮细胞体外培养试验,研究黄花蒿乙醇提取物对乳腺上皮细胞中与共轭亚油酸（CLA）合成相关酶的基因SCD表达的影响,探讨其对乳脂肪合成相关酶ACACA和FASN基因以及与脂肪转运相关酶LPL基因表达的影响,旨在从乳腺层次探明黄花蒿乙醇提取物对乳中CLA合成的部分作用机制。方法 将采自于健康泌乳中期荷斯坦奶牛的乳腺组织用保温盒带回实验室,在无菌条件选取腺泡较多的深层组织,采用胶原酶消化法获得乳腺上皮细胞,放于37℃,CO₂浓度为5%的培养箱中进行原代培养。试验所用的细胞是经过复苏的第二代细胞,待细胞复苏后,以3×10 ⁴个/mL的密度接种细胞到24孔板中,分别置于37 ℃的5% CO₂培养箱中培养,采用台盼蓝计数法每天进行一次计数,设3个重复,连续7 d,未计数组每2天换液一次,绘制细胞生长曲线。另外,待细胞生长至对数增殖期,更换新鲜培养液,随机分为4组,即培养液中黄花蒿提取物的浓度为0、3.0、6.0、12.0 mg·L ^-1 ,提取物作用时间均为48 h,检测不同浓度黄花蒿提取物对与脂肪酸合成相关酶SCD、ACC、FAS、LPL 基因表达量的影响。每个处理3个重复。结果 使用倒置显微镜观察,乳腺上皮细胞形态呈铺路石样;在3×10 ⁴个/mL的接种密度下,细胞生长曲线呈S型,在1—2d乳腺上皮细胞为潜伏期,3—6d为指数增长期,之后进入平台期,符合一般细胞生长曲线规律,说明培养的乳腺上皮细胞具有正常的增殖能力,可以用于后续的研究;与对照组相比,添加黄花蒿乙醇提取物有增加SCD酶基因表达量的趋势,其中3mg·L ^-1组显著增加了SCD酶的基因表达量(P<0.05),而6 mg·L ^-1组和12mg·L ^-1组虽然增加了SCD酶的基因表达量,但与对照组相比差异不显著(P>0.05);添加黄花蒿乙醇提取物有增加乳腺上皮细胞中ACACA基因表达量的趋势,但与对照组相比差异不显著(P>0.05),且随着添加剂量的增加,有下降趋势;添加黄花蒿乙醇提取物可以增加乳腺上皮细胞中FASN基因表达量,呈剂量依赖型增加,且12mg·L ^-1组可以显著增加乳腺上皮细胞中FASN基因表达量(P<0.05);添加黄花蒿乙醇提取物有降低乳腺上皮细胞中LPL基因表达量的趋势,呈剂量依赖型降低,且6 mg·L ^-1组和12mg·L ^-1组显著降低了乳腺上皮细胞中LPL基因表达量(P<0.05)。结论 黄花蒿乙醇提取物可以增加奶牛乳腺上皮细胞中SCD、ACACA和FASN酶基因的表达,有利于调控CLA和乳脂肪的生成。     

Hepatic Lipogenesis Associated with Biochemical Changes in Overfed Landaise Geese and China Xupu Geese

This experiment studied hepatic lipogenesis associated with biochemical changes in overfed Landaise Geese and China Xupu geese. Twenty healthy male Landaise geese and 20 healthy male Xupu geese, hatched on the same day under the same feeding conditions, were selected as experimental animals. The animals were divided into two groups and each breed served as an experimental group. Per goose of per experimental group served for a repeat. Brown rice was selected as test diet. After overfeeding for 21 d and then slaughtering, the biochemical changes of hepatic lipogenesis in the genetic susceptibility to fatty liver were evaluated. These results showed that （1） the weight of fatty liver of the two breeds of geese were 801 and 375 g （P〈0.05）, respectively. There were no differences on the abdominal fat pat, filet total and filet pectoralis major in the two breeds experimental of the geese group （P〈0.05） and no difference on body and filet skin plus subcutaneous adipose tissue （P〉0.05） was found; （2） in these two breeds of geese, there were no differences on very-lowdensity lipoprotein （VLDL）, cholesteryl esters （CE） （P〈0.05）, free cholesterol （FC）, triglycerides （TG）, phospholipids （PL） and protein （P 〈 0.05）; （3） there were no differences on activities of malic enzyme （ME）, glucose-6-phosphatedehydrogenase （G6PDH）, acetyl-CoA-carboxylas （ACX）, fatty acid synthase （FAS）, and mRNA level of ME in the two experimental breeds of geese groups （P 〈0.05）; （4） test in Landaise geese group showed that there was no significant correlation with the specific enzymatic activities, while in Xupu geese group, the liver weight was negatively correlated to the specific activity of ACX and positively to that of ME; （5） in these overfed geese, ME activity appeared to be a major factor involved in the genetic susceptibility to hepatic steatosis and it determined the hepatic lipogenesis capacity.     

Architecture of mammalian fatty acid synthase at 4.5 A resolution

The homodimeric mammalian fatty acid synthase is one of the most complex cellular multienzymes, in that each 270-kilodalton polypeptide chain carries all seven functional domains required for fatty acid synthesis. We have calculated a 4.5 angstrom-resolution x-ray crystallographic map of porcine fatty acid synthase, highly homologous to the human multienzyme, and placed homologous template structures of all individual catalytic domains responsible for the cyclic elongation of fatty acid chains into the electron density. The positioning of domains reveals the complex architecture of the multienzyme forming an intertwined dimer with two lateral semicircular reaction chambers, each containing a full set of catalytic domains required for fatty acid elongation. Large distances between active sites and conformational differences between the reaction chambers demonstrate that mobility of the acyl carrier protein and general flexibility of the multienzyme must accompany handover of the reaction intermediates during the reaction cycle.     

高低肌内脂肪猪背最长肌关键基因表达差异分析

【目的】筛选出高肌内脂肪(Intramuscular fat,IMF)沉积的关键基因并进行表达验证,为揭示猪肌内脂肪沉积的分子调控机制提供理论依据。【方法】根据NCBI-GEO数据库中高、低肌内脂肪巴克夏群体的转录组数据,利用DESeq2进行差异表达基因筛选(|log₂Fold Change|≥1,FDR<0.05),采用Metascape对差异表达基因进行功能富集分析,通过MCODE筛选及鉴定出高肌内脂沉积的关键基因,并采用实时荧光定量PCR在地方猪(柯乐猪)和外种猪(杜长大猪)上进行关键基因表达量验证。【结果】从高、低肌内脂肪巴克夏群体6个文库中共鉴定出7661个基因,高肌内脂肪群体样本的脂质代谢相关基因总表达量显著高于低肌内脂肪群体样本(P<0.05,下同),其中差异表达基因有133个[110个上调(在高肌内脂肪群体高表达),23个下调(在低肌内脂肪群体高表达)]。上调差异表达基因主要富集于胶原蛋白绑定、细胞外基质组装、脂肪酰辅酶A生物合成过程、固醇代谢过程和脂质代谢调控过程等GO功能条目,以及脂肪乙酰辅酶A生物合成、ChREBP激活代谢基因、脂肪酸代谢等信号通路上;下调基因主要富集于线粒体组装、多细胞生物学过程、辅酶绑定和缺氧反应等GO功能条目,以及基于NFKB的TNFA信号、白细胞介素4和白细胞介素13信号和干扰素信号等信号通路上。通过MCODE分析共筛选获得5个关键基因,分别是SLC25A5、FN1、FASN、ACACA和PRKDC基因;挑选SCD、FASN和ACACA基因进行表达量验证,结果发现这3个基因的相对表达量均表现为柯乐猪高于杜长大猪,其差异达显著或极显著(P<0.01)水平,进一步佐证SCD、FASN和ACACA基因在高肌内脂肪猪群体中高表达。【结论】在巴克夏猪高肌内脂肪群体中高表达的SCD、FASN和ACACA基因,在高肌内脂肪的柯乐猪中也呈显著或极显著高表达,因此这3个关键基因有望作为筛选和培育高肌内脂肪猪品种的分子标记,同时为研究肌内脂肪沉积的分子调控机制提供技术支撑。