火炬松热胁迫cDNA文库的EST-SSR预测

以火炬松热胁迫cDNA文库的EST序列为材料,对EST序列进行聚类、拼接等处理后,再进行EST-SSR标记的预测.结果表明:火炬松热胁迫eDNA文库4 283条EST序列经CAP3拼接后,获得2 062个UniGene,其中934个Contig,1 128个Singletons.对UniGene利用SSRIT在线软件分析得到110条EST-SSR.拼接后的UniGene含有SSR位点的频率为4.32%,SSR在火炬松EST上的分布密度为每14.6 kb出现1个SSR.这些EST重复基元中,二核苷酸重复和三核苷酸重复最多,分别占60.90%和36.36%;四、六核苷酸重复分别占0.91%、2.73%;没有五核苷酸的重复基序.所有的核苷酸重复基元中,二核苷酸AT所占比例最高,约占42.73%;三核苷酸重复中,比例最高的是AAG和AGG,均占7.33%.上述研究结果对于开发火炬松新分子标记与开展分子辅助育种的研究具有一定的指导意义.     

辣椒EST-SSR信息分析及标记开发

利用SSRIT软件从NCBI数据库中19 173条辣椒EST序列中筛选到612个SSR,检出率为3.19%。共观察到51种重复基元,其中三核苷酸基序是主导类型,占总SSR的60.46%;AG/GA/CT/TC,AAG/AGA/GAA/CTT/TTC/TCT,TAAT,ATATA和CTGCTC分别是二、三、四、五和六核苷酸基序的优势重复基序,在所有SSR中的出现频率各自为13.40%、16.18%、1.80%、3.27%及2.12%。辣椒EST-SSR以5~10次重复为主,基序长度集中在15~20 bp范围内。利用含SSR的576条EST序列共设计357对引物,在合适的PCR条件下337(94.40%)对引物显示出清晰条带,75对(21.01%)引物表现多态性,表明EST-SSR标记在辣椒遗传分析与应用中是有价值且可行的。     

黑麦草EST-SSR分子标记开发及生物信息学分析

为加速分子标记在黑麦草中的应用,利用黑麦草EST数据库(Gen Bank/db EST)开展了黑麦草EST-SSR信息分析、标记开发和EST功能分析研究。在25 752条黑麦草EST序列中,共发现346条SSR序列,占整个EST总数的1.344%。其中,三核苷酸基序最多(39.60%),次之为二核苷酸基序(31.79%)。三核苷酸基序以GGC/CCG出现频率最高,为8.38%,其次是CGC/GCG(7.51%)、GCC/CGG(4.05%)和ATG/TAC(2.02%),二核苷酸基序以CT/GA出现频率最高(14.45%),其次是GA/CT(10.98%)。根据这些含有SSR的EST序列,利用Primer Premier 5.0软件,对346条EST-SSR序列进行引物设计,共设计引物193对,其中分值在90分以上的有113对(32.66%)。利用Gen Bank的Blast N和Blast X程序对相应113条EST进行功能分析,72条EST序列与51种具有生物学功能的蛋白质同源。     

胡桃EST-SSR标记的筛选及引物设计

[目的]筛选胡桃的EST-SSR分子标记并对其进行引物设计。[方法]利用生物信息学方法对NCBI网上公开的5213条胡桃（Juglans regia Linn.）ESTs序列进行EST-SSR特征分析,利用利用Primer3.0软件对筛选出的EST序列设计引物。[结果]在ESTs序列中共检索出207个SSR,其中无冗余序列188,检出率为3.97%,平均分布距离为21.12kb,包括92种重复基元,其中以二核苷酸和三核苷酸重复类型为主,分别占总数目的31.40%和35.27%;对随机筛选出的50条SSR引物进行PCR扩增验证,初步筛选出30对引物。[结论]通过对胡桃EST序列中SSR位点的发掘分析,有针对性地设计EST-SSR引物,将为胡桃科EST-SSR分子标记的开发奠定基础。     

荔枝EST资源的SSR信息分析及EST-SSR标记开发

 【目的】明确荔枝EST序列中SSR的总体特点,开发荔枝EST-SSR引物,为利用EST-SSR分子标记进行荔枝种质资源遗传多样性、连锁图谱构建及亲缘关系研究奠定基础。【方法】应用SSRIT软件,按照设定标准从自行构建的一个荔枝果皮发育关键期的cDNA文库中的1 331条Unigene（惟一序列）中搜索SSR位点。利用软件Primer primer5.0设计EST-SSR引物。选用16份表型差异较大的荔枝种质资源检测引物的有效性及多态性,利用聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)进行片段分离。【结果】荔枝的1 331条EST序列中共搜索出220个SSR位点,分布于189条EST中,出现频率是16.53%。这些EST-SSR的平均长度为18.43 bp,平均分布频率1/4.42 kb。在1—6 bp的重复基元中,二核苷酸和三核苷酸重复类型占主导地位,共占总SSR的69.09%,二者出现的频率分别为37.27%和31.82%。共观察到72种重复基元,出现频率最高的是GA/TC（16.82%）;其次是AG/CT、A/T、AT/TA及GAA/TTC,频率分别为14.55%、11.82%、5.00%和3.64%。不同核苷酸数目的重复基元的重复次数差异很大。设计、合成150对EST-SSR引物,122对（81.33%）引物在荔枝中获得有效扩增,100对引物具有多态性。【结论】荔枝EST资源中含有高频率的SSR位点,且EST-SSR 标记开发效率较高。本研究为利用EST-SSR标记开展荔枝遗传研究提供了100 对EST-SSR引物,并为进一步开发荔枝EST-SSR标记提供了含SSR位点的候选序列。     

辣椒EST-SSRs分布特征及其应用

从NCBI数据库获得116 952条辣椒ESTs序列,通过软件除去赝象序列后得86 496条非冗余序列,利用SSRLoctor软件分析后共发现1 736个微卫星分布于1 658条ESTs序列中,EST-SSRs序列出现频率为1.92%。在辣椒EST-SSRs中,二核苷酸重复类型出现频率最高,占总SSR的56.4%,其次是三核苷酸重复类型,占总SSR的23.3%。共检测到149种基序重复类型,重复基序出现频率最高的为GA/TC,AG/CT次之。1 658条EST序列中可设计出引物810对,功能注释结果表明,具有生物进程、细胞组成和分子功能的EST序列分别为297条、271条和316条。随机选择100对EST-SSR引物对17份辣椒材料进行遗传多样性分析,结果表明,80对EST-SSR引物能够得到有效扩增,其中46对引物表现出多态性扩增,每对引物检测到等位基因数1~3个,平均1.9个。经由NT-SYS2.10软件聚类,在相似系数为0.718时,供试的17份辣椒种质资源分为6个亚类,表明开发的EST-SSR可用于辣椒种质资源遗传多样性分析。     

苦荞转录组EST-SSR发掘及多态性分析

利用Misa软件对苦荞种子转录组高通量测序获得的45 699条EST序列进行了SSR位点扫描,共得到2 700个SSR位点,分布于2 624条EST序列中,SSR位点平均距离为1/1.73 kb。随着EST序列长度的增加,含SSR位点序列的比例也随之升高,800 bp以上EST序列含SSR的比例明显高于800 bp以下序列。单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重复是苦荞EST-SSR主导类型,分别占总SSR的52.11%、13.33%和30.63%,其中(A)n、(AG)n和(AAG)n是单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸的优势重复基序,分别占总SSR的51.85%、7.11%和8.93%。设计合成了150对 EST-SSR 引物,其中91对引物（60.67%）在40份苦荞种质中获得有效扩增,30对引物（32.97%）具有多态性。平均每对引物能检测到3.53个等位变异;多态信息含量（PIC）在 0.10~0.71之间,平均达0.40。以上结果说明,从苦荞转录组EST序列中大规模开发SSR标记是一条简便而可行的途径。     

鹰嘴豆EST资源中SSR的信息分析

从NCBI公共数据库下载获得27 904条鹰嘴豆表达序列标签EST,去除其中低质量的和冗余序列后得到全长为6 198 092 bp的11 224 条无冗余EST.利用SSRIT(Simple sequence repeat identification tool)软件共在这些序列中发掘出982个SSR,它们分布于865条EST中,出现频率为8.69%,平均长度为15.58 bp,平均距离为6.31 kb.在鹰嘴豆EST-SSR中,二核苷酸重复是最主要的重复类型(66.90%),其次是三核苷酸重复类型(30.75%),出现最多的重复基元类型是TA/AT(24.95%).     

鹰嘴豆EST资源中SSR的信息分析

从NCBI公共数据库下载获得27904条鹰嘴豆表达序列标签EST,去除其中低质量的和冗余序列后得到全长为6198092bp的11224条无冗余EST.利用SSRIT(Simple sequence repeat identification tool)软件共在这些序列中发掘出982个SSR,它们分布于865条EST中,出现频率为8.69%,平均长度为15.58bp,平均距离为6.31kb.在鹰嘴豆EST-SSR中,二核苷酸重复是最主要的重复类型(66.90%),其次是三核苷酸重复类型(30.75%),出现最多的重复基元类型是TA/AT(24.95%).     

猕猴桃EST序列的SSR信息分析

[研究目的]通过筛查猕猴桃EST数据库中的SSR重复序列,可为开发出新型的猕猴桃EST-SSR标记和分子生物学研究奠定理论基础;[方法]从NCBI公共数据库中最新公布的猕猴桃表达序列标签(Expressed Sequence Tag,EST)中随机抽取56400条序列,应用SSRHtmter软件查找微卫星(Microsatellite,SSR)重复序列;[结果]研究结果表明,从猕猴桃EST序列中获得了7939条SSR,其中包括二核苷酸重复5131条(64.63%),三核苷酸重复1237条(15.58%),四核苷酸重复284条(3.58%),五核苷酸重复397条(5.00%),六核苷酸重复890条(11.2l%).在二核苷酸重复序列中,AG/CT共分布4654条(90.70%).大约每2.48 kb长度的单一基因序列中即存在1个SSR,即平均7个单一基因中存在1个SSR;[结论]在猕猴桃EST序列中,二核苷酸重复序列是最丰富的重复单元,其次为三核苷酸重复和六核苷酸重复.在所获得的SSR重复单元中,AG/CT为优势重复.     

胡桃EST-SSR标记的筛选及引物设计

[目的]筛选胡桃的EST—SSR分子标记并对其进行引物设计。[方法]利用生物信息学方法对NCBI网上公开的5213条胡桃（Jug—lans regia Linn．）ESTs序列进行EST—SSR特征分析,利用Primer3．0软件对筛选出的EST序列设计引物。[结果]在ESTs序列中共检索出207个SSR,其中无冗余序列188,检出率为3．97％,平均分布距离为21．12kb,包括92种重复基元,其中以二核苷酸和三核苷酸重复类型为主,分别占总数目的31．40％和35．27％;对随机筛选出的50条SSR引物进行PCR扩增验证,初步筛选出30对引物。[结论]通过对胡桃EST序列中SSR位点的发掘分析,有针对性地设计EST．SSR引物,将为胡桃科EST—SSR分子标记的开发奠定基础。     

桑树EST—SSR引物开发

【目的】利用桑科的EST数据库进行桑树EST—SSR引物开发,为丰富桑树SSR数据库提供参考。【方法】下载NCBI中桑科的EST数据库,进行序列处理及拼接后,用SSRIT搜索其中的SSR位点,以Primer Premier 5．0设计引物,选用5个桑树品种各5株样品进行多态性引物筛选。【结果】下载的EST拼接后得到2008条拼接片段（contig）,共搜索到831个SSR位点,分布在799个contig中。二、三核苷酸重复基元是主导类型,分别占总SSR的66．06％和32．37％;TC／AG和CT／GA是二核苷酸优势重复基元,分别占二核苷酸总数的28．64％和25．87％。设计合成77对EST—SSR引物,其中46对能够扩增出有效条带;经多态性筛选,26对引物可扩增出多态性条带。【结论】利用桑属近缘属的EST序列进行桑树EST—SSR引物的开发是可行的;开发出的26对多态性引物可用于桑树遗传多样性分析和种质鉴定等。     

基于山茶转录组的SSR标记开发及亲缘关系分析

【目的】开发基于山茶转录组的EST-SSR分子标记,并应用该标记进行山茶种质的亲缘关系分析。【方法】本研究以山茶叶片转录组测序所获得的50 518条Unigenes为背景数据,利用MISA软件搜索SSR标记,设计并筛选SSR多态性引物,对8份山茶种质进行了UPGMA聚类。【结果】共检索到13 197个SSR位点,SSR的发生频率和分布频率分别为19.52%、26.12%,平均分布距离为4.33 kb;在6种SSR重复类型中,以单、二、三核苷酸这3种重复类型为主,分别占48.420%、34.917%和15.473%;出现频率高的基序类型为A/T、AG/CT和AT/TA,占总SSR位点的79.61%;三核苷酸中以AAG/CTT、ACC/GGT、AAT/ATT类型居多;在设计出的10 974对引物中,随机选用其中90对引物进行多态筛选,73对引物扩增产物与预期大小一致,有效扩增率为81.11%,29对引物存在扩增多态性,占39.73%。扩增得到72个等位基因,有效等位基因数平均达到3.264;观察杂合度和期望杂合度的平均值分别为0.208和0.638,引物多态信息含量平均为0.496;8份山茶种质在相似系数为0.58时,可以分为4类:山茶原种为Ⅰ类,‘黑蛋石’、‘红叶黑魔法’和‘黑骑士’为Ⅱ类,‘黑魔法’和‘金华美女’分别为Ⅲ类和Ⅳ类。【结论】山茶转录组测序的Unigenes信息可作为SSR标记开发的有效来源,为山茶的遗传多样性研究、亲缘关系鉴定以及分子标记辅助育种等奠定了一定的理论基础。      

草莓EST中SSR位点分析

[目的]从现有的草莓EST数据中获取有效的微卫星标记。[方法]利用MISA（Microsate llite）软件分析简单重复序列（Simple se-quence repeat,SSR）在草莓EST中的分布频率与密度,用CAP3软件进行冗余分析。[结果]在17565条EST序列中,共获得10129条SSR序列,SSR之间的距离约为0.90kb。其中,六碱基重复丰度最大,占61.0%,而三碱基、单碱基、二碱基、四碱基和五碱基重复丰度分别为14.3%、13.1%、6.2%、4.3%和1.1%。在单碱基、二碱基、三碱基和四碱基重复模体中,丰度最大的分别是A/T、AG、AAG和AAAG,而CG在编码区内没有。在这6种类型的重复模体中,冗余与非冗余的草莓EST之间没有显著差异。[结论]从现有的草莓EST数据中可以方便地获取有效的微卫星标记。     

黄瓜EST-SSR位点信息

从NCBI网站下载6344条黄瓜EST,通过前处理得到全长为2．91×10^6bp的无冗余EST6033条。利用SSRHunt-er软件从这些序列中搜寻到729个SSR,分布于667条EST中,出现频率为12．08％,分布频率为1／3．99kb。单、二和三核苷酸重复是主导类型,三者共占总数的89．71％。A／T、AG／CT和AAG／CTT分别是单、二和三核苷酸的优势重复基元,分别占总数的29．77％、21．12％和14．95％。黄瓜EST-SSR以4～10次重复为主,基序长度主要集中于12～20bp。最后对这些EST-SSR的多态性潜能进行了评价。     

生菜EST-SSR的分布特征分析

从NCBI数据库下载了81518条生菜EST序列,处理后得到无冗余序列61757条,共搜索到2040个SSR位点,出现频率为3.3%。三碱基重复是主要的类型,占38.53%,其次是二碱基和六碱基重复,出现次数最低的是四碱基重复。在181种重复基元类型中,(AGA)n和(ATG)n是主导的重复基元类型,分别占12.01%和3.53%。设计合成的30对引物在50份生菜资源进行鉴定,共筛选出4个材料特异性标记。该研究为后续开发生菜多态性 EST-SSR标记,进行种质资源鉴定、分子标记辅助育种、遗传图谱构建奠定了基础。     

猕猴桃EST序列的SSR信息分析（摘要）

[目的]通过筛查猕猴桃EST数据库中的SSR重复序列,为开发出新型的猕猴桃EST-SSR标记和分子生物学研究奠定理论基础。[方法]从NCBI公共数据库中最新公布的猕猴桃表达序列标签（Expressed Sequence Tag,EST）中随机抽取56 400条序列,应用SSRHunter软件查找微卫星（Microsatellite,SSR）重复序列。搜索的标准是：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最少重复次数分别为7次、5次、4次、4次、3次,包括复合型微卫星。微卫星的重复次数越多,相应的检验出等位基因数目就越多。[结果]从猕猴桃EST序列中获得了7 939条SSR,其中包括二核苷酸重复5 131条（64.63%）,三核苷酸重复1 237条（15.58%）,四核苷酸重复284条（3.58%）,五核苷酸重复397条（5.00%）,六核苷酸重复890条（11.21%）。大约每2.48 kb长度的单一基因序列中即存在1个SSR,即平均7个单一基因中存在1个SSR。在二核苷酸重复序列中,AG/CT共分布4 654条（90.70%）。在三核苷酸中,较为丰富的3种重复基元是ACC/GGT,AAG/CTT和CGC/GCG,共分布817条,它们占三核苷酸重复中各重复基元的66.04%。在其他基元中,还包括AGG/CCT,AGC/GCT,AAC/GTT,ATC/GAT,AGT/ACT,CGA/TCG,AAT/ATT7种重复基元,共420条SSR序列,占33.96%。AGT与CGT重复基元未见分布。[结论]在称猴桃EST序列中,二核苷酸重复序列是最丰富的重复单元,其次为三核苷酸重复和六核苷酸重复。在所获得的SSR重复单元中,AG/CT为优势重复。     

基于甘薯耐盐转录组测序的SSR和SNP特征分析

旨在对甘薯耐盐转录组中潜在的SSR和SNP位点进行挖掘及特征分析，以完善甘薯分子标记。试验以不同耐盐甘薯品种的转录组序列为基础，利用MISA、GATK软件分析了转录本中的SSR和SNP信息。结果显示，研究共获得SSR位点33192个，分布在24323条Unigenes中，出现频率为21.11%。其中，6271条Unigenes含有超过1个以上的SSR位点。SSR类型以单核苷酸重复SSR和双核苷酸重复SSR为主。在重复基元中，A/T和AG/CT所占的比例最高，为优势基元。在157252条Unigenes中共挖掘到SNP位点7691906个，分布密度为0.08个/bp。其中转换类型有4729922个，颠换类型有2961984个。在所有突变类型中，C/T和A/G含量最高，分别为占总数的32.34%和29.15%。综上所述，甘薯转录组具有较丰富的SSR和SNP标记，多态性较高，可为甘薯抗逆品种筛选、种质培育等研究奠定理论基础。