钩状木霉和哈茨木霉菌对人参土壤理化性质及真菌群落结构的影响

为研究不同木霉菌对栽培人参土壤的改良作用,分析木霉菌对土壤养分和土壤真菌群落结构与功能特征的影响。采用人参盆栽试验,添加外源木霉菌（钩状木霉DH3、MM3、MM4、Q7 4种菌株和哈茨木霉MM6菌种）后,分析土壤理化性质以及土壤微生物群落多样性变化。添加不同外源木霉菌处理后人参土壤理化性质发生变化,土壤pH值无显著变化,土壤全氮、有机质、铵态氮、硝态氮、有效磷、速效钾含量显著增加（P<0.05）,而碳氮比（C/N）在添加木霉菌处理中降低,其中钩状木霉MM3和哈茨木霉MM6两株菌的理化性质表现最好。ITS测序分析获得703个OTUs,涵盖了8门、26纲、46目、86科、141属。木霉菌处理后土壤真菌微生物α多样性指数（ACE、Chao1）增加,尤其是钩状木霉MM3;钩状木霉MM3中的主要特征种群是肉座菌科（Hypocreaceae）和木霉菌属（Trichoderma）,哈茨木霉MM6的主要特征种群是毛壳菌科（Chaetomiaceae）。冗余分析（RDA）发现,土壤C/N和硝态氮是影响土壤环境中微生物多样性的主要因素;相关分析表明,刺球菌属（Chaetosphaeria）与土壤全氮...     

食用菌链孢霉的发生特点与综合防治技术

链孢霉（Neurospora spp）又叫脉孢霉、串珠霉、红色面包霉,俗称红霉菌,常见的有粗糙链孢霉（Neurospora crassa）和好食链孢霉（Neurospora sitophila）,是食用菌生产中重要的竞争性杂菌之一。其生活周期短,扩散蔓延快,广泛分布于自然界土壤中和禾本科植物上,尤其在玉米芯上极易发生,主要以分生孢子靠气流传播,     

生物质炭介导生防微生物抑制辣椒疫霉的作用

生物质炭可有效防控土传病害,筛选并鉴定出生物质炭介导下的生防微生物,可为研究生物质炭防病机理和强化生物质炭防病效果提供理论依据。本研究首先进行秸秆生物质炭防控辣椒疫病盆栽试验,利用定量PCR和平板计数明确生物质炭在防控辣椒疫病时可富集的已知生防微生物,再通过选择性培养基初筛和定殖复筛筛选出生物质炭可富集的潜在生防微生物菌株,最后研究各菌株在土壤中对辣椒疫霉的抑制作用。结果表明,秸秆生物质炭使根际辣椒疫霉数量显著降低95.1%、辣椒疫病发生率显著降低91.1%,并使具有生防功能的木霉菌、青霉菌、曲霉菌、芽孢杆菌、假单胞菌和鞘氨醇单胞菌数量显著增加2.22倍、4.09倍、3.89倍、2.45倍、1.45倍和1.30倍。通过平板初筛得到可能被生物质炭富集的22株潜在生防菌株。定殖复筛剔除部分假性生物质炭介导菌株,获得可明确被生物质炭富集的2株木霉菌、3株青霉菌、2株曲霉菌、3株芽孢杆菌、3株假单胞菌、3株链霉菌和2株鞘氨醇单胞菌。木霉菌（TR1和TR3）、青霉菌（PE1）、曲霉菌（AS1和AS2）、芽孢杆菌（BA1、BA2和BA3）、假单胞菌（PS1和PS3）、链霉菌（ST1、ST4和ST5）13个菌株可显著削减土壤辣椒疫霉数量。其中,所有木霉菌和曲霉菌菌株（TR1、TR3、AS1和AS2）及芽孢杆菌（BA1和BA2）、假单胞菌（PS1和PS3）和链霉菌（ST1）9个菌株与生物质炭具有显著的协同抑制辣椒疫霉效果。因此,防控辣椒疫病时,木霉菌、曲霉菌、芽孢杆菌、假单胞菌和链霉菌是生物质炭介导下的主要防病微生物。     

根癌农杆菌介导的绿色木霉HP35-3转化及表达体系的构建

本研究通过根癌农杆菌介导转化法,构建丝状真菌绿色木霉HP35-3的遗传转化表达体系,并以红色荧光蛋白基因（DsRed2）为报告基因来验证本表达体系。首先构建含有潮霉素抗性基因（HygR）、磷酸甘油醛脱氢酶启动子（Pgpd）和红色荧光蛋白基因（DsRed2）的双元载体pCAMT-CPRFP。然后将该双元载体转化到根癌农杆菌EHA105中,并筛选阳性转化子。将该转化子和绿色木霉HP35-3分生孢子进行液体共培养,并在含有150μg/mL潮霉素抗性平板上筛选出绿色木霉HP35-3RFP阳性转化子。最后分别通过如下三种方法检测：提取HP35-3RFP的总DNA进行PCR验证;对菌丝体进行荧光显微镜观察;对菌丝体提取物进行荧光酶标仪检测。结果表明：获得的转化子能够稳定遗传,外源红色荧光蛋白基因整合到木霉HP35-3的基因组中并成功表达。     

被孢霉对土壤养分有效性和秸秆降解的影响

腐生真菌被孢霉在富含有机质的土壤中丰度很高,为土壤碳及养分转化的关键微生物成员。然而目前关于土著被孢霉在秸秆分解过程中对土壤养分有效性影响的研究较少。采用常规平板稀释法从长期施用有机肥的红壤和砂姜黑土中分离真菌菌株,将分离得到的菌株序列与基因库（GenBank）中的序列进行比较,鉴定出了两株被孢霉菌株,即高山被孢霉（Mortierella alpina）和长孢被孢霉（Mortierella elongata）。通过设置盆栽试验,每盆土接种10 g菌剂,研究两株被孢霉对秸秆降解过程中土壤养分有效性和细菌群落的影响。结果表明,在红壤中,与未接种对照相比,接种高山被孢霉处理的土壤有效磷含量提高了29.0%,长孢被孢霉处理下土壤有效氮含量和β-葡萄糖苷酶活性分别提高了15.5%和81.3%。在砂姜黑土中,与对照相比,被孢霉菌株显著提高了土壤可溶性有机碳,速效氮和有效磷的含量以及β-葡萄糖苷酶和磷酸酶的活性。两株被孢霉在红壤中抑制了秸秆的降解,并显著改变细菌群落组成。而在砂姜黑土中,被孢霉菌株促进了秸秆降解,且对细菌群落结构影响不大。在红壤中,苍白杆菌属（Ochrobactrum）、无色杆菌属（...     

食用菌栽培相关木霉种的鉴定

从木霉污染的食用菌菌筒和子实体中分离纯化了49株木霉菌株。采用形态学方法以及ITS/5.8S测序分析,对这些木霉菌进行了分类鉴定。结果表明,中国福建、浙江等省食用菌栽培相关木霉种以哈茨木霉Trichoderma harzianum Rifai和长枝木霉T. longibrachiatum Rifai为主,少量为深绿木霉 T. atroviride Karsten和棘孢木霉T. asperellum Samuels;木霉污染菌的种类与采集地点、食用菌的种类有一定相关,如在浙江庆元香菇Lentinus edodes (Berk.)sing菌筒中分离的木霉主要是哈茨木霉,在广州刺芹侧耳（杏鲍菇）Pleurotus enyngii菌筒中分离的木霉主要是棘孢木霉,而从福建浦城食用菌污染袋中分离的木霉主要是深绿木霉。两种分类方法对木霉鉴定结果基本一致,因此形态学分类方法结合分子生物学方法使食用菌栽培相关木霉种的分类鉴定更准确和可靠。     

多功能木霉的筛选及鉴定

测定了60株分离自土壤的木霉菌株的解磷解钾、拮抗和对有机磷农药毒死蜱的耐受、降解等功能。结果表明,5株木霉具有很好的解磷能力,其中木霉T-404的解磷效果最好,为109.22 mg·L-1。6株木霉具有明显的解钾透明圈,但是液体培养后测定发现木霉的解钾能力不强。木霉具有不同程度的拮抗作用,其中6株木霉的拮抗能力很好。大部分木霉可以耐受高浓度的毒死蜱,但是不能降解该农药。对5株具多功能潜力的优势木霉菌株进行形态学和分子生物学鉴定表明：T-403、T-404、T-440为Trichoderma koningiopsis,T-400、T-450为Trichoderma koningii。     

牛分枝杆菌CFP-10基因的表达和重组蛋白的纯化

根据GenBank中牛分枝杆菌的基因序列,设计合成一对扩增CFP-10基因完整ORF的特异性引物,以pET32a（＋）为载体构建重组表达载体CFP-10／pET32a（＋）。重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）,经0．9mmol／LIPTG37。C诱导3h后表达,收集菌体并裂解,裂解后上清和沉淀经SDS—PAGE分析,结果表明融合蛋白分子量分别为30kD,表达产物以可溶性存在于上清中,后经Ni．NTA吸附柱方法对目的蛋白进行纯化,经薄层凝胶扫描分析,纯化后的His融合蛋白纯度达95％,该CFP-10表达蛋白可作为体外诊断抗原,为进一步建立检测牛分枝杆菌的方法奠定基础。     

液态发酵饲料连续发酵工艺

为建立一套液态发酵饲料的连续生产工艺,该研究以玉米-豆粕-麦麸混合物为发酵基质进行液态发酵菌株的筛选,通过监测发酵过程中液态饲料的pH值、乳酸菌数量、大肠杆菌数量、霉菌数量、酵母菌数量、酸溶蛋白质含量、可溶性糖含量等指标变化规律探究发酵菌株、连续发酵过程中保留比例、发酵温度、外源苯甲酸和外源酶制剂对发酵进程的调控及饲料营养价值的影响。结果表明：1）筛选出的乳酸菌菌株28-7具有较强的大肠杆菌抑制能力和产乳酸能力,发酵6 h时饲料pH值下降到4.45,发酵饲料中未检出大肠杆菌;2）接种乳酸菌28-7的连续发酵过程中,20%、30%、50%的保留比例对发酵饲料的pH值、乳酸菌数量、霉菌数量的影响差异不大,大肠杆菌均无检出,20%的保留比例可使连续发酵正向进行;3）外源非淀粉多糖酶的加入可显著提高发酵饲料中酸溶蛋白含量、酸溶蛋白/粗蛋白质比值和可溶性糖含量（P<0.05）,外源苯甲酸的加入可有效抑制发酵过程中霉菌的增殖。4）37 ℃条件下发酵可显著提高饲料中酸溶蛋白含量、酸溶蛋白/粗蛋白质比值（P<0.05）,3～12 、20 、37 ℃条件下获得的饲料的pH值<4.0、乳酸菌数量大于1010 CFU/mL,大肠杆菌、酵母、霉菌未检测出。综上,本研究建立的液态发酵生产工艺为：将乳酸菌28-7（接种量1.0×108 CFU/mL）、非淀粉多糖酶（250 g/kg）、苯甲酸（0.1 g/kg）于发酵起始时同时加入,以24 h为发酵周期、20%的保留比例在3～12 （冬季室温）、20 （春秋平均室温）、37 ℃（夏季平均室温）条件下进行生产。该工艺生产所得的液态发酵饲料色泽淡黄,富有温和的酸香味,饲料pH值<4.0,乳酸菌数量>1010 CFU/mL,酸溶蛋白含量、酸溶蛋白/粗蛋白质比值均显著提升（P<0.05）,霉菌、酵母、大肠杆菌无检出,相比春、秋、冬3季,夏季生产更有利于饲料酸溶蛋白含量的提升（P<0.05）。     

外包木霉内含芽孢杆菌颗粒生物有机肥研制及其促生效应

  目的  利用造粒喷涂技术,研制了外包木霉菌内含芽孢杆菌（SQR9）的颗粒复合菌生物有机肥,以辣椒为供试作物,利用盆栽试验,研究了新型生物有机肥对辣椒植株株高、茎粗、叶绿素等农艺性状的影响。  方法  首先利用圆盘造粒机将有机肥、芽孢杆菌和适量粘合剂制成颗粒芽孢杆菌生物有机肥,随后,再将真菌木霉孢子喷涂颗粒表面,利用第一次添加的粘结剂形成外包真菌孢子膜的新型颗粒复合菌生物有机肥。  结果  货架期试验结果表明,颗粒肥料中木霉菌比粉状肥料存活能力更强,在储存60天后,新型颗粒复合菌生物有机肥中木霉菌含量大于2 × 107 cfu g?1,芽孢杆菌数量大于1.2 × 108 cfu g?1。盆栽试验结果表明,在种植47天后,施用新型颗粒复合菌生物有机肥的辣椒植株在株高、茎粗、叶绿素、鲜重和干重方面均高于其他处理（含SQR9颗粒生物有机肥、含SQR9和木霉菌的粉状生物有机肥、含木霉菌颗粒生物有机肥和含SQR9和木霉菌的颗粒生物有机肥处理）,表明了该新型颗粒复合菌生物有机肥对辣椒具有明显的促生效果。  结论  相比于单菌和其他工艺研制的复合菌生物有机肥,外包木霉真菌内含芽孢杆菌新型颗粒复合菌生物有机肥能够充分发挥木霉真菌和芽孢杆菌的促生功能,有效增强复合菌生物有机肥的促生效果。