鸡HspHsp90α可溶性表达及与传染性法氏囊病病毒衣壳蛋白亲和力的鉴定

热激蛋白90α(Heat shock protein 90,Hsp90α)在传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease,IBDV)的致病过程中发挥重要作用。蛋白互作及其亲和力均可能导致不同的信号转导和生物效应,鸡源Hsp90α与IBDV衣壳蛋白VP2的互作已经被证明,但两者之间的亲和力尚未被鉴定。研究通过表达和纯化鸡的Hsp90α和IBDV超强毒株的VP2蛋白,运用表面等离子共振(Surface plasmon resonance,SPR)技术,揭示Hsp90α和IBDV VP2蛋白两者互作的动态过程,并确定其亲和力((KD)为7.105×10~(-8)M),为强相互作用。研究结果对进一步揭示IBDV的致病机制有重要意义。     

乙型脑炎病毒E蛋白高亲和性多肽的筛选及鉴定

利用分子对接技术筛选出能识别乙型脑炎病毒E蛋白的高亲和性多肽序列。利用大肠杆菌原核表达系统表达乙型脑炎病毒E蛋白,并对其进行纯化。借助分子对接及虚拟肽库筛选技术设计多条针对E蛋白的多肽序列,通过酶联免疫吸附试验和表面等离子共振试验对多肽与靶标蛋白的结合情况进行筛选及鉴定。结果显示:成功表达E蛋白,并利用该蛋白筛选出了A、B两条特异性多肽序列,经检测,A、B多肽序列特异性和亲和性达到阳性血清水平。证明了利用分子对接技术设计的多肽可以与乙型脑炎病毒E蛋白特异性结合。     

鸡plgR多克隆抗体的制备及初步鉴定

根据GenBank中鸡pIgR基因序列和蛋白序列,设计引物,利用PCR技术扩增胞外配体结合区片段,构建原核重组表达质粒pET-32a(+)/pIgR,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG的诱导表达融合蛋白,通过镍离子螯合柱纯化后免疫新西兰大白兔,获得兔抗鸡pIgR多克隆抗体,通过酶联免疫吸附试验(ELISA法)和Western Blot法检测抗体的效价和特异性。结果显示,成功制备特异性的鸡pIgR抗体,为研究鸡pIgR的功能提供有力依据。     

重组鸡白细胞介素-6(rChIL-6)对传染性法氏囊灭活疫苗的免疫增强机理研究

为了评价重组鸡白细胞介素-6(rChIL-6)蛋白在鸡体内的免疫增强作用机理,本研究将40只7日龄健康SPF鸡随机平均分为4组以进行rChIL-6蛋白对鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)灭活疫苗免疫增强作用试验,于14日龄时进行免疫接种和rChIL-6蛋白注射。分别检测4组鸡免疫前和免疫后不同时间血清中IBDV抗体水平、不同细胞因子表达水平、脾淋巴细胞增殖活性和外周血T淋巴细胞增殖活性等指标以揭示rChIL-6蛋白在机体内对疫苗的免疫增强机理。结果表明:免疫后7⁴9d,rChIL-6蛋白与IBDV灭活疫苗共免疫组(第4组)鸡血清中IBDV抗体水平极显著高于IBDV灭活疫苗对照组(P<0.01);免疫后749d,rChIL-6蛋白与IBDV灭活疫苗共免疫组(第4组)鸡血清中IBDV抗体水平极显著高于IBDV灭活疫苗对照组(P<0.01);免疫后7³5d,第4组鸡血清中的白细胞介素-4、6、2(ChIL-4、ChIL-6、ChIL-2)和γ干扰素(ChIFN-γ)等4种细胞因子的表达水平极显著高于其他3组对照组(P<0.01),α干扰素(ChIFN-α)的表达水平于免疫后1435d,第4组鸡血清中的白细胞介素-4、6、2(ChIL-4、ChIL-6、ChIL-2)和γ干扰素(ChIFN-γ)等4种细胞因子的表达水平极显著高于其他3组对照组(P<0.01),α干扰素(ChIFN-α)的表达水平于免疫后14³5d期间极显著高于其他3组对照鸡(P<0.01);rChIL-6蛋白单独应用后可显著提高机体的ChIL-4、ChIL-6和ChIL-2的表达水平,但对ChIFN-γ、ChIFN-α的表达水平无明显影响。免疫后735d期间极显著高于其他3组对照鸡(P<0.01);rChIL-6蛋白单独应用后可显著提高机体的ChIL-4、ChIL-6和ChIL-2的表达水平,但对ChIFN-γ、ChIFN-α的表达水平无明显影响。免疫后7¹4d,第4组鸡的脾淋巴细胞增殖活性显著高于其他3组对照鸡(P<0.01);免疫后714d,第4组鸡的脾淋巴细胞增殖活性显著高于其他3组对照鸡(P<0.01);免疫后7²1d,第4组鸡的外周血T淋巴细胞的增殖活性稍高于其他3组对照组(P>0.05)。结果表明,rChIL-6在体液免疫和细胞免疫水平对鸡传染性法氏囊灭活疫苗免疫后均具有免疫增强作用;对机体体液免疫应答的增强能力高于细胞免疫应答。     

鸡源SUMO标签蛋白的鉴定及在IBDV VP2原核表达中的促溶功能

VP2蛋白是传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)的保护性抗原。原核表达中能否获得具有天然构象的可溶性VP2蛋白是研发IBD亚单位疫苗的关键问题。为了解是否存在鸡自体促溶标签蛋白以及外源促溶标签能否在一定程度上促进蛋白的正确折叠,试验对不同物种来源的类泛素蛋白修饰分子(small ubiquitin-like modifier,SUMO)进行比对研究。结果显示,获取到的3种鸡源SUMO蛋白与酵母源SUMO蛋白的氨基酸同源性均高于40%,其中SUMO-1与SUMO-3两种蛋白可以在大肠杆菌中可溶性表达;通过SUMO-1、SUMO-3与VP2蛋白的融合表达,证明了鸡源SUMO蛋白对VP2具有促溶效果,得到的重组菌株P-28A-s1-VP2和P-28A-Os3-VP2琼脂扩散效价均达到1∶16;经过纯化后,融合蛋白SUMO-1-VP2的琼脂扩散效价可达到1∶256;使用SUMO蛋白酶酶切融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot结果表明鸡源SUMO蛋白可以被成功切割,说明试验发现的鸡源SUMO蛋白可以作为促溶标签,在亚单位疫苗关键抗原表达中具有广阔的应用前景。     

3种TLR配体对猪圆环病毒2型病毒样颗粒疫苗佐剂活性的比较

为比较3种TLR配体对猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLP)疫苗的佐剂活性,本研究利用重组大肠杆菌表达脑膜炎奈瑟菌Ag473脂蛋白、创伤弧菌FlaB鞭毛蛋白和结核分枝杆菌热应激蛋白70(Hsp70),采用镍亲和柱纯化获得该3种重组蛋白;分别将相同剂量(10μg)3种重组蛋白、ISA206佐剂(100μL)和不完全弗氏佐剂(FIA)(100μL)与PCV2 VLP疫苗(50μg)混合,肌肉注射免疫小鼠,初免后14 d加强免疫1次;初免后每周采血分离血清,采用ELISA检测抗原特异抗体;加强免疫后14 d利用PCV2攻毒,攻毒后7 d和14 d采血分离血清,采用荧光定量PCR检测病毒DNA拷贝数;攻毒后14 d迫杀小鼠,制备并培养其脾细胞,经PCV2 VLP疫苗刺激后,采用试剂盒检测细胞因子的表达。SDS-PAGE分析结果显示,3种TLR配体在重组大肠杆菌中均获得正确表达,纯化重组蛋白的纯度大于90%。从初免14 d起,3个分子佐剂组中Ag473佐剂组的PCV2抗体水平最高,但低于ISA206佐剂组却高于FIA组,差异不显著(p0.05)。在PCV2攻毒前,3个分子佐剂组中Ag473佐剂组的小鼠脾细胞TNF-α和IFN-γ表达水平最高,但低于ISA206佐剂组却高于FIA组,差异显著(p0.05);Hsp70佐剂组的IL-4表达水平最高,Ag473佐剂组次之,但均高于ISA206和FIA组。在攻毒后第7 d,5个免疫组小鼠的病毒拷贝数均较对照组显著下降(p0.05),但免疫组间差异不显著;在攻毒后第14 d,5个免疫组小鼠的病毒拷贝数进一步下降,免疫组间差异不显著。研究结果表明在测试的3种分子佐剂中,Ag473脂蛋白具有较强的总体免疫佐剂活性,有望进一步开发为PCV2等病毒的亚单位疫苗佐剂。     

鸡催乳素和抑制素-α亚基重组蛋白的构建及表达

将鸡催乳素 (PRL)和抑制素 - α亚基 (INB- α)基因编码序列重组为融合基因 ,制备了同时包含这 2种激素基因的融合蛋白。通过 PCR和分子克隆的方法首先将全部粤黄鸡 PRL成熟肽 c DNA克隆到载体 p RSET A的 Bgl 和 Eco R 克隆位点之间 ,获得重组质粒 p PRL- RSET。鸡 INB- α片段经扩增后分别被克隆到质粒 p RSET A和 p PRL- RSET的 Nhe 和 Xho 克隆位点之间 ,获得重组质粒 p INB- RSET和 p INB- PRL。以上重组质粒构建的正确性分别由各特定引物组合扩增的 PCR产物长度、特定限制性内切酶消化各重组质粒所得产物长度以及对各质粒的测序结果得到验证。重组质粒 p PRL- RSET和 p INB- PRL 转化 E.coli BL2 1(DE3)株 ,IPTG诱导后所表达的产物经 SDS- PAGE显示 ,其分别与所预期的重组蛋白分子大小相符。质粒 p PRL - RSET和 p INB- PRL的表达产物和用 Ni- NTA凝胶纯化的 2重组蛋白产物都可与抗鸡 PRL 抗体产生特异的免疫印迹 ,并且表达菌裂解液和相应纯化蛋白的免疫印迹处于同一位置。结果说明 ,试验已成功完成了鸡 PRL、INB-α及 2者融合蛋白的构建、表达和纯化     

鸡Mx蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

Mx蛋白为GTP酶动态蛋白家族成员,已被证明具有抗禽流感病毒、Thogoto病毒和水泡性口膜炎病毒等的作用.为制备鸡Mx蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究以原核表达并纯化的鸡Mx蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,分离脾细胞与SP2/0细胞融合,采用间接ELISA方法筛选阳性克隆,经3次细胞克隆纯化后获得4株稳定分泌抗鸡Mx蛋白抗体的杂交瘤细胞株.间接ELISA测定4株MAb纯化后腹水的效价介于1∶3.2×104～1∶2.5×105之间.Westem blot结果证实4株MAb均具有良好的反应性;间接免疫荧光试验表明其中一株MAb与真核表达的鸡Mx蛋白发生反应.本研究为鸡Mx蛋白功能及表达鸡Mx蛋白的转基因动物等研究奠定了基础.     

鸡膜联蛋白A2的原核表达与纯化

试验旨在对鸡膜联蛋白A2(ANXA2)基因进行原核表达与纯化。利用鸡ANXA2基因特异性引物从鸡卵泡细胞cDNA中扩增ANXA2基因,亚克隆至原核表达载体p ET-32a(+)构建重组原核表达载体pET-32a-chANXA2。将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,并分析重组蛋白的表达形式;利用含Ni2+琼脂球对重组蛋白进行纯化,并利用Western blot进行鉴定。结果显示:成功构建重组原核表达载体pET-32a-chANXA2,重组蛋白His-chANXA2在0.1 mmol/L IPTG、诱导表达5 h和30℃诱导温度条件下表达量高,其在上清和包涵体中均有表达,但主要以包涵体形式存在。利用含Ni2+琼脂球从诱导菌裂解物上清中得到了纯度较高的重组蛋白,Western blot检测到与预期大小相符的重组蛋白条带。研究结果为后续开展ANXA2调控鸡卵泡发育的分子机制研究奠定基础。     

堆型艾美球虫侵入相关蛋白MIC3受体分子VAPB的克隆与表达

堆型艾美球虫感染具有寄生部位特异性,其寄生区位于鸡十二指肠,但造成这种特异性的机制尚不清楚。为研究在球虫侵入过程中可能起重要作用的配体-受体分子,对堆型艾美球虫侵入相关蛋白微线蛋白3(MIC3)的受体分子VAPB进行克隆及表达。从鸡十二指肠中分离获得肠道上皮细胞,提取细胞RNA,利用RT-PCR技术扩增VAPB基因。分析VAPB基因的分子特征,构建重组表达质粒pET-32a-VAPB,利用大肠杆菌对其进行表达、纯化,并制备大鼠抗重组VAPB蛋白多抗。序列分析揭示了VAPB具有一个完整的开放性阅读框,含有732个碱基对,编码244个氨基酸组成的分子量约为26.8 kD的蛋白,其重组蛋白rVAPB分子量约为45 kD。序列分析表明其等电点约为7.30,无信号肽,含跨膜区、多个O-糖基化位点和磷酸化位点;进化树分析表明鸡的VAPB氨基酸序列与一些动物如Numida meleagris和Coturnix japonica等亲缘关系较近。原核表达、纯化重组蛋白VAPB并获得抗rVAPB大鼠血清。Western blot分析表明鸡十二指肠上皮细胞中的天然VAPB蛋白可被抗rVAPB大鼠血清识别。结果表明:成功制备了重组蛋白VAPB及抗rVAPB大鼠血清,为研究VAPB蛋白在堆型艾美球虫侵入过程的作用提供基础。     

鸡IL—15基因的分子克隆及其有关特性的研究

实验应用聚合酶链式反应技术从鸡脾淋巴细胞中克隆得到了白细胞介素-15基因，序列分析表明与已发表的鸡白细胞介素-15基因完全一致，核苷酸序列和推导的氨基酸序列与牛的最接近，同源性分别为46%和31%，与哺乳动物白细胞介素-15序列类似，有4个高度保守的半胱氨酸残基，同时本研究也用此方法对鸡脾脏、法氏囊、胸腺、哈德氏腺和盲肠扁桃体等淋巴器官的淋巴细胞中鸡白细胞介素-15mRNA的表达进行了研究，结果表明这些器官的淋巴细胞均表达mRNA。在实验还用有丝分裂原ConA对鸡脾淋巴细胞进行活化，观察活化的淋巴细胞表达白细胞介素-15mRNA的情况，结果发现白细胞介素-15mRNA在活化的脾淋巴细胞中表达量升高。     

Methionine deficiency and its hydroxy analogue influence chicken intestinal 3-dimensional organoid development

Methionine and its hydroxy analogue(MHA)have been shown to benefit mouse intestinal regeneration.The intestinal organoid is a good model that directly reflects the impact of certain nutrients or chemicals on intestinal development.Here,we aimed to establish a chicken intestinal organoid culture method first and then use the model to explore the influence of methionine deficiency and MHA on intestinal organoid development.The results showed that 125-mm cell strainer exhibited the highest efficiency for chicken embryo crypt harvesting.We found that transforming growth factor-b inhibitor(A8301)supplementation promoted enterocyte differentiation at the expense of the proliferation of intestinal stem cells(ISC).The mitogen-activated protein kinase p38 inhibitor(SB202190)promoted intestinal organoid formation and enterocyte differentiation but suppressed the differentiation of enteroendocrine cells,goblet cells and Paneth cells.However,the suppression of enteroendocrine cell and Paneth cell differentiation by SB202190 was alleviated at the presence of A8301.The glycogen synthase kinase 3 inhibitor(CHIR99021),valproic acid(VPA)alone and their combination promoted chicken intestinal organoid formation and enterocyte differentiation at the expense of the expression of Paneth cells and goblet cells.Chicken serum significantly improved organoid formation,especially in the presence of A8301,SB202190,CHIR99021,and VPA,but inhibited the differentiation of Paneth cells and enteroendocrine cells.Chicken serum at a concentration of 0.25%meets the requirement of chicken intestinal organoid development,and the beneficial effect of chicken serum on chicken intestinal organoid culture could not be replaced by fetal bovine serum and insulin-like growth factor-1.Moreover,commercial mouse organoid culture medium supplemented with A8301,SB202190,CHIR99021,VPA,and chicken serum promotes chicken organoid budding.Based on the chicken intestinal organoid model,we found that methionine deficiency mimicked by cycloleucine suppressed organoid formation and organoid size,and this effect was reinforced with increased cycloleucine concentrations.Methionine hydroxy analogue promoted regeneration of ISC but decreased cell differentiation compared with the results obtained with L-methionine.In conclusion,our results provide a potentially excellent guideline for chicken intestinal organoid culture and insights into methionine function in crypt development.     

鸡用缓释复方免疫增强剂的筛选试验研究

选择14日龄雏鸡110只,随机均分为11组,Ⅰ组为对照组,Ⅱ～Ⅺ为试验组,各组雏鸡在14日龄时均颈部皮下注射鸡ND—La Sota疫苗0．2ml／只．试验组雏鸡同时经口投服由不同配方和比例黄芪多糖、淫羊藿多糖、左旋咪唑、维生素E和亚硒酸钠制备的10种缓释复方免疫增强剂1粒,对照组雏鸡不投服。在免疫前后不同时间采血测定各组雏鸡ND—HI抗体效价和T淋巴细胞ANAE阳性率．结果表明制备的10种缓释复方免疫增强剂均不同程度地提高了雏鸡ND—HI抗体效价和T淋巴细胞ANAE阳性率．其中以X组和Ⅺ组配方效果最好,为今后研制缓释复方免疫增强剂奠定了基础。     

福建省鸡住白虫病的流行调查

本文报告福建省鸡住白虫病的流行病学调查结果。病原有两种：沙氏住白虫和卡氏住白虫。沙氏住白虫在全省广泛分布，平均感洒率达３４．０％，卡氏住白虫只在少数地区流行。后宽绳蚋是福建省鸡沙氏住白虫病的自然传播煤介。     

饲粮锰对蛋鸡组织锰含量及其生长发育和生产性能的影响

本试验研究了饲粮不同锰水平对蛋鸡组织器官中锰含量及其生长发育、产蛋性能和孵化效果的影响。结果表明:羽毛、消化道、肝脏、胫骨和肾脏中的锰量都随饲粮锰的提高而显著增加(P<0.01)。当雏鸡饲粮锰含量在13.5ppm时,锰在体内沉积出现负平衡,雏鸡脱腱症出现率为5.21％。产蛋鸡第1组(17.8ppm Mn)的产蛋率低于其它五组(P<0.01),饲粮低锰使破蛋率和软蛋率显著升高(P<0.01),第3组(73.8ppm Mn)破蛋率最低,第5组(153.8ppm Mn)软蛋率最低。其次,饲粮高锰和低锰都使蛋壳厚度和强度降低(P<0.01),同时也降低受精率(P>0.05)。受精蛋孵化率以第3组(73.8ppm Mn)最高(P<0.01),并可有效地防止雏鸡脱腱症的发生。作者建议,产蛋前期母鸡饲粮含锰在73.8——153.8ppm为佳;种鸡则为73.8——113.8ppm;而在蛋鸡生长发育阶段,饲粮含锰不得低于33.5ppm。     

雏鸡在感染IBDV后血浆cAMP、cGMP和IL-2水平变化

在经ＩＢＤ弱毒苗免疫和未免疫的３０～５９日龄ＡＡ鸡研究了感染ＩＢＤＶ后血浆ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ和ＩＬ２水平动态变化。结果表明：未免疫攻毒鸡（Ａ组）、免疫攻毒鸡（Ｂ组）和未免疫未攻毒鸡（Ｃ组）在ＩＢＤＶ攻毒前１天血浆ｃＡＭＰ和ｃＧＭＰ水平Ｂ组明显高于Ａ和Ｃ组,ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ比值同样是Ｂ组高于或明显高于Ａ和Ｃ组,ＩＬ２水平三组之间无明显差异。在攻毒后的头５天内,Ｂ和Ｃ组ｃＡＭＰ明显升高,而Ａ组没有类似的变化,第５天明显低于Ｂ和Ｃ组,以后Ｂ和Ｃ组仍高于或显著高于攻毒前和同期Ａ组水平。在攻毒后Ａ和Ｂ组ｃＧＭＰ均呈波动性上升趋势,第７天明显高于攻毒前水平并高于Ｃ组,以后Ａ、Ｂ、Ｃ三组均下降,但Ａ组比Ｂ和Ｃ组下降更快。在攻毒后２８天内,Ａ组ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ比值无明显变化,Ｂ组波动上升,Ｃ组处于高水平上,Ｂ和Ｃ组均高于或明显高于Ａ组。血浆ＩＬ２水平Ａ和Ｂ组在ＩＢＤＶ攻毒后的头７天内呈逐渐下降趋势,但Ａ组下降的更剧烈,Ｃ组无明显差异性变化,三组相比,Ｂ和Ｃ组均高于或明显高于Ａ组,以后Ａ和Ｂ组逐渐回升。     

武夷山市武夫镇鸡球虫病流行病学调查

对武夷山市武夫镇2014年采集的95份鸡粪便涂片镜检,结合临诊症状、病理剖检情况、问卷调查综合判断,表明该病在武夫镇不同时间、不同鸡场、不同日龄鸡群中均有不同程度的感染。     

矮脚黄鸡、兴义矮脚鸡血清蛋白多态性的比较研究

利用聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳对贵州矮脚黄鸡、兴义矮脚鸡的血清前白蛋白(Pa)、白蛋白(Alb)、后白蛋白(Po)、运铁蛋白(Tf-1,Tf-2)5个位点多态性进行检测.结果表明:除Pa位点在矮脚黄鸡表现为单态,在兴义矮脚鸡表现为多态外,其它4个血清蛋白位点在两鸡种均具多态性,诸位点分别受2～3个(复)等位基因控制.Hardy-Weinberg平衡状态检测结果表明,两群体的Tf-1、Tf-2位点基因型频率都偏离了Hardy-Weinberg平衡状态.兴义矮脚鸡的有效等位基因数和期望杂合度(1.8792,0.4539)较大,矮脚黄鸡(1.7538,0.3772)较小,表明兴义矮脚鸡较矮脚黄鸡的遗传变异度大.     

先期接种传染性法氏囊病弱毒疫苗诱导的免疫对雏鸡实验性大肠杆菌病的影响

雏鸡接种传染性法氏囊病（ＩＢＤ）弱毒疫苗后第３天,气管内接种致病性大肠杆菌菌悬液根据发病率、血液白细胞计数（ＷＢＣ）值、嗜异性白细胞百分率、α萘酯酶阳性Ｔ细胞（ＴＡＮＡＥ＋）百分率、淋巴细胞转化率（％）、血清抗体效价检测结果表明,接种ＩＢＤ弱毒疫苗对３天后实验感染大肠杆菌无实质性影响,实验感染大肠杆菌对先期接种ＩＢＤ弱毒疫苗激发产生抗体应答,无实质性影响。     

矮脚黄鸡、兴义矮脚鸡血清蛋白多态性的比较研究

利用聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳对贵州矮脚黄鸡、兴义矮脚鸡的血清前白蛋白(Pa)、白蛋白(Alb)、后白蛋白(Po)、运铁蛋白(Tf—1,Tf—2)5个位点多态性进行检测。结果表明:除Pa位点在矮脚黄鸡表现为单态,在兴义矮脚鸡表现为多态外,其它4个血清蛋白位点在两鸡种均具多态性,诸位点分别受2～3个(复)等位基因控制。Hardy-Weinberg平衡状态检测结果表明,两群体的Tf—1、Tf—2位点基因型频率都偏离了Hardy-Weinberg平衡状态。兴义矮脚鸡的有效等位基因数和期望杂合度(1.8792,0.4539)较大,矮脚黄鸡(1.7538,0.3772)较小,表明兴义矮脚鸡较矮脚黄鸡的遗传变异度大。