实时荧光RT-PCR一步法检测南方菜豆花叶病毒

南方菜豆花叶病毒（Southem bean mosaic virus，SBMV）是我国二类检疫性有害生物，以南方菜豆花叶病毒日本分离物（SBMV-J）总RNA为模板，采用RT-PCR方法扩增病毒外壳蛋白基因及其上游基因的cDNA片断并将其克隆到pMD18．T载体上。序列分析结果表明：SBMV-J cp基因由801个核苷酸组成，编码266个氨基酸，SBMV．J与其它分离物及株系印基因的核苷酸序列同源性为83％-97％，氨基酸序列同源性为86％-97％。由于SBMV各分离物及株系印基因的同源性较低，难于设计出较长的普通PCR引物。通过较短引物设计和TaqMan-MGB探针技术，建立了SBMV的实时荧光RT-PCR一步检测方法。该方法的检测低限是0．16pg，最佳检测总RNA的量是0．16ng。     

河南省地黄病毒病初步鉴定

 利用血清学、RT-PCR并结合核苷酸序列测定等方法,对河南省地黄病毒病进行了初步鉴定。结果表明,烟草花叶病毒(TMV)为侵染地黄的主要病毒;对TMV地黄分离物(TMV-RH) CP基因的序列分析结果表明,TMV-RH与TMV-U1株系CP基因的核苷酸同源性为86.5%,氨基酸同源性为94.3%;与已发表的TMV其它株系CP基因的核苷酸同源性在76.3%~88.5%之间,氨基酸同源性在79.3%~95.0%之间,同源性较低。根据不同株系CP的氨基酸序列进化树分析,推测该分离物可能为TMV的一个新株系。     

菜豆黄花叶病毒中国和叙利亚蚕豆分离物外壳蛋白的序列分析

 病毒病是影响云南省蚕豆生产的重要病害。对采集的蚕豆病毒病标样进行了组织印迹法检测,表明菜豆黄花叶病毒(BYMV)是最主要的病原。据此,以BYMV基因的保守序列设计了一对特异性引物,用BYMV的5个中国云南蚕豆分离物和1个叙利亚蚕豆分离物侵染的蚕豆叶片总RNA为模板,RT-PCR扩增获得了长度为907bp的目标片段。序列分析显示,此片段中包含822bp的外壳蛋白序列。6个分离物间的外壳蛋白核苷酸和推导编码蛋白质的氨基酸序列的同源性分别为86.4%~100.0%和96.7%~100.0%。与GenBank登录的34个具有完整外壳蛋白序列的BYMV分离物进行同源性和系统进化树分析的结果表明,6个分离物在核苷酸和氨基酸水平上与其它分离物的同源性分别为79.1%~97.9%和83.5%~98.5%,BYMV中国蚕豆分离物与日本蚕豆分离物同源性最高。外壳蛋白基因的序列特征揭示,在BYMV中的蚜传相关基序为NAG。     

湖北省小麦黄花叶病病原的部分序列鉴定

 从湖北省真菌传小麦黄花叶病病毒分离物中抽提病毒总RNA,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,合成病毒外壳蛋白(CP)基因cDNA。对所获得的cDNA克隆进行序列测定及分析,结果表明,湖北省真菌传小麦黄花叶病病毒分离物与小麦梭条斑花叶病毒(WSSMV)、大麦黄花叶病毒(BaYMV)、大麦和性花叶病毒(BaMMV)等病毒CP基因相应序列的同源性均低于70%,而与报道的小麦黄花叶病毒(WYMV)分离物CP基因核苷酸及编码氨基酸序列同源性均超过97%。表明湖北省真菌传小麦黄花叶病病原应为小麦黄花叶病毒(WYMV)。     

油菜花叶病毒Wh株系的鉴定

依据病毒的寄主植物反应、血清学性质和RNA 3'末端含cp和mp基因1554 bp cDNA片段序列分析,明确一个侵染油菜的烟草花叶病毒属Tobamovirus病毒分离物是油菜花叶病毒(Oileed rape mosaic virus,ORMV)的一个株系,定名为Wh株系.ORMV-Wh侵染油菜、白菜和大白菜等十字花科的作物,初期产生典型明脉症状,对辣椒、番茄和烟草等茄科植物致病性弱;血清学与烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)有明显差异.ORMV-Wh mp、cp基因和3'UTR区段大小分别为798、474和235个核苷酸,mp和cp基因有77个核苷酸重叠;与TMV序列同源性在60%以下,与侵染十字花科Tobamovirus属病毒株系序列同源性在80%以上;其中与ORMV的不同株系RMV-CAB、RMV-Sh、YoMV、YoMV-Cg和CTMV-W的同源性在90%以上.     

大麦黄花叶病的分子生物学与基因工程研究:Ⅱ.大麦黄花叶病毒抗性突破株系的分子分析

 大麦山黄花叶病毒抗性突破株系的出现克服了已有大麦抗性基因的作用。本研究通过对大麦黄花叶病毒原株系和抗性突破株系RNA1中包含NIa蛋白酶基因的1Kb区段进行克隆和序列分析,比较两株系的序列差异。表明两者间核苷酸水平的同源性为97.2%,氨基酸水平的同源性为97.3%。根据存在的这些微小差异,人工合成具有株系特异性的聚合酶链式反应(PCR)引物,建立PCR检测系统,以期在大田黄花叶病毒株系鉴定中应用。     

大麦黄花叶病的分子生物学与基因工程研究——Ⅱ.大麦黄花叶病毒抗性突破株系的分子分析

大麦山黄花叶病毒抗性突破株系的出现克服了已有大麦抗性基因的作用。本研究通过对大麦黄花叶病毒原株系和抗性突破株系RNA1中包含NIa蛋白酶基因的1Kb区段进行克隆和序列分析,比较两株系的序列差异。表明两者间核苷酸水平的同源性为97.2％,氨基酸水平的同源性为97.3％。根据存在的这些微小差异,人工合成具有株系特异性的聚合酶链式反应(PCR)引物,建立PCR检测系统,以期在大田黄花叶病毒株系鉴定中应用。     

西瓜花叶病毒2号新疆昌吉分离物外壳蛋白基因核苷酸序列分析

 利用RT-PCR从新疆昌吉地区表现花叶、疱斑、扭曲等症状的南瓜病株上检测到西瓜花叶病毒2号新疆昌吉分离物(简称WMV-2-XJ-CJ),并测定了该分离物外壳蛋白(CP)基因序列。序列分析表明,新疆昌吉分离物CP基因全长850个核苷酸,编码197个氨基酸。与国内外报道的12个WMV-2CP基因相比,其核苷酸序列同源性为92.6%~98.3%,由此推导的氨基酸序列同源性为94.7%~99.3%。新疆昌吉分离物在CP N'端可变区明显不同于国内外报道的核苷酸序列。WMV-2新疆昌吉分离物与日本和郑州分离物较其它国家和地区的分离物多出6个核苷酸,但其核苷酸及其推导的氨基酸序列差异较大。新疆昌吉分离物外壳蛋白有2个氨基酸残基明显不同于其它分离物,其中蚜传株系的特征结构域DAG突变为DAE。     

西瓜花叶病毒2号南瓜分离物的鉴定及其外壳蛋白基因序列分析

 利用电镜和酶联免疫吸附测定法(ELISA)在黑龙江省采集的南瓜病样中检测到西瓜花叶病毒2号(WMV-2)。再利用免疫PCR (IC-PCR)和反转录PCR (RT-PCR)方法,扩增获得其外壳蛋白(CP)基因片段,并克隆到pGEM-T载体中。核苷酸序列测定表明,该分离物CP基因全长为852个核苷酸,编码由284个氨基酸组成的31.8 kDa蛋白。与国外已报道的WMV-2 CP基因相比,其核苷酸序列同源性为92.2%~94.0%,由此推导的氨基酸序列同源性为94.5%~98.1%。与国内2个分离物相比,和山西分离物核苷酸和氨基酸的同源性都达到98.5%,和郑州分离物核苷酸和氨基酸的同源性分别为91.5%和95.0%。     

小麦黄花叶病毒罗田分离物细胞质内含体蛋自基因的序列分析

利用RT-PCR,获得了小麦黄花叶病毒湖北罗田分离物细胞质内含体(CI)蛋白基因的cDNA克隆。序列分析结果表明,湖北罗田分离物CI基因由1977个核苷酸组成,编码一个由659个氨基酸组成的蛋白质。与已报道的河南潢川、四川雅安、江苏扬州及日本分离物序列比较,不同分离物之间核苷酸序列同源性在95.0％～97.5％之间,相应推导的氨基酸序列同源性在93.2％～97.1％之间。并对CI蛋白的功能进行了讨论。     

来源于桃和苹果的苹果褪绿叶斑病毒的部分分子生物学特性和cp基因的原核表达

 从桃和苹果上分离得到苹果褪绿叶斑病毒ACLSV-HBP和ACLSV-C2个分离物,采用RT-PCR法进行扩增,所获扩增片段经序列测定,其全长分别为1768nt(ACLSV-HBP)和1751nt(ACLSV-C)。这2个分离物扩增片段全长的同源性为83%,mp基因片段核苷酸和推导编码氨基酸序列同源性分别为82.6%和87.1%;cp基因均由582nt组成,其核苷酸和推导编码氨基酸序列同源性分别为87.8%和95.9%。将2个分离物的cp基因与已报道ACLSV分离物进行序列同源性比较,结果显示ACLSV-HBP与SX/2的cp基因核苷酸序列及推导编码氨基酸序列同源性最高,分别为94.0%和96.4%。将ACLSV-HBP分离物的cp基因克隆到原核表达载体pGEX-KG,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,SDS-PAGE分析表明,融合蛋白大小约为46kDa。Western-blot分析表明,该基因在大肠杆菌内得到高效表达,融合蛋白具有抗原性。     

Biological, serological, and molecular variabilities of clover yellow vein virus

ABSTRACT A comparative study was made on the host reactions, serological properties, and nucleotide sequences of the coat protein (CP) gene of 10 clover yellow vein virus (C1YVV) isolates and one bean yellow mosaic virus (BYMV) isolate collected from different host plant species and locations in Japan. Two strains of C1YVV isolates, grouped on the basis of host reactions on Chenopodium amaranticolor, C. quinoa, Nicotianaclevelandii, N. benthamiana, Vicia faba, and Trifolium repens, corresponded to two serotypes determined by double-antibody sandwich- and triple-antibody sandwich-enzyme-linked immunosorbent assay using three polyclonal and nine monoclonal antibodies. These results were also confirmed by nucleotide sequence analysis of the CP gene. The CP gene of C1YVV isolates of strain 1, including the Australian isolate C1YVV-B, had 93 to 98% nucleotide identities and 97 to 99.6% amino acid identities. The CP of C1YVV isolates of strain 2, including the New Zealand isolate C1YVV-NZ, had 92 to 98% nucleotide identities and 95 to 98% amino acid identities. The nucleotide identities and the amino acid identities between the two C1YVV strains were 82 to 84%, and 90 to 94%, respectively. When compared with the CP sequences of 12 C1YVV isolates, the CP sequence of the BYMV isolate had 71 to 73% nucleotide identity and 73 to 77% amino acid identity. Amino acid sequence differences among C1YVV isolates from strains 1 and 2 were located mostly at the N-terminal regions of the CP. Our results indicated that the C1YVV isolates studied could be separated into two strains on the basis of host reactions, serology, and the nucleotide sequence of the CP gene.     

葡萄卷叶伴随病毒-3外壳蛋白的原核表达及其特异性抗血清的制备

利用RT-PCR技术扩增得到了葡萄卷叶伴随病毒-3(Grapevine leafroll associated virus-3,GLRaV-3)中国分离物的外壳蛋白(coat protein,cp)基因。序列分析结果表明,cp基因的长度为942bp,与已报道的其它GLRaV-3分离物的cp核苷酸相似性为91%～99%,编码的氨基酸相似性为95%～100%。将此基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS后用终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blotting分析表明,cp在大肠杆菌中可表达出分子量约为35kDa的蛋白。纯化表达产物后免疫家兔制备抗血清。A蛋白酶联免疫吸附测定(PAS-ELISA)及斑点免疫结合测定(DBIA)结果显示,制备的特异抗血清可用于检测田间感病葡萄样品中的GLRaV-3。     

马铃薯S病毒的分子鉴定与检测

An isolate of PVS, HZ00P1, was obtained from nature infected Solanum tuberosum from Hang-zhou, Zhejiang province. It was primarily identified by DAS-ELISA and host reaction tests. 3' end partial sequence of the virus isolate was cloned. Nucleic acid sequence of the cp gene and deduced cp amino acid se-quence alignments were compared with 16 other isolates registered in GenBank. The results showed that the 17 PVS isolates were divided into two groups. Among them, two Andean isolates were classified to group Ⅱ, HZ00P1 and the other 14 isolates were assigned to group Ⅰ. Compared with other PVS isolates in group Ⅰ, PVS HZ00P1 had 93.1%-98.1% and 95.9%-99.3% homologies of nucleotide sequence and deduced amino acid sequence respectively, whereas its similarities to the group Ⅱwere 81.4%-81.7% and 93.5%-93.9%. A survey of PVS occurrence in Zhejiang province was achieved by RNA spot hybridization (RSH). Among the 30 samples collected from different areas of the province, 26.7% were found to have the infection of PVS. It is concluded that PVS has become a common virus in Zhejiang province.     

小西葫芦黄花叶病毒山东南瓜分离物的分子特性

 Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) was detected by RT-PCR from pumpkin (Cucurbita moschata) plant showing yellowing and mosaic symptom from Liaocheng, Shandong Province. The 3'-termial 1 684 bp genomic sequence covered 633 bp of NIb encoding sequence, 840 bp of cp gene and 211 bp of 3'-untranslated region of the isolate ZYMV-Liaocheng was determined. The cp gene of ZYMV-Liaocheng shared identities of 81.4%-98.8% and 89.4%-99.5% at nucleotide and amino acid levels, respectively, with other ZYMV sequences available in the GenBank. Phylogenetic analysis indicated that ZYMV could be clustered to 6 genotypes. ZYMV-Liaocheng belonged to genotypeⅠ, which contained isolates from Asia, Europe and America. Genotypes Ⅲ and Ⅴ were unique and contained only isolates from East Asia. The isolates from East Asia had the highest variability.     

甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因克隆及其实时荧光RT-PCR检测

 甘蔗黄叶病毒（Sugarcane yellow leaf virus, SCYLV）引起的甘蔗黄叶病是一种新的全球性病毒病害。本文以YLSCPF1和YLSCPR591为引物,采用RT-PCR方法克隆了甘蔗黄叶病毒福建分离物（CHN-FJ1）外壳蛋白（CP）基因,编码196个氨基酸。分析不同地理来源的SCYLV病毒分离物cp基因核苷酸及其推导编码的氨基酸序列,同源性达95%以上。根据cp基因的保守序列,设计1对特异性引物和TaqMan探针,建立了SCYLV的TaqMan实时荧光RT-PCR方法。结果表明,检测下限为初始质粒模板DNA 1 000拷贝/μL（约3.61 fg/μL）,比常规PCR方法的灵敏度提高100倍。检测甘蔗花叶病毒、宿根矮化病菌和黑穗病菌,没有典型的扩增曲线和无Ct值。应用实时荧光RT-PCR、常规RT-PCR和组织印迹免疫杂交（TBIA）对田间甘蔗叶片样品进行检测,阳性检出率分别为100%、61.5%和69.2%,表明该方法比常规RT-PCR和TBIA具有更高的灵敏度,适合于对SCYLV的检测。     

番木瓜环斑病毒南瓜分离物外壳蛋白基因的克隆及序列分析

利用电镜和酶联免疫法在云南省采集到的5份南瓜病样中检测到番木瓜环斑病毒(Papayaring spot virus,PRSV)。为了进一步从分子水平确定云南省南瓜病毒病原种类,并为下一步转基因育种提供抗性基因,采用反转录PCR(RT-PCR)方法扩增了5个分离物的外壳蛋白(coat protein,CP)基因片段,并克隆到pGEM-T载体中。核苷酸序列测定表明,番木瓜环斑病毒石屏分离物(PRSV-SP)和番木瓜环斑病毒蒙自分离物(PRSV-MZ)的CP基因长873nt,编码290个氨基酸,番木瓜环斑病毒峨山分离物(PRSV-ES)、番木瓜环斑病毒版纳分离物(PRSV-BN)和番木瓜环斑病毒宾川分离物(PRSV-BC),3个分离物CP基因长867nt,编码288个氨基酸。PRSV5个分离物核苷酸序列的同源性在94%以上,氨基酸序列的同源性在96%以上。与国内外17个分离物相比,核苷酸序列同源性为89.6%~98.7%,氨基酸序列同源性为86.5%~99.6%。其中PRSV-SP和来自于越南分离物PRSV-V47无论是核苷酸序列,还是氨基酸序列同源性都达到了最高,而5个分离物与来自于巴西(PRSV-BR)、美国(PRSV-USA)、墨西哥(PRSV-Y)核苷酸序列同源性均低于90%。