水稻白叶枯病菌HD-GYP结构域蛋白PXO_03945的功能鉴定

为了揭示水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,简称Xoo)环二鸟苷酸(c-di-GMP)信号相关蛋白PXO_03945的生物学功能,本研究通过基因同源重组和无标记交换,对PXO_03945基因进行了缺失突变,对野生型、突变体和互补菌株进行表型测定,分析该基因缺失突变对病菌胞内c-di-GMP水平、致病性、运动性、胞外多糖产生和生物膜形成的影响。结果表明,PXO_03945蛋白具有参与c-di-GMP降解的磷酸二酯酶(PDE)的HD-GYP结构域和功能未知的DUF3391结构域。全长基因缺失可导致体内c-di-GMP浓度明显上升。与野生型相比,ΔPXO_03945对水稻品种日本晴的致病性显著下降,而游动性增强,胞外多糖产生和生物膜形成增加。基因互补可以使之恢复。因此,HD-GYP结构域蛋白PXO_03945可能通过降解胞内c-di-GMP,正向调控了致病性,负向调控了运动性、EPS产生和生物膜形成能力。     

水稻条斑病菌rsmA基因在致病性中的功能分析

RsmA属于CrsA/RsmA蛋白家族成员,是一类RNA结合蛋白,作为一类全局性的转录后调控因子,调控碳代谢、生物膜形成、游动性以及致病性相关基因的表达等。同源性搜索结果显示,水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)RS105中存在rsmA基因,其与白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)PXO99A的rsmAXoo同源性为100%。但是,r smAXoc基因在致病性中的功能未知。本研究构建了Xoc的rsmA缺失突变体RΔrsmA。寄主水稻和非寄主烟草接种结果显示,RΔrsmA在水稻上仍具有致病性,在非寄主烟草上也能够激发HR反应,这些结果与已鉴定的Xoo rsmA突变体表型不一致。但是,与野生型菌株相比,RΔrsmA在感病水稻上的毒性显著降低;在丰富和贫乏的培养基中,RΔrsmA的生长能力也明显减弱。其他毒性相关表型的测定结果显示,与野生型菌株相比,RΔrsmA在半固体培养基上的游动能力减弱,生物膜形成能力增强,胞外多糖产量明显降低,胞外蛋白酶的活性增加。这些结果暗示在Xoc中rsmA为重要的毒性相关基因,在Xoo和Xoc中RsmA在致病性中的功能存在一定的差异,RsmA下游调控基因的鉴定可能为解析其在2个水稻致病变种中功能的差异提供线索。     

hrp基因关键调控因子HrpG在水稻白叶枯病菌和条斑病菌中的交叉互补性研究

 水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)和条斑病菌(X. oryzae pv. oryzicola, Xoc)在非寄主烟草上产生过敏反应(HR)和在寄主水稻上具有致病性,是由hrp致病岛决定的,其中HrpG为关键调控因子。Xoo和Xoc侵染水稻途径和在水稻上产生病害症状的不同,是否与hrpG基因有关,还不清楚。本研究利用反向遗传学方法获得了Xoo和Xoc的hrpG突变体PΔhrpG和RΔhrpG,并用hrpG_Xoo基因和hrpG_Xoc基因分别互补上述2个突变体,获得了相应的互补菌株。致病性测定结果显示,PΔhrpG和RΔhrpG突变体丧失了在水稻上的致病性和在非寄主烟草上产生HR的能力,而hrpG_Xoo基因和hrpG_Xoc基因可分别互补上述突变体至野生型水平。利用GUS报告基因检测基因启动子活性发现,hrpG_Xoo和hrpG_Xoc的启动子活性没有显著差别;RT-PCR和Western杂交结果显示,hrpG基因交叉互补菌株中HrpG调控的下游基因hrpX、hpaR、hrcT、hpa2和hrpD6的表达没有差异,且III型分泌系统分泌蛋白Hpa2的分泌性没有受到影响。这些结果表明,稻黄单胞菌hrpG基因可在Xoo和Xoc中交叉互置,位于其上游和下游的调控途径可能相似,而决定Xoo和Xoc在水稻上的侵染途径以及所致病害症状差异可能与hrpG基因位点无关。     

katExoo基因缺失突变对水稻白叶枯病菌H2O2抗性和致病性的影响

 为了揭示过氧化氢酶基因katExoo在水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae,Xoo)过氧化氢(H₂O₂)抗性和致病性中的功能,本研究构建了基因缺失突变体ΔkatExoo,测定了突变体的H₂O₂抗性、过氧化氢酶(CAT)活性、在离体培养条件下的生长速率以及对水稻的致病性。用标记基因置换法获得了ΔkatExoo突变体,其保守的CAT结构域(GATase1_catalase和catalase_clade_2)被Gm^R片段所替换。katExoo基因缺失突变并不导致病菌的H₂O₂抗性和CAT活性降低或丧失,反而在一定程度上使之增强和升高。ΔkatExoo离体生长量显著降低,水稻接种叶片病斑明显缩短、在叶组织内的种群量下降。表明基因缺失突变显著地影响了病菌的生长、定殖和致病性。本研究结果为“KatExoo可能是Xoo的一个毒性因子”的假设提供了遗传学证据。     

ywbB基因对枯草芽胞杆菌NCD-2菌株生物膜形成和根际定殖能力的影响

为明确枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis NCD-2菌株生物膜形成相关基因及其在生物膜形成、根际定殖中的作用,采用转座子插入技术,从4000余株NCD-2突变子中获得6株生物膜形成能力降低的突变子。在生物膜形成能力丧失的突变子M3中,转座子以单拷贝的形式插入到ywbB基因内部。通过基因同源重组技术对ywbB基因进行缺失突变,获得ywbB基因缺失突变菌株NCD-2(ΔywbB),与野生菌株相比,突变子丧失了生物膜形成能力。进一步比较发现,突变菌株NCD-2(ΔywbB)显著降低了在棉花根际的群体数量,同时也降低了对棉花立枯病的防治效果。研究证明,ywbB是NCD-2菌株生物膜形成途径中的重要基因,且生物膜形成与NCD-2菌株根际定殖和生防效果呈正相关。     

转基因水稻对病原菌侵染的反应和防卫基因的表达分析

 为了阐明OsBTF3基因在水稻对白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)和细菌性条斑病菌(X. oryzae pv. oryzicola, Xoc)侵染抗/感反应中的功能,本研究以OsBTF3过量表达和RNAi转基因株系为材料,比较分析了T1代株系对病菌侵染的抗感病反应,定量测定了防卫基因的表达动态。结果表明,与野生型对照株相比,无论过量表达株系,还是RNAi株系对Xoo和Xoc侵染均表现为更加感病的反应; 经Xoo接种后,过量表达和RNAi株系OE37和RNAi株系RI30防卫基因的表达发生了不同程度的变化。因此,OsBTF3增量/减量表达对水稻抗/感病性具有重要的调控作用,这种作用可能并不依赖于水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)介导的信号途径。     

群体感应调控因子ComA对枯草芽胞杆菌NCD-2抑菌物质产生和生物膜形成的影响

为明确群体感应系统在枯草芽胞杆菌NCD-2菌株抑菌活性和生物膜形成中的作用,通过同源重组技术对群体感应系统中的comA基因进行定位缺失突变,分别比较了NCD-2菌株和comA基因突变子在胞外酶合成、抑菌活性、脂肽抗生素(丰产素)产生以及生物膜形成上的差异,并进一步利用实时荧光定量RT-PCR技术比较了二者生物膜基质编码基因epsA和tasA的表达情况。结果表明,通过同源重组技术获得了comA基因突变子MA-4,同菌株NCD-2相比,其在胞外蛋白酶和纤维素酶的合成能力、对番茄灰霉菌Botrytis cinerea的抑菌活性、丰产素的合成量和生物膜的形成能力上均明显下降;生物膜基质编码基因tasA的表达量下降了70%,而epsA的表达量变化不明显。表明ComA是NCD-2菌株脂肽抗生素和生物膜形成中的重要调控因子。     

噻唑锌对水稻黄单胞杆菌生物学活性初步研究

初步研究了噻唑锌在离体条件下对水稻黄单胞杆菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)生长的抑制作用,以及其在水稻上防治白叶枯病的生物活性及抗性风险。结果表明,噻唑锌在离体条件下抑制Xoo生长的平均EC50值为(90.17±4.66)μg/mL,且通过紫外光诱导难以获得生长不受影响的抗药性菌株。温室盆栽试验表明,活体条件下噻唑锌对水稻白叶枯病的治疗和保护作用EC50值分别为22.90和52.38μg/mL,其治疗作用显著优于保护作用。从药剂处理稻苗后接种Xoo所形成的病斑上,能够筛选到致病力不受影响的Xoo抗药性突变体,其突变频率为13.3%。交互抗性研究表明,噻唑锌与噻枯唑之间存在交互抗性,但抗药性性状不能稳定遗传。内吸传导性研究表明,噻唑锌能被水稻根部和叶片吸收,且表现为向上传导性。噻唑锌对Xoo的活体抑制活性高于其离体活性,且抗性风险低,适用于防治水稻白叶枯病。     

西瓜噬酸菌Aac-5AAA ATPases基因moxR和ruvB功能研究

AAA ATPases(ATPase associated with diverse cellular activities)是一种与细胞活性相关的酶,广泛存在于所有生物中,同时具有蛋白酶和分子伴侣活性。为了研究AAA ATPases相关基因缺失对西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)的影响,本研究通过同源重组双交换的方法构建西瓜噬酸菌moxR基因以及ruv B基因全缺失突变菌株及互补菌株,测定了突变菌株的致病性、烟草过敏反应、运动性、生长能力、生物膜形成等;并利用实时荧光定量PCR方法测定了AAA ATPases与Ⅲ型分泌系统相关基因(hrc N和hrp E)、毒性蛋白相关基因(trb C和vir B)、鞭毛相关基因(fliR和fli M)、菌毛相关基因(pin C-1和pin C-2)以及AAA ATPases亚家族Ruv B相关基因(ruv A和ruv C)的关系。结果表明,moxR基因以及ruv B基因全缺失突变菌株的致病力降低、运动性减弱、生长能力下降、生物膜形成能力增强、烟草过敏性反应减弱、突变菌株中重要的致病基因hrc N和hrp E表达量显著下调,表明AAA ATPases相关基因moxR、ruv B在西瓜噬酸菌的致病力上发挥重要作用。     

水稻白叶枯病菌鞭毛基体基因fliExoo缺失突变分析

 为了阐明水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,简称Xoo)鞭毛基体组分蛋白基因fliExoo的生物学功能,本研究用Gm^R抗性基因标记交换法成功构建了基因缺失突变体△fliExoo。与野生型菌株PXO99^A相比,△fliExoo鞭毛缺失,菌体易沉降,在0.3%半固体培养基上运动能力明显降低;尽管生长速率和胞外纤维素酶活性无明显变化,但胞外多糖产生和生物膜形成能力明显下降;对水稻品种日本晴的致病性和对非寄主烟草的致敏性反应明显减弱。基因互补可以使上述突变表型恢复。因此,鞭毛基因fliExoo突变不仅影响了细菌鞭毛依赖的运动性,而且对病原菌毒性相关的表型也产生了影响。     

水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的分子标记筛选及检测

 水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）和细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)是水稻种子产地检疫中最重要的两种检疫对象,且同属于水稻黄单胞杆菌。本研究基于生物信息学技术构建比较基因组学算法对两种病原的全基因组序列比对分析,得到一系列能够区分两种病原的特异性PCR引物。结合简单的PCR技术及全自动DNA分析系统,我们选取了12对引物分别对23株水稻白叶枯病菌和5株水稻细菌性条斑病菌及其它相关菌株进行验证。结果获得了2对显性标记(Xoo-Hpa1和Xoc-ORF2)以及3对共显性分子标记(M568、M897和M1575)可以达到理想的区分检测两种病原的效果。分子标记的检测灵敏度从5×10⁴到5 × 10⁷cfu·mL^-1不等,且从水稻种子浸提液中也能成功地检测水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌。本研究丰富了检测标记的靶位点,并有效的结合了高通量检测的手段对多位点联合分析,增强了检测的可靠性,有望在今后的植物检疫及病原鉴定中发挥着重要的作用。     

中国水稻白叶枯病菌毒性变异研究

 利用13个含已知抗病基因的近等基因系材料,在水稻孕穗期采用剪叶接种法对我国285个水稻白叶枯菌株(其中108个采集于1970~1992年,177个采集于2003~2004年)的致病力变异进行研究。结果表明,病菌的致病力呈现多样性。通过试验系统比较了不同时期病菌的毒性和小种组成变化。在此基础上对病菌群体毒性变化的原因进行了分析。     

木质部次生细胞壁增厚参与疣粒野生稻对黄单胞杆菌水稻变种的抗性

 黄单胞杆菌水稻变种（Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo）引起的水稻白叶枯病是一个世界性的严重病害。疣粒野生稻（Oryzae meyeriana）对Xoo具有高度抗性,但其抗性机制仍不清楚。本文以抗病的疣粒野生稻和感病的水稻品种大粒香为材料,研究了Xoo侵染对叶片病斑、叶绿体超微结构、光合系统活性和木质部超微结构的影响。结果表明,多种Xoo生理小种导致的疣粒野生稻叶片病斑长度都明显短于大粒香叶片的病斑长度。Xoo病菌侵染显著破坏了大粒香的叶绿体结构,明显抑制了其光合活性,而疣粒野生稻中的变化要轻得多。通过电镜切片,发现疣粒野生稻叶片导管内存在大量的Xoo病菌,这表明Xoo能够侵染疣粒野生稻且能够在叶片内增殖。病菌的侵染诱导了疣粒野生稻木质部次生细胞壁的增厚,抑制了病菌通过导管纹孔向邻近细胞的进一步侵染,这种反应可能参与了疣粒野生稻对Xoo的抗性。     

云南疣粒野生稻抗白叶枯病鉴定及叶片组织学观察

 本研究采用水稻白叶枯病菌强致病性代表菌株,评价了云南省自然分布的疣粒野生稻代表生态居群18份材料的抗病性,观察叶片组织学结构,初步分析了疣粒野生稻的抗性基因。结果表明,16份材料表现中抗、高抗甚至免疫;9份材料对4个菌株的抗性有一定差异;同时发现云南地方代表菌株X1和CN9404的致病性比C1和BD8438强。叶片组织学结构表明,高抗材料与感病的栽培稻米泉黑芒都无蜡质层,二者的叶肉组织、薄壁细胞和表皮细胞相同,表皮毛、维管束、厚壁组织等的差异也不明显,不足以引起抗病性差异。疣粒野生稻高抗或免疫白叶枯病并非借助其特殊叶片结构的物理作用,而主要是抗病基因的作用。参试疣粒野生稻中没有与Xa1、Xa21同源的基因,加之独立进化,推断其具有新的优异抗白叶枯病基因,值得深入研究和发掘利用。     

The Xanthomonas oryzae pv. oryzae type IV pilus alignment subcomplex protein PilN contributes to regulation of bacterial surface-associated behaviours and T3SS system

The gram-negative plant pathogen Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) is able to infect the host rice and effectively colonize in vascular tissues. The type IV pilus (T4P) is one of the major virulence factors playing an important role in migration of Xoo through host vascular tissues. Here, we identified PilN, a T4P alignment subcomplex protein, which is involved in regulation of swimming motility, and analysed its contribution to bacterial surface-associated behaviours and virulence. We found that the pilN deletion mutant exhibited dramatically reduced twitching motility and scarcely detectable levels of T4P major pili PilA, as well as enhanced biofilm formation and exopolysaccharide (EPS) production. In addition, deletion of the pilN gene in Xoo resulted in impaired virulence in host rice and attenuated type III secretion system (T3SS) genes expression, which is independent of PilA assembly. Expression of the relevant pilN gene in trans was capable of restoring twitching motility and biofilm formation to the wild-type levels in the pilN mutant but partially recovering EPS production and virulence. Moreover, the expression of trh and xrvA genes, which encode the HrpG positive regulators, was decreased in the pilN mutant. Our results suggest that PilN executes versatile functions in bacterial virulence and cell surface-associated behaviours.