家蚕Polh+ Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的构建

为利用杆状病毒的强启动子——多角体启动子而构建的重组杆状病毒一般是多角体缺失型(polh-)病毒。为了解决家蚕生物反应器规模化生产中病毒必需经皮接种而效率低下的问题,在建立家蚕Bac-to-Bac快速表达系统的基础上,构建了能形成多角体的家蚕Polh+ Bac-to-Bac表达系统。通过该系统能够产生表达外源目的基因的重组病毒,获得的该重组病毒能在培养细胞内表达,也能通过经口添食感染表达。利用EGFP报告基因分析了该系统的表达效果,构建的重组病毒不仅有效表达了EGFP蛋白,还在细胞核中形成了大量多角体。该系统较好解决了重组病毒必需经皮接种感染的缺陷,提高了生产效率,拓宽了杆状病毒在生物杀虫剂、基因治疗等领域的应用前景。     

家蚕添食抗生素和营养素的对比试验

对五龄家蚕添食抗生素-氯霉素、营养素-葡萄糖和尿素,以及添食两种营养素与抗生素不同组配的混合液,通过对比试验,得出对家蚕添食不同组配营养素和抗生素,有不同的增产效果。     

以蚕蛹生产生物活性物质的操作方法

近年来,随着基因工程和重组技术的发展,家蚕作为生物反应器(家蚕杆状病毒表达载体系统)生产重组生物活性物质的优良特性被生物学家所认识,许多重组生物活性物质通过家蚕这一优良生物反应器得到表达和生产。如中国农业科学院蚕业研究所农业部家蚕生物技术重点实验室用家蚕高效表达了植酸酶基因.用于饲料添加剂,可大幅度减少饲料中无机磷的添加量.提高了料肉比,并减少了磷对环境的排放。又如浙江大学生物化学研究所用家蚕高效表达hGM-CFS制备口服药具有显著的升白细胞功能。     

家蚕杆状病毒(BmNPV)生物反应器规模化生产技术

将现有成熟的栽桑养蚕技术与尖端的生物工程技术嫁接、融合一体的"家蚕生物反应器"是新兴的高科技生物产业,为古老的养蚕业注入了新的活力.饲育生物反应器蚕的附加值远远高于丝茧育.经过2002年较大规模的生产实践,提出有关饲育家蚕杆状病毒生物反应器生产技术的初步意见.     

利用家蚕杆状病毒Bac-to-Bac系统表达大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ

L-天冬酰胺酶（L-asparaginase,L-ASP）可以通过降解L-天冬酰胺从而抑制肿瘤细胞中蛋白质的正常合成,导致肿瘤细胞的死亡。通过杆状病毒的Bac-to-Bac方法,将大肠杆菌的asp基因在家蚕杆状病毒中表达,其活性较原核表达有明显提高,达到2800μ/mg。为利用家蚕生物反应器生产该蛋白提供了依据。     

科技

<正>家蚕生物反应器家族再添新成员近日,农业农村部向中国农业科学院生物技术研究所颁发了重组杆状病毒rBmNPV表达的鸡γ-干扰素和猫ω-干扰素两项生产应用安全证书,标志着利用家蚕生物反应器生产动物用基因工程制品范围得到进一步拓宽。生物所微生物蛋白质工程创新团队通过多年研究,成功实现了鸡γ-干扰素在家蚕生物反应器中的重组表达。该产品具有生物活性好、生产成本低(每粒蚕蛹可产千万IU的干扰素、每只鸡全龄应用的直接成本约1分钱)、可     

家蚕BmNPV多角体蛋白与大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ的融合表达

L-天冬酰胺酶是一种重要的蛋白类抗肿瘤药物,可通过降解L-天冬酰胺从而抑制肿瘤细胞中蛋白质的正常合成,导致肿瘤细胞的死亡.通过基因融合的方法,将大肠杆菌的asp基因在家蚕杆状病毒中表达,其活性进一步提高到5 940U/mg,为利用家蚕生物反应器生产该蛋白打下了基础.     

提高昆虫杆状病毒表达系统重组蛋白表达水平的技术

昆虫杆状病毒表达系统已广泛用于各种重组蛋白的生产。然而,由于各种因素重组蛋白的表达量远远达不到理想的水平。提高重组蛋白的表达水平成为提高昆虫杆状病毒表达系统效率的核心问题。根据目前的研究,提高外源基因表达水平的技术主要包括抑制目的蛋白降解、合理调控目的基因的转录、优化启动子类型以及利用活体昆虫而非培养细胞,如用家蚕幼虫或蛹进行表达等。这些技术也为家蚕成为更加高效的生物反应器奠定了基础。     

猫ω型干扰素在家蚕杆状病毒表达系统的表达及活性检测

将优化合成的猫ω型干扰素基因Fe IFN-ω2和Fe IFN-ω9克隆到杆状病毒转移载体p VL1393的多角体蛋白基因启动子下游,与orf1629基因缺损的家蚕杆状病毒Bm-Bacmid DNA共转染Bm N细胞进行同源重组,将获得的重组病毒感染家蚕5龄幼虫,利用家蚕生物反应器表达猫ω型干扰素。采用微量细胞病变抑制法在CRFK细胞/VSV*GFP系统上检测家蚕幼虫血淋巴中表达的重组猫ω型干扰素具有抗病毒活性,其中表达产物重组Fe IFN-ω2的抗病毒活性可达6.3×105U/m L,而重组Fe IFN-ω9的抗病毒活性较低。研究结果为利用家蚕生物反应器生产重组猫ω型干扰素生物制剂奠定了一定的试验基础。     

丝素缺失突变型家蚕添食罗丹明B制备彩色荧光丝胶的研究

具有高生物相容性和生物活性的荧光材料在创伤修复、药物递送、传感器、生物测定与成像等许多领域因便于示踪或实时监测而备受青睐。对丝素缺失突变型家蚕添食荧光染料罗丹明B,系统地研究添食罗丹明B对家蚕生理指标和茧质的影响，同时研究罗丹明B在家蚕体内的转移，以及添食后丝腺中丝胶液和蚕茧中罗丹明B的含量，制备彩色荧光丝胶纤维支架并分析其细胞相容性。结果表明，添食罗丹明B后家蚕幼虫体色、蚕茧或纤维支架均呈粉红色，随着罗丹明B添加量的增加，罗丹明B在家蚕体内存留量也随之提高，6 mg/mL罗丹明B处理组家蚕丝腺中丝胶液和蚕茧中的罗丹明B含量分别为0.011 mg/mL和0.166 mg/g;添食罗丹明B对家蚕的生命力和茧质均有显著影响，随着罗丹明B添加量的增加，家蚕的生命力和茧质均呈现下降趋势；添食获得的含有罗丹明B的蚕茧或纤维支架具有强荧光特性；添食罗丹明B可获得平整、均一的彩色荧光丝胶纤维支架，且该荧光支架无细胞毒性。综上，对丝素缺失突变型家蚕添食荧光色素是获得新型荧光丝胶材料的可行性途径。     

磁处理水添食对家蚕若干数量性状影响的初步试验

研究了用不同强度磁处理水添食对家蚕生长及若干数量性状影响的生物效应。结果表明 ,从 3龄起连续添食磁处理水后与对照区比较 ,蚕体增长率提高 ,健康性和生命力有所增强 ,龄期经过缩短 1～ 2d ,茧质调查表明 ,全茧量、茧层量、茧层率等性状也都不同程度表现了正向效应 ,其中以场强为 2 0 0～ 30 0mT的磁处理水添食 ,作用效果较为显著     

省力化养蚕技术对养蚕规模化的影响

本文以马村规模化养蚕发展为例,分析了省力化养蚕技术在提高生产效率、降低成本、改善饲育环境等方面对养蚕规模化的影响,指出了省力化养蚕技术推广存在的问题并提出建议,以期通过完善省力化养蚕技术体系促进养蚕的规模化发展。     

Sf9昆虫细胞悬浮培养工艺的研究

对Sf9昆虫细胞在不同培养基、培养基中是否添加血清及不同生物反应器中的培养工艺进行了研究,发现Sf9细胞在Sf900Ⅱ无血清培养基中生长比在添加10％小牛血清的Grace培养基中更好,在Sf900Ⅱ无血清培养基14 L搅拌式生物反应器分批培养细胞密度可达1.4×107/mL.过程生化特性分析表明,总氨基酸的消耗及主要代谢副产物特别是乳酸及游离氨的积累是培养后期细胞密度降低及活性下降的重要原因.本研究为Sf9细胞生物反应器培养工艺优化及利用昆虫杆状病毒蛋白表达系统高效表达重组蛋白生产亚单位疫苗奠定了良好基础.     

重组AcMNPV感染家蚕后造成宿主组织液化的机制分析

杆状病毒的组织蛋白酶(V-CATH)和几丁质酶(V-CHIA)是病毒感染宿主后造成宿主组织液化的关键酶。家蚕核型多角体病毒(BmNPV)感染家蚕后会导致宿主组织的液化,而苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)感染家蚕后不会造成宿主组织的液化。为了分析AcMNPV不造成家蚕宿主组织液化的原因,利用Bac-to-Bac系统将BmNPV的v-cath(Bmcath)、v-chiA(BmchiA)同时或分别重组到AcMNPV的极晚期强启动子p10和polh下游,并以同样的方法将AcMNPV的v-cath(Accath)、v-chiA(AcchiA)同时或分别重组到AcMNPV的p10和polh下游,从而构建6种重组AcMNPV。结果显示6种重组AcMNPV均能感染家蚕,并造成家蚕宿主组织的液化,说明重组AcMNPV中v-cath和v-chiA的过量表达在病毒对家蚕组织液化过程中发挥了重要作用。通过对感染6种重组AcMNPV之间的蚕体液化发生时间和液化率进行比较,发现相对于v-chiA,v-cath对组织液化的作用可能更加直接。检测比较感染AcMNPV和重组AcMNPV家蚕血淋巴中的组织蛋白酶和几丁质酶活性,两种酶的活性均随v-cath和v-chiA基因拷贝数的增加而增加。AcMNPV感染后不会造成家蚕宿主组织液化可能是由于病毒的组织蛋白酶活性太低,而不是由Bmcath和Accath、BmchiA和AcchiA之间的序列差异造成的。     

家蚕生物反应器表达hGM-CSF产业化若干问题的研究

报道了家蚕杆状病毒表达hGM CSF产业化过程中几个问题的研究结果。鲜茧在 4～ 7℃保存可显著抑制蚕蛹的发育 ,但随冷藏时间的延长 ,死笼率明显上升 ,接种成功率显著下降 ;接种蚕蛹血淋巴中hGM CSF的活性与鲜茧保存时间有明显的负相关关系 ;生产工艺不同 ,蚕蛹冻干粉中hGM CSF的活性有明显差异 ;60 Co辐照可使冻干蚕蛹粉中微生物的数量减少 ,但同时蚕蛹中hGM CSF的活性也随辐照剂量的增加而有所降低 ,hGM CSF蚕蛹粉经 30 0 0Gyγ射线辐照后 ,口服仍使小鼠白细胞明显上升。     

小型循环式家蚕人工饲料给料机的研制

探讨了挤压式人工饲料给料法 ,并研制了一种小型循环式人工饲料给料机。试验结果表明 ,该机具有结构简便、效率高、可靠性好的特点 ,可取代家蚕人工饲料育给料工序的手工作业 ,给料工效达 10 0kg/h ,为手工操作的 10倍以上。给料工艺符合人工饲料育技术要求。     

两对新型单交蚕品种的繁育初报

蚕蛹雌雄鉴别技术人员缺乏、工作量大是目前蚕种生产面临的主要问题之一。利用性别控制技术,实现原种一方专养雌蚕,另一方专养雄蚕的新型单交蚕种生产模式,可免去杂交种生产中的雌雄鉴别环节,提高蚕种生产效率和杂交彻底率。经试繁,两对新型单交蚕品种"雌29×卵36"、"雌35×平28"繁育性能优良,其中"雌29×卵36"kg茧制种量较对照种"薪杭×白云"提高23.0%,"雌35×平28"kg茧产值较对照种"秋丰×白玉"提高15.68%。     

SARS-COV S蛋白在大肠杆菌和家蚕中的表达

将SARS-CoV S蛋白基因的部分序列(accession number为AY304495的22 908-23 542 nt区域),克隆到表达载体pET28 a(+)中,并在大肠杆菌BL21中诱导表达。SDS-PAGE、W estern b lotting分析表明,重组S蛋白的分子量约为27 kD,与理论分子量相符。将S蛋白基因的部分序列克隆入杆状病毒转移载体pBacPAK-H is后,与线性化家蚕杆状病毒BmBacPAK-6共转染BmN细胞,经空斑筛选获得重组杆状病毒BmBac-S,并将其在细胞和家蚕中进行表达。SDS-PAGE、W estern b lotting分析表明,表达产物的分子量约30 kD,用金属螯合亲和层析纯化得到家蚕细胞表达的重组S蛋白。     

半胱氨酸蛋白酶基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

为了探讨杆状病毒的致病机理、改善杆状病毒表达系统的表达效率 ,将来源于家蚕核型多角体病毒ZJ8株的半胱氨酸蛋白酶 (cystenineprotease,CP)基因克隆到转移载体pVL 1393上 ,获得重组转移载体pVL cp ,与线性化的Bm BacPAK6病毒DNA共转染家蚕Bm 5贴壁细胞。通过蓝白斑筛选、纯化后得到的重组病毒经PCR鉴定证明 ,cp基因已被正确导入 ,注射感染家蚕 5龄幼虫 12 0h后表达产物活性达到最高。对表达产物进行SDS PAGE及酶活力分析 ,检测到半胱氨酸蛋白酶在家蚕生物反应器中的表达 ,其表达量约为 16 0 0U/mL。