根癌农杆菌介导的淡紫拟青霉遗传转化体系的建立

基于根癌农杆菌介导的遗传转化方法,选择植物线虫生防真菌淡紫拟青霉的分生孢子为受体,建立以G418为筛选标记遗传转化体系.通过优化遗传转化条件,达到较高的转化效率:1000～2400个转化子·10-6分生孢子.对转化子进行PCR验证,表明T-DNA已整合到淡紫拟青霉的基因组中,表型测定发现转化子的遗传表现稳定.农杆菌介导淡紫拟青霉突变体库的建立,为进一步筛选对植物线虫致病性高的突变体、了解淡紫拟青霉的侵染过程和侵染机制提供基础,对培育更优良的植物线虫生防菌株,开发高效生防制剂等具有重要的意义.     

南方四季杨高效遗传转化体系的建立

以南方四季杨叶片作为受体材料,分别设置梯度实验,研究了Kan(卡那霉素)选择压以及遗传转化过程中影响转化效率的5个主要因素(预培养时间、浸染时间、共培养温度、共培养时间和乙酰丁香酮浓度),得出30mgL-1的Kan浓度作为南方四季杨遗传转化过程中的选择压。高效遗传转化体系为:叶片预培养3 d;OD600=0.4的菌液浸染10 min～15 min;浸染前菌液中加入AS(乙酰丁香酮)300 umol·L-1;22℃～25℃条件下暗处共培养3d。     

淡紫拟青霉T-DNA插入突变体的表型分析

研究淡紫拟青霉T-DNA插入突变体,鉴定突变体的表型特征,为淡紫拟青霉致病机制分析及致病相关的基因克隆奠定基础。PCR检测筛选的14株T-DNA插入突变体,观察和测定菌落形态,菌落生长速率,产孢量,孢子萌发率和菌丝干质量等生物学性状,并比较突变体致病力。结果表明突变体均含有beta-tubulin基因序列,T-DNA已整合进入野生型菌株20-7的基因组中。通过与野生型菌株对比,发现突变体菌落形态发生了不同程度的改变。菌落生长速率明显增大的菌株占全部菌株的85.71%,只有BN-11菌株的菌落生长速率降低。产孢量显著变大的菌株有BN-11和BN-12,为菌株总数的14.29%。孢子萌发率发生改变的菌株占78.57%。菌丝干质量发生明显增大和减少的菌株都占全部突变体的21.43%。筛选获得了1株致病力增强的突变体BN-11和11株致病力显著降低的突变体。     

山新杨遗传转化体系的优化及转MnSOD基因植株的鉴定

为建立农杆菌介导的山新杨高效遗传转化体系,对MnSOD基因导入山新杨的遗传转化体系进行了优化,获得的较优转化体系如下:菌液浓度OD600=0.1,浸染2~5 min,共培养时加入200μmol/L乙酰丁香酮,脱菌时加入3 mg/L的AgNO3;对部分抗性植株经PCR及Northern杂交检测,证明MnSOD基因已经整合到山新杨基因组中并能够在转录水平上表达。     

一株淡紫紫孢菌12ID-1的分离及其对埃及吹绵蚧的致病性

从埃及吹绵蚧虫（Icerya aegyptiaca）体中分离出一株虫生真菌菌株 12ID-1，对其进行了形态观察和 rDNA ITS 序列分析，同时优化了该菌株的产孢条件和测定了其不同浓度的孢子悬浮液对埃及吹绵蚧 2 龄若虫的致病性。结果表明：根据形态特征和分子鉴定结果，该菌株 12ID-1 为淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）；菌株 12ID-1 在 SMAY 培养基、28 ℃和光暗交替（14 L : 10 D）的条件下产孢能力最强；致病性结果表明，当孢子浓度高于 1×106 孢子 /mL 时，随着 12ID-1 孢子浓度的增加，埃及吹绵蚧的校正死亡率越高，LT50 值递减，在孢子浓度为 1×108 孢子 /mL 时，第 7 天校正死亡率接近 100%， LT50 为 3.99 d；随着接种后时间的延续，LC50 值递减，在接种后 7 d，LC50 值为 1.3×106 孢子 /mL。可见淡紫紫孢菌 12ID-1 对埃及吹绵蚧具有较强的毒力，在埃及吹绵蚧生物防治中具有广阔的应用前景。     

均匀设计在南林95杨叶片遗传转化体系优化中的应用

为优化南林95杨叶片遗传转化体系,以南林95杨叶片为外植体,采用均匀设计U12(12×63),利用组织化学染色定位法,根据GUS基因的瞬时表达量,研究了农杆菌浸染时间、农杆菌菌液OD600值、共培养时间、乙酰丁香酮浓度等4个因素对遗传转化的影响。建立相关的线性回归方程,并优化了南林95杨叶片的农杆菌介导遗传转化体系,即农杆菌浸染时间35 min、农杆菌OD600值1.1、共培养时间4 d。     

农杆菌介导的异角状拟盘多毛孢菌T-DNA转化子生物学特性分析

从根癌农杆菌介导的异角状拟盘多毛孢菌菌株的转化子库中筛选出15株形态特征变化显著且遗传稳定的转化子,并从中挑选3株转化子进行Southern blot检测,证实了转化子基因组DNA中含有T-DNA插入片段.分别对15株转化子的菌落形态、菌落生长速度、产孢量、致病性等进行分析,结果表明,部分转化子的生物学特性发生了显著变化,为探讨异角状拟盘多毛孢菌的致病机制和致病基因克隆等提供了理论依据.     

赤水撑绿竹根腐病菌室内药剂筛选

采用生长速率法和悬滴法测定了8种常用杀菌剂对赤水撑绿竹Bambusa pervariabilis×dendrocalamopsis daii根腐病病原菌尖孢镰孢菌Fusarium oxysporum Schlecht菌丝生长和孢子萌发的抑制作用,并测定了杀菌剂对尖孢镰孢菌的毒力。结果表明,各杀菌剂对菌丝生长和孢子萌发有不同程度的抑制作用,其中70%敌磺钠WP、3%广枯灵AS能很好地抑制菌丝生长,而70%敌磺钠WP、3%广枯灵AS、70%甲基硫菌灵WP、10%苯醚甲环唑WG对孢子萌发有较强的抑制作用,抑制率均在80%以上。对菌丝生长与孢子萌发均有明显作用的杀菌剂为70%敌磺钠WP、3%广枯灵AS。毒力测定结果表明,70%敌磺钠WP、3%广枯灵AS对尖孢镰孢菌的毒力最高,其EC50分别为0.072 5,0.112 6μg/mL、其次为70%甲基硫菌灵WP和10%苯醚甲环唑WG,其EC50分别为7.8216,7.318 7μg/mL。其余几种药剂的毒力较差。8种药剂的相关系数均在0.98以上,药剂浓度与抑制作用呈正相关。     

湿地松枯梢病菌生物学特性的研究

松色二孢菌引起湿地松枯梢病。病菌在ＰＤＡ培养基上生长最好，最适温度为２５－３１℃，在全光照条件下生长最快，子实体最早形成。分生孢子在１０％的湿地松和油松针叶浸汁中萌发最好，６ｈ萌发率达９０％以上，萌发的最适温度为２５－３０℃；最适ｐＨ值为６～７；在水滴中纟在饱和湿度下萌发率高；光照对分生孢子萌发几乎显显著影响。     

国槐遗传转化体系的优化

采用根癌农杆菌介导的国槐叶盘转化法,在建立修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)转化体系过程中,对影响农杆菌转化频率的各种因素进行研究.结果表明:国槐叶片需在黑暗条件下在MS培养基上预培养5天,农杆菌菌株选用GV3101,农杆菌共培养3天较合适;农杆菌菌液浓度OD600约为0.7,感染时间10 min;侵染前的菌液和共培养基中添加200/μmol·L-1乙酰丁香酮(AS)对国槐遗传转化有明显的促进作用;抑制农杆菌生长的抗生素浓度以头孢霉素(Cef)500mg·L-1最好.PCR和Southern blotting检测证实sck基因已整合到国槐基因组中.     

圆柏锈病—胶锈菌的重寄生菌研究及应用

本文报道了圆柏胶锈菌（ Ｇｙｍ ｎｏｓｐ ｏｒａｎｇ ｉｕｍ ａｓｉａｔｉｃｕｍ ， Ｇ． ｙａｍ ａｄａｉ）的重寄生菌柄锈生痤孢（ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎａ ｖｉｎｏｓａ）的寄生及形态特征。在 Ｐ Ｄ Ａ 上，该菌菌丝生长及产孢的适温２０℃～３０℃，适宜ｐ Ｈ６～９，荧光可促进产孢。田间接种该寄生菌于梨、苹、贴梗海棠、垂丝海棠等锈病菌上均表现了重寄生现象，其寄生率在梨、贴梗海棠及垂丝海棠达 ９０％ 以上；该寄生菌以分生孢子经气流传播，孢子萌发形成芽管从性子器和锈子器侵入，潜育期 ７ 天～１２ 天。自然条件下在其寄生部位越冬， Ｐ Ｄ Ａ 试管菌种在 １０℃以下保存 ５ 个月仍有 ８０％ 以上的孢子萌发率。该寄生菌的控病机制为阻断锈病的侵染循环，显示出生物防治的广阔前景。     

枣缩果病初侵染链格孢菌的抗硫酸铜标记及稳定性

【目的】建立枣缩果病菌链格孢菌的抗硫酸铜标记,为揭示链格孢菌在枣树上的侵染规律与深入掌握枣缩果病菌的致病机制和有效控制该病奠定基础。【方法】采用平板抑菌圈法,从硫酸铜、氯化钴、硝酸银和放线菌酮4种药剂中筛选出硫酸铜可以作为标记链格孢菌CN193菌株的药剂。应用孢子萌发抑制法,在凹玻片中按1∶1的比例放入1.0,1.5,2.0 mg·m L~(-1)硫酸铜与链格孢菌孢子悬浮液的混合液,培养12 h后通过孢子萌发抑制率确定硫酸铜的起始浓度。将培养基中硫酸铜的浓度由1.5 mg·m L~(-1)逐渐提高至4.5 mg·m L~(-1),以培养菌株对硫酸铜的抗性;选取单孢培养,得到稳定的抗硫酸铜突变体CN193Cur。通过喷雾和刺伤接种2种方法进行CN193Cur的田间致病性测定,并结合BOX-PCR指纹图谱分析技术,检测抗硫酸铜突变体CN193Cur菌株的稳定性及链格孢菌在枣树上的初侵染时期。【结果】硫酸铜对链格孢菌具有较好的抑制作用,氯化钴、硝酸银的抑制效果较弱,放线菌酮没有明显的抑制效果。硫酸铜初始浓度为1.5 mg·m L~(-1)时链格孢菌的突变率为12%,试验达到最高浓度为4.5 mg·mL~(-1);突变体CN193Cur与野生型菌株CN193具有相同的致病力;经致病性测定后的CN193Curp能够在含高浓度硫酸铜(4.5 mg·m L~(-1))的培养基上生长,野生型菌株则无法生长;突变体菌株CN193Cur在不含硫酸铜的PDA培养基上表现出比野生型菌株较快的生长速度;CN193Curp与室内筛选得到的突变体CN193Cur一样,都是链格孢菌CN193且其突变特征稳定。枣树花期接种链格孢菌能够发病,并再次在病果中分离到突变体菌株CN193Curp,说明链格孢菌在花期即能侵入枣树,致使枣果发病。【结论】硫酸铜抗性可以作为链格孢菌的稳定标记,为真菌和细菌抗药性标记的建立提供了理论依据;采用抗生素或化学药剂浓度递增的方法,可以有效地获得真菌和细菌的突变体,这为其他植物病原真菌或细菌侵染机制的研究提供技术支持;BOX-PCR指纹图谱分析技术可快速检测出真菌的多样性,能够较为有效地提供菌株的种内差异信息;CN193Cur具有稳定的突变特征及致病性,可以应用于对枣缩果病菌的侵染机制及致病机制的研究。     

我国杨生褐盘二孢菌菌株比较

从我国江苏、河南、山东、陕西、北京和吉林６个省（市）的不同杨树上收集了４２个杨生褐盘二孢菌标本，比较和分析了它们的分生孢子大小和形态，培养性状，致病性方面的差异；并观察了它们之间的菌丝融合情况。４２个菌株间的分生孢子平均长度、平均宽度和分隔位置存在差异不显著。菌株个体内单个分生孢子变异幅度很大。分离自白杨派杨树上的菌株孢子萌发时均产生一个芽管；在ＰＤＡ培养基上菌落生长速度较快（２５ｄ菌落直径在１ｃ     

暗孢耳霉侵染竹梢凸唇斑蚜的生物学特征及毒力测定

通过扫描电镜观察蚜科专化菌暗孢耳霉对竹梢凸唇斑蚜的侵染特征。孢子附着在蚜虫体表后可迅速萌发直接侵入虫体,24 h后即有蚜虫感病死亡。在寄主死亡6 h内,假囊状体先突破体壁,分生孢子梗随后出现,后者可通过产孢启动新一轮的侵染循环。毒力生物测定结果显示,暗孢耳霉对竹梢凸唇斑蚜具有高毒力。在高剂量接种浓度(192.6±20.3)个孢子· mm －2时,92.8%的接种蚜虫5天内死亡。经时间－剂量－死亡率模型分析,第5天的半致死浓度低至51.6个孢子· mm －2 ,半致死时间在接种浓度100个孢子· mm －2时仅为2.3 天。     

不同因素对农杆菌介导的杉木转化效率的影响

以杉木试管苗靠近茎尖的茎段为受体材料,研究6个影响杉木遗传转化效果的因素,初步确定杉木茎段较为合适的转化体系为:预培养1～3 d,OD600 nm为0.1～0.4的菌液浸染10～15 min,共培养3～5 d,共培养基附加乙酰丁香酮(AS)80 μmol·L-1,共培养后延迟3 d筛选.在初次筛选培养基上共得到186个卡那霉素(Km)抗性芽,在二次筛选培养基上获得39个Km抗性芽.PCR检测有2个Km抗性芽呈稳定阳性,初步证明外源天麻抗真菌蛋白(GAFP)基因已整合到这2个Km抗性芽的基因组DNA中.     

国外松枯梢病病原菌生物学特性研究

从形态特性、营养生长条件、分生孢子器及分生孢子产生和萌发条件四个方面研究松色二胞菌Diplodia pinea(Desm.)Kichx的生物学特性。该菌对营养生长条件要求不高,在1/2PDA培养基,温度25～26℃,相对湿度90%以上和pH5～6.5时生长最好。黑光灯和日光灯交替照射或全部黑光灯照射易产生分生孢子器和分生孢子,自然光下则难产生。温度24～26℃,相对湿度90%以上和pH6时利于产孢。诱导产生的分子孢子在清水中不能萌发,在1%的桔子晶水溶液中,25～26℃,pH6.5时萌发良好。越冬孢子于4月中下旬传播,5月中旬是发病盛期。     

撑×绿杂交竹梢枯病病原及发生规律研究

通过分离、接种、再分离首次证实杂交竹梢枯病的病原为暗孢节菱孢菌Arthrinium phaeospermum（Corda）M．B．Ellis。该病菌以菌丝体和子实体在病组织、病组织残体或土壤中越冬,其中病组织中菌丝体和子实体中的分生孢子为越冬的重要形式,是病害发生主要的初侵染源;病菌主要以分生孢子或菌丝通过伤口从节叉处侵入;病原菌主要通过孢子借助风力和雨水传播,从4月初开始释放孢子,6月为病原孢子释放的高峰期,并以分生孢子进行再侵染。     

几种药用植物抑菌活性的初步研究

以链格孢、尖孢镰刀菌、出芽短梗霉、灰葡萄孢为供试真菌,用生长速率法和孢子萌发法对8种药用植物提取物的离体活性物质进行测定。结果表明:在供试浓度为0.1g/mL时,对5种供试菌菌丝的抑制率:党生和黄芩达78%以上;苦参和生地为65%。苦参、党参和黄芩对5种供试菌的孢子萌发抑制率大于70%;尤其是党参、黄芩和苦参的提取液,对供试菌的菌丝生长和孢子萌发抑制率均大于70%。     

撑×绿杂交竹梢枯病病原及发生规律研究

通过分离、接种、再分离首次证实杂交竹梢枯病的病原为暗孢节菱孢菌Arthrinium phaeospermum(Corda)M.B.Ellis.该病菌以菌丝体和子实体在病组织、病组织残体或土壤中越冬,其中病组织中菌丝体和子实体中的分生孢子为越冬的重要形式,是痛害发生主要的初侵染源;病菌主要以分生孢子或菌丝通过伤口从节叉处侵入;病原菌主要通过孢子借助风力和雨水传播,从4月初开始释放孢子,6月为病原孢子释放的高峰期,并以分生孢子进行再侵染.     

正交设计在杨树最佳遗传转化体系的建立

本试验以建立的南林95杨高频再生体系为基础,利用正交试验设计,通过GUS组织染色分析法研究了预培养时间、茵液浓度、As浓度、侵染时间和共培养时间5个因素在4个水平上对南林95杨遗传转化的影响,并探讨了南林95杨转化中添加卡那霉素的适宜浓度。运用DPS软件对试验结果进行分析,建立了杨树遗传转化体系。结果表明：外植体预培养7d,在含As200μmol／L的茵液浓度为0．6的农杆菌液中侵染20rain,共培养3d为最佳遗传转化体系,适宜的卡那霉素筛选浓度为50mg／L;本试验共获得6株转化植株,经GUS染色检测和PCR分析表明．GUS基因已初步整合进入南林95杨基因组中。