海藻多糖对仔猪小肠上皮细胞紧密连接蛋白及核转录因子-κB信号通路相关基因表达的影响

本试验旨在研究不同浓度海藻多糖对仔猪小肠上皮细胞(IPEC-J2细胞)紧密连接蛋白及核转录因子-κB(NF-κB)信号通路相关基因表达的影响。IPEC-J2细胞加入浓度分别为0(对照)、60、120和240μg/mL的海藻多糖处理培养基培养24 h,分析海藻多糖对IPEC-J2细胞机械屏障和免疫屏障相关基因以及蛋白表达的影响。结果表明:1)与对照组相比,60、120μg/mL的海藻多糖可以显著上调紧密连接蛋白闭锁蛋白(occludin)和闭合小环蛋白-1(ZO-1)的mRNA相对表达量(P0.05);但240μg/mL海藻多糖组occludin和ZO-1的mRNA相对表达量与对照组无显著差异(P0.05)。与对照组相比,120和240μg/mL的海藻多糖可以显著上调封闭蛋白-1(claudin-1)的mRNA相对表达量(P0.05)。与对照组相比,120、240μg/mL的海藻多糖可以显著上调claudin-1和ZO-1的蛋白相对表达量(P0.05)。2)与对照组相比,60、120和240μg/mL的海藻多糖均显著降低了髓样分化蛋白88(MyD88)和p65的mRNA相对表达量(P0.05),240μg/mL的海藻多糖显著降低了Toll样受体-4(TLR-4)和核转录因子-κB抑制蛋白α(IκBα)的mRNA相对表达量(P0.05)。由此可知,海藻多糖可以上调IPEC-J2细胞紧密连接蛋白occludin、claudin-1和ZO-1的mRNA相对表达量,降低IPEC-J2细胞NF-κB信号通路相关基因的表达,对改善仔猪小肠上皮细胞屏障功能具有积极的作用。     

嗜酸乳杆菌对氧化应激仔猪小肠上皮细胞抗氧化能力和紧密连接蛋白表达的影响

本研究旨在探讨嗜酸乳杆菌对氧化应激仔猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)抗氧化能力及紧密连接蛋白-1(ZO-1)、闭锁蛋白(occludin)和闭合蛋白(claudin)蛋白表达的影响。首先将IPEC-J2分为9组,分别加入0(对照)、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8和2.0 mmol/L的过氧化氢(H_2O_2),每组6个复孔,根据细胞活力确定最佳H_2O_2浓度。然后根据结果选择1.2 mmol/L的H_2O_2建立氧化应激IPEC-J2模型,将细胞分为7组,分别加入为0(对照)、1.0×10~5、1.0×10~6、1.0×10~7、1.0×10~8、1.0×10~9和1.0×1010CFU/mL嗜酸乳杆菌,每组6个复孔,处理时间为24 h,分析嗜酸乳杆菌对氧化应激IPEC-J2抗氧化能力。最后选择1.2 mmol/L的H_2O_2建立氧化应激IPEC-J2模型,加入1.0×10~9CFU/mL嗜酸乳杆菌继续培养24 h,将细胞分为4组,分别是对照组(添加等量的磷酸盐缓冲液)、H_2O_2氧化应激组、嗜酸乳杆菌组、嗜酸乳杆菌组+H_2O_2组(先加入H_2O_2后加入嗜酸乳杆菌),每组6个重复,测定ZO-1、occludin和claudin蛋白的表达量。结果显示:1)与对照组相比,当H_2O_2浓度高于0.6 mmol/L时,细胞活力显著降低(P0.05)。与对照组和0.6～1.0 mmol/L H_2O_2组相比,当H_2O_2浓度处于1.2～1.8 mmol/L时,细胞活力显著下降(P0.05)。2)与对照组相比,当嗜酸乳杆菌浓度高于1.0×10~8CFU/mL时,细胞活力显著提高(P0.05)。3)在氧化应激条件下,随着嗜酸乳杆菌浓度的增加,细胞活力逐渐上升。与对照组相比,当嗜酸乳杆菌浓度低于1.0×10~7CFU/mL时,细胞活力显著降低(P0.05),当嗜酸乳杆菌浓度高于1.0×10~9CFU/mL时,细胞活力显著提高(P0.05)。4)与对照组相比,当嗜酸乳杆菌浓度高于1.0×10~6CFU/mL时,细胞中丙二醛(MDA)含量显著降低(P0.05),嗜酸乳杆菌浓度高于1.0×10~7CFU/mL时,细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性显著上升(P0.05),其他各组中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性较对照组显著升高(P0.05)。5)与H_2O_2氧化应激组相比,嗜酸乳杆菌组和嗜酸乳杆菌+H_2O_2组中细胞浆内ZO-1和occludin蛋白表达量显著降低(P0.05);与对照组和H_2O_2氧化应激组相比,嗜酸乳杆菌组和嗜酸乳杆菌+H_2O_2组中claudin蛋白表达量显著降低(P0.05)。由此可知,嗜酸乳杆菌能够促进细胞的生长,增强细胞的抗氧化能力,降低胞浆内紧密连接蛋白的表达量。     

猪胰高血糖素样肽-2通过细胞外信号调节激酶1/2调节仔猪空肠上皮细胞紧密连接蛋白表达

本试验以体外培养的仔猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)为研究对象,研究了猪胰高血糖素样肽-2(p GLP-2)对紧密连接蛋白表达的调节及其信号传导机制。培养液中分别添加10-9mol/L p GLP-2(p GLP-2组)和10-9mol/L p GLP-2、10μmol/L U0126(p GLP-2+U0126组),对照组不添加以上试剂,每组3个重复,每个重复1个培养孔。测定IPEC-J2胞质紧密黏连蛋白-1(ZO-1)、occludin、claudin-1以及细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)蛋白表达量。结果表明:与对照组相比,IPEC-J2细胞培养液中添加p GLP-2显著增加了ZO-1、occludin、claudin-1以及p42-ERK1/2、p44-ERK1/2的蛋白表达量(P0.05);与p GLP-2组相比,在IPEC-J2细胞培养液中加入ERK1/2的抑制剂U0126,显著降低了ZO-1、occludin、claudin-1以及p42-ERK1/2、p44-ERK1/2的蛋白表达量(P0.05)。综合得出,ERK1/2通路是p GLP-2调控肠道上皮细胞紧密连接蛋白表达的一条重要信号通路。     

降钙素基因相关肽对猪小肠上皮细胞钠离子依赖型Ⅱb磷转运蛋白表达及磷吸收的影响

本试验旨在研究不同浓度降钙素基因相关肽(CGRP)对猪小肠上皮细胞钠离子依赖型Ⅱb磷转运蛋白(NaPi-Ⅱb)表达和磷吸收的影响.选用第3～8代猪小肠上皮细胞进行试验,按单因素试验设计,将试验细胞分为1个对照组和5个CGRP(1×10-11～1×10-7 mmol/L)试验组,每组设6个重复.用4-甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞生长速度,采用比色法测定CGRP干预24 h后细胞上清液磷含量,用RT-PCR法检测NaPi-Ⅱb mRNA相对表达量,以及蛋白质印迹(Western blot)法检测NaPi-Ⅱb蛋白表达.结果表明:与对照组相比,不同浓度CGRP对细胞生长没有显著影响(P＞0.05);各试验组均极显著或显著地促进了磷的吸收和NaPi-ⅡbmRNA的相对表达量(P＜0.01或P＜0.05);除1×10-10 mmol/L组外均显著提高了NaPi-Ⅱb蛋白的表达(P＜0.05).研究结果表明,CGRP通过诱导小肠上皮细胞中NaPi-Ⅱb的表达促进细胞磷的吸收,其中以1×10-9、1×10-8 mmol/L浓度的CGRP促进效果较为显著.     

以LPS构建IPEC1细胞损伤模型及相关指标的测定

本试验旨在研究脂多糖(LPS)刺激对猪肠上皮细胞系(IPEC1)细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)活性、紧密连接蛋白和炎症相关基因表达的影响。分别选取0、0.025、1、10μg/m L的LPS刺激细胞1、2、4、8 h,检测相关指标。结果表明:在不同时间,不同浓度的LPS对细胞活力的影响未呈现出显著的规律性;与0、0.025μg/m L LPS组相比,在1、4、8h,1、10μg/mLLPS处理导致IPEC1上清液LDH活性显著升高;在不同时间,不同浓度的LPS对紧密连接蛋白(ZO-1、occludin、claudin-1)和炎症相关基因(TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6)mRNA表达影响未呈现出显著的规律性。以上结果表明,LPS刺激能引起IPEC1细胞损伤,但不能诱导显著的炎症反应。     

紧密连接蛋白occludin和claudin-1在猪机体不同组织的分布研究

紧密连接蛋白有维持上皮屏障完整性的功能,主要的组成蛋白有occludin和claudin-1。为研究猪体内紧密连接蛋白occludin和claudin-1的表达分布情况,首先用Gen Bank中发表的猪源occludin和claudin-1的序列,设计并合成了针对occludin和claudin-1的特异性引物,然后从无特定病原(SPF)猪体不同组织中提取总RNA,反转录成c DNA,用半定量方法测定SPF猪不同组织紧密连接蛋白的m RNA水平。结果发现,occludin和claudin-1在不同组织的分布存在差异。进一步测序发现,occludin序列相对保守,而claudin-1则变异较大。     

赖氨酸对奶牛乳腺上皮细胞内乳脂肪合成相关基因和蛋白表达的影响

本试验旨在研究赖氨酸(Lys)对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内乳脂肪合成相关基因和蛋白表达的影响,探讨Lys影响乳脂肪合成的机理。将第3代BMECs随机分为6组,每组6个重复,每个重复1个培养孔。各组培养基中Lys的浓度分别为0.5(基础培养基,对照)、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0mmol/L,37℃、5%CO2培养48h后测定BMECs甘油三酯(TAG)含量、乳脂肪合成相关基因和蛋白的表达量。结果表明:BMECs内TAG含量(P=0.013)以及脂肪酸结合蛋白3(FABP3,P=0.001)、脂蛋白脂酶(LPL,P=0.096)、脂肪酸合成酶(FASN,P=0.003)、乙酰甘油磷酸脂酰转移酶6(AGPAT6,P=0.038)和甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAM,P=0.022)基因表达量对Lys呈显著或趋于显著的浓度依赖效应。FABP3基因表达量以2.0、4.0、8.0、16.0mmol/L组和LPL基因表达量以1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L组显著高于0.5mmol/L组(P0.05);FASN基因表达量以2.0mmol/L组最高,显著高于16.0mmol/L组(P0.05);硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)基因表达量以2.0、4.0mmol/L组显著高于其他组(P0.05);磷脂酸磷酸酯酶1(LPIN1)、嗜乳脂蛋白亚家族1成员1(BTN1 A1)和黄嘌呤脱氢酶(XDH)基因表达量均以1.0、2.0、4.0、8.0mmol/L组显著高于0.5mmol/L组(P0.05);过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因及蛋白表达量均以2.0、4.0mmol/L组显著高于0.5和8.0、16.0mmol/L组(P0.05);固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)基因表达量以1.0、2.0、4.0mmol/L组显著高于其他组(P0.05),蛋白表达量以1.0 mmol/L组显著高于其他组(P0.05)。但高浓度Lys抑制AGPAT6和GPAM的基因表达,AGPAT6基因表达量以2.0、4.0、8.0、16.0mmol/L组显著低于0.5、1.0mmol/L组(P0.05),GPAM基因表达量以16.0mmol/L组显著低于0.5、1.0、2.0、4.0mmol/L组(P0.05)。可见,Lys对BMECs的乳脂肪合成具有显著的促进效果,但高浓度的Lys抑制了乳脂肪合成相关基因的表达。本试验条件下,培养基中Lys适宜浓度为2.0~4.0mmol/L。     

不同培养条件对乳酸菌黏附猪小肠黏膜上皮细胞的影响

为了研究不同培养条件对乳酸菌黏附猪小肠黏膜上皮细胞的影响,试验采用体外细胞培养方法,观察乳酸杆菌在不同条件下(如p H值、温度、离子浓度)黏附猪小肠黏膜上皮细胞的能力。结果表明:p H值为6时,小肠黏膜上皮细胞黏附乳酸杆菌数为(15.60±0.58)个,较其他p H值时多;与其他温度(30℃和42℃)相比,37℃时猪小肠黏膜上皮细胞黏附乳酸杆菌数最多,为(22.44±1.05)个/细胞;与其他浓度相比较,猪小肠黏膜上皮细胞黏附乳酸杆菌数最多的是,2 mmol/L Ca2+时为(11.36±2.36)个/细胞,2 mmol/L Mg2+时为(18.75±1.37)个/细胞,0.005 mmol/L Fe2+时为(22.48±2.78)个/细胞,0.000 5 mmol/L Cu2+时为(20.24±2.35)个/细胞,0.002 5 mmol/L Zn2+时为(17.48±1.59)个/细胞;不同浓度的S2-对乳酸杆菌黏附小肠黏膜上皮细胞黏附性影响不显著;0.005 mmol/L I-时小肠黏膜上皮细胞黏附细菌数为(19.68±1.25)个/细胞,其他浓度I-对乳酸杆菌的细胞黏附性影响不显著。说明乳酸杆菌与猪小肠黏膜上皮细胞黏附的最佳酸碱度、温度分别为p H值为6~7、37~42℃;Ca2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、I-等6种离子的最适浓度分别为2,2,0.005,0.000 5,0.002 5,0.005 mmol/L。     

谷氨酰胺对过氧化氢诱导氧化应激人结肠癌HT-29细胞损伤和凋亡的影响

本试验旨在通过研究谷氨酰胺对过氧化氢(H_2O_2)诱导氧化应激人结肠癌HT-29细胞损伤和凋亡的影响,阐明谷氨酰胺的抗氧化效果和作用机理。HT-29细胞经不同浓度[0(对照组)、0.5、2.0、10.0 mmol/L]谷氨酰胺和0.35 mmol/L H_2O_2分别处理12、24、32 h后,测定细胞的超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量,并采用荧光定量PCR方法分析谷氨酰胺对H_2O_2诱导的细胞凋亡相关基因的mRNA相对表达量,以及采用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶双染法对HT-29细胞染色,并用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。结果表明:1)处理24 h后,0.5、2.0 mmol/L Gln组SOD活性显著高于对照组(P0.05);处理32 h后,0.5、2.0 mmol/L Gln组SOD活性显著高于对照组(P0.05),MDA含量显著低于对照组(P0.05)。2)处理12 h后,各组天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)和B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bax)mRNA相对表达量无显著差异(P0.05)。与对照组比较,0.5 mmol/L Gln组核转录因子κB(NF-κB)mRNA相对表达量显著降低(P0.05),0.5与2.0 mmol/L Gln组B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)mRNA相对表达量显著提高(P0.05)。处理24 h后,与对照组比较,0.5、2.0和10.0 mmol/L Gln组Caspase-3、NF-κB和Bax mRNA相对表达量均显著降低(P0.05),Bcl-2mRNA相对表达量显著升高(P0.05)。处理32 h后,与对照组比较,2.0 mmol/L Gln组细胞表面诱导凋亡分子(FAS)、Caspase-3、NF-κB、Bax mRNA相对表达量均显著降低(P0.05),Bcl-2mRNA相对表达量显著升高(P0.05);10.0 mmol/L Gln组FAS、Caspase-3、NF-κB、Bax mRNA相对表达量均显著升高(P0.05)。3)处理24 h后,与对照组比较,Gln处理使活细胞数量提高了5.32%~11.97%,坏死细胞数量降低了6.75%~12.66%。处理32 h后,与对照组比较,Gln处理使活细胞数量提高了1.39%~7.63%,坏死细胞数量降低了3.40%~4.57%。由此可见,谷氨酰胺可抑制氧化应激反应,降低H_2O_2诱导的HT-29细胞凋亡。     

蛋氨酸对奶牛乳腺上皮细胞内乳脂合成相关基因和蛋白表达的影响

本试验旨在研究蛋氨酸(Met)对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内乳脂合成相关基因和蛋白表达的影响,以探讨Met对乳脂合成的影响机理。将第3代BMECs随机分为6个处理(每个处理6个重复),培养液中Met浓度分别为0.13、0.26、0.39、0.52、0.65和0.78 mmol/L。在37℃、5%CO2条件下培养48 h后测定BMECs内甘油三酯(TG)的含量及乳脂合成相关基因和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)与固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)蛋白的相对表达量。结果显示:Met浓度对BMECs内TG含量无显著影响(P0.05)。0.52~0.78 mmol/L Met处理BMECs内脂肪酸结合蛋白3(FABP3)、乙酰辅酶A羧化酶A(ACACA)和PPARγ基因的相对表达量均显著高于其他处理(P0.05)。BMECs内脂蛋白脂酶(LPL)基因的相对表达量以0.26~0.39 mmol/L Met处理较高,显著高于0.65~0.78 mmol/L Met处理(P0.05)。脂肪酸合成酶(FASN)基因的相对表达量以0.39~0.52 mmol/L Met处理较高,且0.52 mmol/L Met处理显著高于0.13~0.26 mmol/L和0.65~0.78 mmol/L Met处理(P0.05)。Met浓度可显著影响SREBP1和乙酰甘油磷酸脂酰转移酶6(AGPAT6)基因及SREBP1和PPARγ蛋白的表达(P0.05),均以0.26 mmol/L Met处理的相对表达量最高。结果表明,Met浓度影响BMECs内脂肪酸摄取、从头合成的基因的表达及乳脂合成调控因子PPARγ和SREBP1的基因和蛋白的表达,Met浓度为0.26~0.52 mmol/L时对BMECs内脂肪酸从头合成及长链脂肪酸摄取的促进效果较好。     

橙皮苷抑制LPS诱导的肠上皮细胞炎性损伤及其机制研究

本研究通过建立脂多糖(LPS)诱导大鼠小肠隐窝上皮细胞(IEC-6)炎性损伤模型,测定乳酸脱氢酶(LDH)释放率和细胞划痕愈合率,以评估橙皮苷对LPS诱导的IEC-6细胞炎性损伤的保护作用;通过Western blot法测定NLRP3、Caspase-1、IL-1β、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IκB和IκB等蛋白的表达及炎性因子TNF-α的分泌水平,以探讨橙皮苷对IEC-6细胞炎性损伤的保护作用机制。结果表明,橙皮苷显著抑制LPS诱导的IEC-6细胞Caspase-1和IκB的激活,抑制炎性因子TNF-α的分泌,进而抑制细胞活性的降低以及迁移能力下降,从而保护IEC-6细胞免受LPS诱导的细胞炎性损伤。     

蛋氨酸对奶牛乳腺上皮细胞内乳蛋白和乳糖合成的调节作用

本试验旨在研究蛋氨酸(Met)对泌乳奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内乳糖含量及乳蛋白和乳糖合成相关基因和蛋白表达的影响,探讨Met对乳蛋白和乳糖合成的影响机理。将第3代BMECs随机分为6个组,每个组6个重复。Met终浓度分别为0.13、0.26、0.39、0.52、0.65和0.78 mmol/L,37℃、5%CO2培养48 h后测定BMECs活力、ATP含量、乳蛋白和乳糖合成相关基因和蛋白表达及细胞液中乳糖含量。结果表明:与0.13和0.78 mmol/L组相比,0.39～0.65 mmol/L组细胞活力显著增加(P 0.05),0.26～0.52 mmol/L组的葡萄糖转运蛋白1和α-乳清白蛋白的基因相对表达量显著下降(P0.05),0.39 mmol/L组乳糖含量显著增加(P0.05)。与0.13～0.26 mmol/L组相比,0.39～0.52 mmol/L组信号转导和转录因子5、真核起始因子4E基因相对表达量及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白、核糖体蛋白S6激酶1磷酸化水平显著增加(P0.05)。0.52 mmol/L组ATP含量、β-酪蛋白、κ-酪蛋白和酪氨酸激酶2基因相对表达量显著高于其他组(P0.05),但腺苷酸活化蛋白激酶磷酸化水平显著低于其他组(P0.05)。0.26～0.52 mmol/L组的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白基因相对表达量显著高于0.65～0.78 mmol/L组(P0.05)。综合乳蛋白和乳糖合成的多项指标,0.39～0.52 mmol/L的Met对BMECs乳蛋白基因和蛋白表达及乳糖的合成促进效果较好。     

细胞因子信号传导抑制因子1在双氧水诱导的IPEC-1细胞炎症和损伤中的作用

试验旨在研究干扰细胞因子信号传导抑制因子1 (SOCS1)对猪小肠上皮细胞(IPEC-1)细胞活力、上清液乳酸脱氢酶(LDH)活性及炎性细胞因子mRNA表达影响。首先采用0.2 mmol/L或0.5 mmol/L双氧水刺激IPEC-1细胞3 h后收集细胞检测toll样受体4 (TLR4)信号通路关键因子及其负调控因子SOCS1的表达。然后采用2×2因子设计,2个主因子分别为SOCS1 siRNA(0、100 nmol/L)和双氧水(0、0.5 mmol/L)处理,即用SOCS1siRNA干扰24 h,再用双氧水刺激3 h,收细胞样和上清液待测。结果表明:0.5 mmol/L双氧水刺激导致IPEC-1细胞TLR4、NF-κB和SOCS1mRNA的表达量升高(P0.05),并有提高MyD88mRNA表达量的趋势(P=0.058);双氧水刺激导致IPEC-1细胞SOCS1mRNA表达量升高(P0.001),SOCS1 siRNA导致SOCS1 mRNA表达量降低(P0.05);双氧水刺激导致IPEC-1细胞活力下降(P0.001),SOCS1siRNA对细胞活力无显著影响,双氧水和SOCS1siRNA对IPEC-1细胞上清液LDH活性无显著影响;双氧水刺激导致IPEC-1细胞炎性细胞因子白细胞介素-6 (IL-6)、IL-8和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA表达量升高(P0.001),SOCS1siRNA导致IL-6和TNF-αmRNA表达量升高(P0.001)。以上结果表明,双氧水刺激能激活TLR4信号通路,提高SOCS1的表达,干扰SOCS1能促进细胞炎症反应,表明SOCS1可以抑制细胞炎症反应,但是在氧化应激诱导的细胞损伤中并未发挥作用。     

钙对体外培养大鼠成骨细胞增殖分化及细胞周期的影响

在体外培养大鼠成骨细胞的过程中,添加不同剂量的钙(0、1、2、4 mmol/L),通过检测细胞周期、细胞增殖能力、碱性磷酸酶(ALP)活性及骨桥蛋白表达,探讨了钙对成骨细胞增殖分化及细胞周期的影响.结果表明,2、4 mmol/L钙组在1～8 d均显著或极显著地促进成骨细胞增殖(P<0.05或P<0.01),1 mmol/L钙组则在5、6、8 d有显著或极显著的差异(P<0.05或P<0.01);添加不同浓度的钙除1 mmol/L组第2天外的不同时间均极显著地抑制细胞内ALP活性(P<0.01);1 mmol/L钙能极显著的使成骨细胞滞留在S期(P<0.01);添加不同浓度的钙均能使G2期显著或极显著的增加(P<0.05或P<0.01),G1期极显著的下降(P<0.01),并能极显著地诱导细胞内骨桥蛋白的表达(P<0.01).表明添加不同浓度的钙均能抑制其早期分化,促进成骨细胞的增殖,使细胞滞留在S期或G2期,诱导细胞在基质成熟期分化,有利于细胞的钙化.     

赖氨酸对奶牛乳腺上皮细胞内乳糖合成相关基因表达的影响

本试验旨在研究赖氨酸(Lys)对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内乳糖合成相关基因表达的影响,深入探讨Lys对乳糖合成的影响机理。将第3代BMECs随机分为6个组,每组6个重复,各组细胞培养液中Lys的终浓度分别为0.5(对照)、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0 mmol/L,细胞在37℃、5%CO2条件下培养48 h。结果表明:适宜浓度Lys对乳糖含量和葡萄糖转运载体蛋白1(GLUT1)、已糖激酶Ⅰ(HKⅠ)和已糖激酶Ⅱ(HKⅡ)基因表达量的影响呈显著的剂量依赖关系(P0.05);方差分析结果显示,添加Lys显著或趋于显著影响乳糖含量及乳糖合成相关基因表达。与对照组相比,2.0~16.0 mmol/L组乳糖含量较高(0.05P0.10),4.0~16.0 mmol/L组G LUT1基因表达量显著升高(P0.05),2.0~8.0 mmol/L组α-乳清白蛋白(LALBA)和β-1,4-半乳糖基转移酶-1(β-4GALT1)基因表达量显著升高(P0.05),8.0~16.0 mmol/L组HKⅡ基因表达量显著升高(P0.05);但1.0~2.0 mmol/L组HKⅡ基因表达量显著下降(P0.05),4.0~16.0 mmol/L组HKⅠ基因表达量下降,尤以16.0 mmol/L组显著低于对照组(P0.05)。综上所述,Lys对乳糖含量和GLUT1、HKⅠ和HKⅡ基因表达量的影响存在显著的剂量依赖,Lys浓度为2.0~8.0 mmol/L时,对BMECs内乳糖合成促进效果较好。     

漏芦乙醇提取物对奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路的影响

为了探讨漏芦乙醇提取物对奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路的影响,试验以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型,先利用CASY细胞活力分析仪检测漏芦乙醇提取物(质量浓度分别为25,50,100,200,400μg/mL)作用于奶牛乳腺上皮细胞后乳腺上皮细胞的活力和增殖能力,选择添加对细胞生长增殖不受抑制即对细胞无毒性的漏芦乙醇提取物浓度来研究其对奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路信号分子表达的影响。采用确定浓度的漏芦乙醇提取物处理细胞,然后用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路关键信号分子信号转导与转录激活因子5(STAT5)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、胆固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)、过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)和葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)基因的mRNA表达水平,以及采用Western-blot技术检测奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路关键信号分子的蛋白质表达水平。结果表明:较高剂量(200,400μg/mL)的漏芦乙醇提取物显著抑制了奶牛乳腺上皮细胞活力及增殖能力(P0.05),因此选择25,50,100μg/mL的漏芦乙醇提取物来研究其对乳腺上皮细胞泌乳信号通路信号分子表达的影响;25,50,100μg/mL的漏芦乙醇提取物可显著提高细胞泌乳信号通路信号分子STAT5、mTOR、SREBP1、AKT1、GLUT1基因的mRNA表达水平(P0.05)及p-STAT5、p-mTOR、SREBP1、p-AKT1、GLUT1蛋白质表达水平(P0.05),但对PPARγ基因的mRNA表达及蛋白质的表达无显著影响(P0.05)。说明漏芦乙醇提取物能通过调节泌乳信号通路关键信号分子的表达,进而促进奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白、乳脂和乳糖的合成。     

亮氨酸对奶牛乳腺上皮细胞内乳脂合成相关基因和蛋白表达的影响

本试验旨在研究亮氨酸(Leu)对泌乳奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内乳脂合成相关基因和蛋白表达的影响,以探讨Leu对乳脂合成的影响机理。将第3代BMECs随机分为6个处理,每个处理6个重复。6个处理培养液中Leu浓度分别为0.45、0.90、1.80、2.70、3.60和7.20 mmol/L,37℃、5%CO2培养48 h后测定BMECs内甘油三酯(TG)的含量及乳脂合成相关基因和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)与固醇调节元件结合蛋白(SREBP1)蛋白的相对表达量。结果显示:Leu浓度对BMECs内TG含量无显著影响(P0.05)。适宜浓度的Leu显著促进脂肪酸合成酶(FASN)和乙酰辅酶A羧化酶A(ACACA)基因的表达(P0.05),FASN基因的相对表达量以1.80~2.70 mmol/L Leu处理、ACACA基因的相对表达量以1.80~7.20 mmol/L Leu处理较高。Leu浓度显著影响BMECs内SREBP1基因及蛋白表达(P0.05),以1.80 mmol/L Leu的促进效果最好。虽然Leu显著抑制BMECs内脂肪酸结合蛋白3(FABP3)、脂蛋白脂酶(LPL)、乙酰甘油磷酸脂酰转移酶6(AGPAT6)、线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAM)和嗜乳脂蛋白亚家族1成员1(BTN1A1)基因的表达(P0.05),但只有高浓度(3.60~7.20 mmol/L)的Leu抑制作用较大。综合来看,Leu浓度影响BMECs乳脂合成相关基因及PPARγ和SREBP1蛋白的表达。Leu浓度为1.80~2.70 mmol/L时,对脂肪酸从头合成相关基因及调控因子SREBP1蛋白表达的促进效果较好,对TG合成及脂滴形成相关基因表达的抑制作用较小。     

蜂胶对细菌脂多糖刺激下奶牛乳腺上皮细胞炎症相关基因mRNA转录水平和紧密连接蛋白的影响

本试验旨在研究中国蜂胶乙醇提取物(ethanol extract of Chinese propolis,EECP)对细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激下体外培养奶牛乳腺上皮细胞炎症相关基因mRNA转录水平和紧密连接渗透性的影响。EECP中总酚酸和总黄酮含量测定采用福林酚法和硝酸铝法,并建立LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,MAC-T)炎症模型,采用CCK-8法测定EECP对MAC-T相对增殖率的影响,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)评估EECP对LPS诱导的MAC-T细胞炎症相关因子(IL-6、IL-8、TNF-α和IL-1β)相对mRNA转录水平;以及对紧密连接蛋白(occludin、ZO-1)相对mRNA转录水平进行检测,并进一步利用免疫荧光技术对紧密连接膜蛋白进行定位,确定EECP对LPS诱导MAC-T细胞炎症紧密连接渗透性的影响。结果显示:EECP中总酚酸含量为106.35 mg没食子酸当量(GAE)·g~(-1)、总黄酮含量为320.85 mg芦丁当量(RE)·g~(-1);CCK-8结果显示EECP的安全浓度为0～15μg·mL~(-1),并可有效提高LPS刺激下MAC-T的活力;LPS刺激显著增加了细胞炎症相关因子IL-6、IL-8、TNF-α和IL-1βmRNA的转录量(P0.001);但2.5～15.0μg·mL~(-1) EECP预处理显著降低了IL-6、IL-8、TNF-α和IL-1βmRNA的转录量;与此类似,LPS刺激显著抑制了紧密连接蛋白基因(occludin、ZO-1)mRNA的转录量(P0.01),而EECP预处理后紧密连接蛋白基因(occludin和ZO-1) mRNA的转录量显著增加(P0.05);免疫荧光染色试验也证实EECP能通过上调紧密连接蛋白(occludin、ZO-1)的表达,缓解LPS诱导的乳腺上皮细胞屏障功能紊乱。该结果证实,EECP对细菌脂多糖诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症具有良好的保护作用,这为利用中国蜂胶预防奶牛乳腺炎提供了试验基础。     

L.fermentum 1.2029对坏死性肠炎肉鸡回肠上皮紧密连接蛋白表达的影响

将240只AA肉鸡随机分为3个处理组:对照组、坏死性肠炎(Necrotic enteritis,NE)模型组及乳酸杆菌处理组。28日龄,每组屠宰24只鸡,对各组肉鸡肠道损伤进行肉眼评分,并采集回肠黏膜样本分别用于电镜下形态观察和Real-time PCR检测紧密连接蛋白claudin-1和occludin的表达。结果显示,乳酸杆菌处理组降低了炎症的损伤程度(P<0.05);电子显微镜观察显示,乳酸杆菌处理组鸡回肠上皮微绒毛较NE模型组有改善;real-time PCR分析显示,乳酸杆菌处理组claudin-1和occludin的表达显著高于NE模型组(P<0.05),但与对照组没有差异。该试验结果表明,L.fermentum1.2029可降低NE的损伤程度,并能有效上调NE条件下claudin-1和occludin的表达,显示其具有保护肠道屏障功能的作用。     

藿香挥发油 黄柏生物碱对高温刺激下IEC-6细胞分泌SOD GSH-Px和MDA的影响

探讨不同浓度的藿香挥发油,黄柏生物碱对高温刺激下IEC-6细胞SOD、GSH-Px和MDA的影响。建立IEC-6细胞株的高温刺激模型,添加适宜浓度的藿香挥发油和黄柏生物碱.检测上述指标的变化。结果表明,高温刺激能显著降低IEC-6细胞增殖(P0.05);200g/mL的藿香挥发油和100g/mL的黄柏生物碱都能使高温刺激下IEC-6细胞SOD、GSH-Px水平极显著(P0.01)升高和降低;MDA含量极显著(P0.01)降低。结论:藿香挥发油和黄柏生物碱能显著改善高温刺激诱导的IEC-6细胞增殖、SOD、GSH-Px和MDA分泌的变化,提高细胞抗氧化能力。