亚洲璃眼蜱差异表达新基因P18的克隆和鉴定

为了进行抗蜱和蜱传病疫苗的研究,本实验对亚洲璃眼蜱雌蜱吸血前后唾液腺消减文库中获取的一个全长编码基因P18进行了研究。该基因全长519bp,共编码170个氨基酸,分子量为18.36Ku,等电点为4.28。BLAST分析表明,该基因预测的氨基酸与肩突硬蜱、篦子硬蜱唾液腺的抗凝血小肽有30%～40%低度同源性。将该基因亚克隆到pET-32a( )表达载体,转化BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导,重组融合蛋白以可溶性形式高效表达。将可溶性重组蛋白免疫小鼠后获得的抗血清。经免疫印迹分析表明,该重组蛋白抗体可特异性的识别半饱雌蜱唾液腺中的天然蛋白抗原,而未吸血雌蜱唾液腺中则不显现特异条带。RT-PCR结果进一步证实,该基因在蜱吸血后的唾液腺中差异表达。     

亚洲璃眼蜱免疫抑制蛋白P36的分子鉴定及重组表达

为了解蜱吸血和病原传播的分子机制,本研究从亚洲璃眼蜱唾液腺中克隆获得一个编码免疫抑制蛋白P36的同源性基因,该基因全长924bp,编码区为708bp,预测的编码蛋白包含235个氨基酸,分子量为27ku。BLAST分析表明,该基因预测的氨基酸与美洲花蜱和安氏革蜱唾液腺中的免疫抑制蛋白P36高度同源。RT-PCR分析表明,该基因在未吸血成蜱中没有表达,但吸血后表达。将目的基因与载体pGEX-4T-1连接后转化BL21表达菌,经诱导后得到GST融合重组蛋白。该实验结果为进一步研究P36奠定了基础。     

亚洲璃眼蜱唾液腺多肽Ha-11的鉴定、表达和生物学功能的初步研究

本研究对亚洲璃眼蜱多肽Ha-11的编码基因进行了克隆、表达和初步的功能分析。该基因开放阅读框（open reading frame,ORF）为372 bp,编码123个氨基酸,其中含23个氨基酸的信号肽。将去除信号肽的编码区基因亚克隆至pGEX-4T-1载体,大肠杆菌中诱导表达,获得了37 kDa重组蛋白。抗重组Ha-11蛋白的免疫血清识别半饱血雌蜱的唾液腺中约11 kDa的天然蛋白。Real-time PCR结果表明该基因在亚洲璃眼蜱的各发育阶段、各组织中均有表达,但以若蜱表达量最高,而组织中以淋巴液表达量最高。重组蛋白在体外可以抑制脾细胞增殖和细胞因子IL-2、IFN-γ的分泌。研究结果显示Ha-11在蜱吸血过程中可能具有抗炎作用。     

亚洲璃眼蜱唾液腺差异表达基因文库的构建及分析

从单雌蜱克隆群中挑选未吸血雌蜱60只，随机分成两组。未吸血组直接剖取唾液腺．半饱血组于蜱吸血第5d采集，分离唾液腺。Trizol法提取总RNA，经第一链合成、LD—PCR、RasⅠ酶切、接头连接和抑制消减杂交（SSH）等步骤，获得差异表达基因的cDNA片段。将纯化的cDNA片段与pGEMT—Easv我体连接，转化DH5a，获得204个白色菌落。扩增检查表明，136个克隆含有插入片段，片段大小为250bp-850bm，测出有效序列120个。由10个cDNA片段的RT—PCR检查结果初步断定，本研究消减效果良好。由网上资源分析得：21个片段与其他蜱的基因，19个片段与按蚊、库蚊、钩虫、奥斯特线虫等其他吸血寄生虫的基因，9个与果蝇的基因具有同源性。     

亚洲璃眼蜱唾液腺-新基因（GP29）的原核表达及产物鉴定

将吸血诱导的亚洲璃眼蜱唾液腺差异表达基因GP29的开放性阅读框插入pGEX-4T-1，转化BL21，表达出一相对质量为53ku的蛋白，其大小与预计结果一致。蛋白质的肽质量图谱和“1381．7511”肽段序列两方面的结果证明，SDS-PAGE胶板上相对质量为53ku的蛋白就是由目的基因表达的GST融合蛋白。该蛋白与Swiss PROT库中的任何蛋白均有较大差别，可能是一个新功能分子。     

亚洲璃眼蜱唾液腺一新基因(GP29)的原核表达及产物鉴定

将吸血诱导的亚洲璃眼蜱唾液腺差异表达基因GP29的开放性阅读框插入pGEX-4T-1,转化BL21,表达出一相对质量为53 ku的蛋白,其大小与预计结果一致。蛋白质的肽质量图谱和“1381.7511”肽段序列两方面的结果证明,SDS-PAGE胶板上相对质量为53 ku的蛋白就是由目的基因表达的GST融合蛋白。该蛋白与SwissPROT库中的任何蛋白均有较大差别,可能是一个新功能分子。     

亚洲璃眼蜱P27基因的克隆和表达模式分析

为了进一步研究蜱吸血时唾液腺的基因表达调控机制,并为蜱疫苗的制备筛选功能性抗原,本试验对从亚洲璃眼蜱雌蜱吸血前后唾液腺消减文库中筛选出的一个具有Poly（A）尾的EST序列P27进行了研究。首先运用RACE技术扩增出该基因的5′端,在此基础上设计引物,扩增出该基因全长,此基因全长827bp,其开放阅读框从第35个碱基始至第706个碱基止,预测分子量为27．28ku,等电点4．22。生物信息学结构分析表明该基因含有跨膜区及多个活性位点,可能与细胞内DNA的转录相关;该基因与现有其他基因同源性很小,为一新基因;RT-PCR结果显示该基因在半饱血雌蜱的唾液腺、蜱壳、中肠均有表达,但在壳中表达丰度稍低。本研究克隆的P27基因序列已登录GenBank,序列号为EU180067。     

亚洲璃眼蜱免疫抑制蛋白p36基因的RNA干扰研究

本研究利用RNA干扰技术研究亚洲璃眼蜱p36基因在其生长、发育、繁殖方面的生物学功能。通过注射p36基因的dsRNA成功实现了该基因的表达沉默,干扰组表达量下降了99%。蜱p36基因沉默后,24 h的吸附率下降了50%,饱血率下降了55.5%,卵孵化率下降了100%。结果表明p36基因在亚洲璃眼蜱吸血和繁殖中具有重要作用。     

镰形扇头蜱、亚洲璃眼蜱和血红扇头蜱Actin基因的克隆和序列分析

蜱,隶属节肢动物门蛛形纲蜱螨目,寄生于动物体表,以吸食动物血液为生.蜱广泛分布于世界各地,侵袭哺乳动物、爬行动物、鸟类,乃至两栖类等多种动物.蜱和其所携带的病原微生物,如螺旋体、巴贝西虫、贝纳柯克斯体等[1],对动物和人类的健康造成严重危害.肌动蛋白(Actin)是一类进化保守,在多数物种中存在的蛋白质超家族,其基因序列高度同源[2].Actin是细胞组成的基本单位,参与多种生理过程,如细胞运动、胞内运输、细胞质流动、内吞作用等[3].Actin基因及蛋白同时也是多数实验中的首选内参,对完善实验数据、数据分析和实验过程的逻辑性起到重要作用.目前少见对镰形扇头蜱成蜱、亚洲璃眼蜱和血红扇头蜱Actin基因的报道.据此,我们克隆了三种硬蜱的Actin基因,进行了序列分析.     

小亚璃眼蜱和亚洲璃眼蜱对环形泰勒虫传播能力的研究

将实验室培养的小亚璃眼蜱（Hyalomma anatolicum anatolicum)和亚洲璃眼蜱（Hyalomma asiaticum asiaticum)清洁幼虫和若虫饲喂于感染环形泰勒虫的牛体，收集饱血幼虫和若虫，用所孵化的若虫和成虫感染试验牛。结果显示，小亚璃眼蜱幼虫、若虫阶级感染，所发育之若虫、成虫均可传播环形泰勒虫；而亚洲璃眼蜱各阶级的传播试验结果均为阴性。