蚊耐氯菊酯C6/36细胞构建及耐药相关基因PR-XP1的表达分析

建立蚊耐氯菊酯C6/36细胞,并探讨PR-XP1基因与蚊C6/36细胞对氯菊酯的耐药性之间关系.采用逐步诱导法筛选蚊耐氯菊酯C6/36细胞,观察耐药细胞形态变化、生长状态,测定生长曲线和半数致死剂量;利用荧光实时定量PCR鉴定PR-XP1基因在敏感细胞与耐药细胞中的表达差异.获得耐400μg/mL氯菊酯的C6/36细胞;实时定量PCR检测发现抗药基因PR-XP1在蚊耐氯菊酯C6/36细胞中表达量明显上升.表明构建蚊耐氯菊酯C6/36细胞是研究蚊虫氯菊酯耐药性的有效方法,初步证明PR-XP1基因表达升高可能与蚊虫对氯菊酯的耐药性具有一定的相关性.     

干旱和盐胁迫中大麦实时定量PCR内参基因的筛选

为筛选大麦中干旱和盐胁迫条件下适宜的实时定量PCR内参基因,我们对栽培大麦23-19和野生大麦4-3进行了3种不同的胁迫处理:不浇水自然干旱、30%PEG干旱胁迫、0.4 mol/L Na Cl盐胁迫,用内参分析软件Ge Norm和Norm Finder分析比较了6种常用内参基因ubiquitin、a-tubulin 2、Actin、ARF1、EF1a、SAM在不同组织部位的表达稳定性,并以筛选到的稳定内参分析了胁迫诱导表达基因DHN1的表达情况。结果显示:筛选内参基因时,将所有实验数据综合在一起分析,未能找到稳定表达的内参基因及其组合;按根、茎、叶进行内参基因的筛选发现不同的组织部位、在不同的胁迫处理下,稳定表达的内参基因不完全相同;叶片中内参基因的表达稳定性最为一致,ubiquitin、Actin和ARF1在3种不同的胁迫处理下均有较为稳定的表达。以筛选到的内参基因ubiquitin、Actin和ARF1分析DHN1的表达情况,结果与植物的生长表现吻合。研究结果表明同时考虑太多的变量组合(如不同胁迫,不同组织)不易筛选到稳定表达的内参基因,建议在进行实时定量PCR研究之前根据具体的实验条件先对内参基因进行筛选。叶片适宜作为组织材料、ubiquitin、Actin和ARF1适宜作为内参基因组合对干旱和盐胁迫下野生大麦和栽培大麦进行实时定量PCR研究。     

实时荧光定量RT-PCR法对志贺菌外排泵基因emrE的表达分析

测定临床耐多药志贺菌株H24的外排泵emrE基因的表达情况,尝试建立一个快速检测外排泵基因表达的方法。提取多耐药志贺菌株H24的RNA,用实时荧光定量RT-PCR方法验证H24的外排泵emrE基因mRNA表达水平和耐药的相关性。实时荧光定量RT-PCR获得H24的外排泵基因emrE的mRNA相对表达量,emrE基因的相对表达量为内参基因gapA的2万多倍;同一标本重复扩增,emrE和gapA基因相对拷贝数的平均变异系数分别为1.4%和1.3%,提示本方法可准确检测二者的相对拷贝数。由emrE基因的高表达可以推断它与志贺菌的多耐药有正相关性,这个推断结果与以前通过克隆emrE基因的方法得到的结果一致。所建立的emrE基因荧光定量RT-PCR诊断方法特异性好、敏感性高,SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR可进一步应用于志贺菌多耐药株其他外排泵的临床诊断和科学研究。     

转大豆Na~+/H~+逆向转运蛋白GmNHX1基因植株的获得

制约大豆生产的因素很多,土壤盐渍化就是其中之一。大量研究证明过表达NHX逆向转运蛋白可以提高植物的耐盐性。为获得耐盐性良好的转基因大豆材料,我们将大豆Na~+/H~+逆向转运蛋白(GmNHX1)基因构建到植物表达载体pCAMBIA3300上,应用农杆菌介导法将GmNHX1导入大豆品种黑农56和黑农59中,共获得18个转基因株系,并对T_1代转基因株系进行了PCR和实时荧光定量PCR检测。PCR结果表明转基因后代株系呈阳性的植株有4株;经Real-time PCR检测该4个PCR阳性转基因株系的G NHX1基因表达水平均高于对照株系;200 mmol/L NaCl溶液的盐试结果表明;对照植株的生长速度滞缓于4个转基因株系的生长速度。     

玉米2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2C)活性与耐旱性的关系

在先期研究的基础上, 结合运用电子克隆和反转录PCR技术克隆玉米PP2C基因的全长cDNA序列, 再分别应用实时荧光定量PCR和非放射性标记法, 测定干旱胁迫条件下耐旱性不同的自交系PP2C基因的mRNA表达差异和酶活性差异, 以探讨PP2C酶活性与玉米耐旱性的关系。结果表明, 我们克隆的全长cDNA序列为玉米PP2C基因家族的新成员, 开放阅读框长1 164 bp, 编码388个氨基酸残基。将这一基因命名为ZmPP2Ca, GenBank注册号为EF195257。在干旱胁迫条件下, 该基因在耐旱自交系中下调表达, 使PP2C酶活性降低; 在不耐旱自交系中上调表达, 使PP2C酶活性升高。ZmPP2Ca基因的差异表达以及由此引起的PP2C酶活性差异, 可能与干旱胁迫条件下玉米细胞的信号传导有关。     

水稻MOC1 mRNA TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

TA克隆构建含MOC1基因cDNA片段的重组质粒,作为TaqMan定量检测水稻分蘖基因MOC1 mRNA的标准品,建立了检测方法。采用RT—PCR。的方法,从水稻分蘖芽总RNA中逆转录扩增总cDNA,PCR扩增MOC1基因中设计的目的片段,将纯化的目的片段与pMD19-T Simple载体连接,转化宿主菌JM-109,提取重组质粒DNA,PCR鉴定并测序分析。纯化质粒并检测260nm吸光值,确定重组质粒原液的拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品。对重组质粒进行实时荧光定量PCR实验。建立了MOC1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,特异性好,检测灵敏度达10^2拷贝,线性范围为10^2-10^7拷贝,阈值循环数与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系（r=0．999）,扩增效率高（E=92．8％）。成功建立了MOCI基因实时荧光PCR定量标准品,且TaqMan荧光定量RT—PCR的方法可对水稻分蘖基因MOC1 mRNA的表达进行准确定量。     

大豆候选草酸氧化酶基因片段克隆与表达分析

为克隆大豆草酸氧化酶基因并初步鉴定其功能,根据双子叶植物的草酸氧化酶基因,设计简并引物,同源克隆大豆该基因片段,实时定量PCR分析基因表达情况。序列分析发现,基因片段大小504 bp,无内含子,编码168个氨基酸;Blastx同源比对发现,与大豆的germin基因和苜蓿、花生的草酸氧化酶基因高度同源;草酸诱导大豆耐病和感病种质叶片基因表达分析表明,基因的表达与草酸诱导有关,而且在耐菌核病种质与感菌核病种质间,表达量和表达时间差异明显。推断该基因片段可能是一具有草酸氧化酶活性的大豆germin基因片段。     

尼罗罗非鱼干扰素调节因子1的表达与细胞定位

为了分析尼罗罗非鱼干扰素调节因子1(IRF1)的表达规律及其功能,克隆了尼罗罗非鱼IRF1基因c DNA全长,与其他脊椎动物IRF1基因进行比对,构建IRF家族系统进化树。然后使用Poly I∶C对尼罗罗非鱼进行体内注射诱导抗病毒免疫反应,利用荧光定量PCR技术检测处理组和对照组中尼罗罗非鱼各组织IRF1基因的表达差异。最后构建尼罗罗非鱼IRF1基因真核表达载体,对其进行细胞定位。结果表明,尼罗罗非鱼IRF1有888 bp的开放读码框,编码295个氨基酸的蛋白序列。该蛋白N端高度保守,并含有6个保守的色氨酸,具有DNA结合结构域。对蛋白相似率的计算发现尼罗罗非鱼与斑马鱼IRF1相似度为52.1%。而与大鼠IRF1的相似率最低,为36.2%。IRF家族成员蛋白序列构建的系统进化树显示,IRF家族共分为4个亚群。将p CMV3-FLAG-IRF1真核表达载体转染到Hela细胞中后,对IRF1进行细胞定位发现,尼罗罗非鱼IRF1主要分布在胞质中,胞核中有少量分布。对尼罗罗非鱼使用Poly I∶C进行体内注射诱导抗病毒应答反应,利用实时荧光定量PCR检测到各个组织中IRF1在不同时间下的表达水平有显著差异。本研究完成了尼罗罗非鱼IRF1的表达和细胞定位,对各种脊椎动物IRF家族成员进行了系统进化分析,结果有助于深入了解干扰素系统在机体免疫系统中的调控机制。     

碱蓬PEAMT基因的克隆及表达分析

研究旨在克隆碱蓬的耐逆相关基因——磷酸乙醇胺甲基转移酶(phosphoethanolamine N-methyltransferase,PEAMT)的编码基因,分析PEAMT基因调控机制,为进一步研究PEAMT基因的功能和碱蓬的耐盐机制奠定分子基础。依据GenBank数据库发表的其他物种的PEAMT序列设计简并引物,通过降落PCR法获得碱蓬PEAMT基因全长cDNA,命名为SgPEAMT,生物信息学软件分析其序列特点,荧光定量PCR检测其表达特性。序列分析表明SgPEAMT基因开放阅读框为1485bp,编码494个氨基酸,推测其为亲水性蛋白。保守结构域分析表明,SgPEAMT含有2个独立的S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶的保守结构域,每个结构域含有4个基序。系统进化树分析确认SgPEAMT与同属的碱蓬属植物亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析显示,盐胁迫或ABA胁迫下碱蓬根、茎、叶中SgPEAMT基因的表达上调,特别是叶中表达量最高。研究结果表明,SgPEAMT基因受NaCl和ABA诱导表达,预示SgPEAMT基因可能在碱蓬对盐胁迫的反应中起重要作用,是一种参与碱蓬耐盐反应的有效耐逆基因,为植物基因工程提供有效的耐逆基因。     

EuDQD/SDH6基因在巨尾桉莽草酸途径中的功能分析

莽草酸脱氢酶家族是多酚类物质合成的关键分支酶,本研究体外分离获得巨尾桉EuDQD/SDH6基因(KY401152.1),在大肠杆菌中表达并纯化了DQD/SDH6蛋白,以莽草酸为底物的DQD/SDH6酶动力学参数为K_m=29.93 mmol/L,V_max=(149.96±0.003) mmol·L^-1·s^-1,表明该蛋白具有SDH活性。实时定量PCR技术研究Eu DQD/SDH6在巨尾桉中的表达特性,发现Eu DQD/SDH6主要在叶片中表达,其次是茎部,根部最少,随着叶片的成熟Eu DQD/SDH6的表达量也逐渐减少。综合分析了实时定量PCR、SDH酶活性和HPLC法测定的酚酸含量的数据,研究巨尾桉DQD/SDH6的酶功能。Eu DQD/SDH6的基因表达量与SA、PCA累积量均呈负线性相关,与GA累积量正线性相关,但关联性较弱,推测桉树DQD/SDH6在巨尾桉中的生物功能可能是以3脱氢莽草酸为底物合成没食子酸,为单宁合成提供前体。Eu DQD/SDH6基因的表达量与硫酸木质素的含量呈正相关,推测E...     

3个抗虫耐盐基因载体对烟草的遗传转化及表达分析

病虫害和土壤盐渍化是影响烟草生长发育的重要因素,转基因技术已成为改善这一现状的有效手段。本研究将部分改造的Bt基因Cry1Ac基因、Cry3A基因及NTHK1基因构建在同一载体上,利用农杆菌介导法转化野生烟草植株。经PCR检测,获得10个转基因株系。经荧光定量PCR检测,Cry1Ac基因表达量在104~10~5数量级,1号转录丰度1.58×10~5为最高,而Cry3A基因表达量在10~5~10~6数量级,10号转录丰度1.34×10~6为最高;10个转基因株系双Bt基因均得到表达且存在表达差异,而对照烟草没有Bt基因表达。经ELISA检测,转基因烟草Cry1Ac蛋白平均表达量为150.441 ng/g,变化在0.86~201.74 ng/g;Cry3A蛋白平均表达量为1 192.592 ng/g,变化在23.33~2413.47 ng/g。经过对烟草斜纹夜蛾的虫试,初步证明转基因植株获得了抗虫性。组培苗耐盐试验表明,不同盐浓度条件下,转基因株系的分化状况优于对照。证明抗虫耐盐多基因的一次性转化,可提高烟草的抗虫能力和耐盐性。     

油菜柠檬酸合酶基因的克隆及在逆境下的表达

柠檬酸合酶是植物多种代谢途径的限速酶, 及代谢变化的标志酶。为了解油菜柠檬酸合酶基因的生理功能, 以甘蓝型油菜叶片cDNA为模板, 设计特异性引物, 获得一编码柠檬酸合酶基因的cDNA序列, 全长1 659 bp, ORF区含476个氨基酸残基, 序列比对显示其蛋白序列与拟南芥有较高的同源性(96.0%), 氨基末端含一线粒体靶信号。聚类分析表明, 油菜柠檬酸合酶基因与其他植物内该基因高度同源。对油菜幼苗进行植物生长调节物质、高温和低温、强光照和弱光照、盐、菌核病、干旱和水渍等处理, 采用半定量PCR法对油菜叶片柠檬酸合酶基因的表达模式进行检测, 发现在盐胁迫、暗光和强光的处理下, 柠檬酸合酶基因的表达基本没有变化;在水渍、干旱、IAA和6-BA胁迫下, 其表达有所升高, 但出现峰值的时间不同, ABA对表达模式的影响与IAA相反;感染菌核病后其表达降低;对GA₃的应答呈鞍型。对部分处理采用荧光定量PCR验证, 其结果与半定量PCR结果基本一致。     

芍药C4H基因的克隆及其在钙处理下的表达特性分析

以芍药花茎RNA为模板,采用PCR技术对芍药肉桂酸-4-羟化酶基因(C4H)进行克隆与序列分析,并采用实时荧光定量PCR技术对C4H在钙处理下花茎中的表达特性进行分析。结果表明:芍药C4H基因长1 715 bp,具有完整的开放阅读框1 548 bp,共编码515个氨基酸,等电点为9.33,不具有信号肽、存在1个明显的跨膜结构域,属于不稳定蛋白和亲水性蛋白。花茎中C4H基因的表达水平随着芍药植株的发育而呈逐渐上升趋势,并且钙处理增强了C4H基因的表达。本研究有助于通过分子手段培育花茎挺直的芍药品种以及在生产上推广钙处理来提高芍药花茎挺直程度。     

基于转录组数据对陆地棉GhHMP1的克隆及表达分析

本研究就转录组数据分析得到一个与镉胁迫相关的基因GhHMP1(Heavy metal transport/detoxification superfamily protein1),并从陆地棉耐镉品种‘邯242’中克隆成功。为研究该基因的功能和特点,对其进行生物信息学分析、转录组分析和实时荧光定量表达分析。结果表明:陆地棉‘邯242’基因GhHMP1的CDS全长为402 bp,编码133个氨基酸,分子量约为14.88 kD,等电点为8.20;转录组和实时荧光定量分析表明,GhHMP1基因的表达具有组织特异性,且受镉胁迫诱导,可以作为重要的候选基因来培育棉花耐镉新材料,从而为棉花耐镉育种及修复重金属污染土壤提供重要的理论依据。     

鹰嘴豆锌指蛋白基因ZF1的克隆及表达分析

利用一段从PEG胁迫的鹰嘴豆幼苗叶片所构建的cDNA文库中得到的EST序列,通过3¢RACE方法克隆到一个鹰嘴豆C₂H₂型锌指蛋白基因ZF1,该基因不含内含子,编码一条244个氨基酸残基的多肽,含有两个典型的Cys2/His2锌指结构。其氨基酸序列含有一个可能的核定位型号,农杆菌介导的洋葱表皮细胞GFP瞬时表达实验表明,ZF1蛋白位于细胞核内。半定量RT-PCR分析表明,ZF1在鹰嘴豆的根、茎、叶、花、幼荚和幼胚中均有表达,在茎和叶中表达较弱,为组成型转录因子。半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR检测结果显示,ZF1不但受高温及干旱诱导,而且还受6-苄基腺嘌呤(6-BA)、脱落酸(ABA)、乙烯利(Et)、赤霉素(GA₃)、吲哚-3-乙酸(IAA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)和氧胁迫诱导。这些结果表明,ZF1基因可能作为一个核调控因子参与植物的生长代谢以及多种生物与非生物胁迫的应答。     

高羊茅光周期调控基因FaCONSTANS亚细胞定位与差异表达分析

构建高羊茅光周期调控基因FaCONSTANS与绿色荧光蛋白基因GFP融合的植物表达载体P-FaCONSTA NS-hGFP,基因枪转化法转入洋葱表皮细胞,荧光显微镜检测融合基因的瞬时表达.并运用实时荧光定量PCR研究光周期调控基因FaCONSTANS在长日照与短日照条件下昼夜24 h的表达差异.结果表明:FaCONST...     

陆地棉低温响应基因GhJAZ1的克隆及表达分析

为了深入研究棉花JAZ基因在低温响应中的作用机理,利用RT-PCR方法从陆地棉中棉所36中克隆出一个低温应答基因GhJAZ1(GenBank登录号KJ562212)。全长CDS序列为810 bp,编码270个氨基酸,预测编码蛋白质的分子量为29.808 ku,理论等电点为8.33,为非跨膜蛋白。该基因编码蛋白具有一个N端NT结构域、一个TIFY结构域和一个C端Jas结构域。系统进化树分析发现,该蛋白与可可树和黄麻的亲缘关系最近。荧光实时定量PCR分析发现,GhJAZ1基因在下胚轴和根中显著高表达。此外,该基因还受到脱落酸(ABA)和茉莉酸甲酯(MeJA)的诱导表达,表达量变化趋势均为先升高后降低,但在MeJA诱导下该基因的表达量变化更明显。在低温胁迫下,不同低温耐性棉花材料中该基因的表达量变化程度也不同,耐低温品种中棉所36中GhJAZ1基因的上调表达更为显著,推测该基因参与了棉花低温胁迫防御反应。亚细胞定位显示,GhJAZ1蛋白定位于细胞核中。该研究可为进一步开展GhJAZ1基因低温响应的分子机制研究奠定基础。     

番茄在非生物胁迫下实时定量RT-PCR中内参基因的筛选

近年来实时荧光定量PCR已经成为研究基因表达的标准方法,稳定的内参基因可使反应标准化进行,并提高该方法的敏感度和重复性。许多研究表明不同组织、细胞和不同条件下内参基因的表达存在很大差异,因此在研究基因表达分析时,需要以内参基因对目标基因的表达量进行校准,由此来获得更为准确的结果。本研究以番茄经过果糖、蔗糖、葡萄糖、高温和低温处理的材料为研究对象,利用实时荧光定量PCR方法,对Actin、CAC、TIP41、Expressed、SAND 5个内参基因m RNA水平的表达量进行分析。经ge Norm和Norm Finder软件分析5个内参基因的表达稳定性,以期为番茄果实基因表达调控相关的研究提供内参基因。研究结果为番茄植株在非生物胁迫下的实时定量RT-PCR分析中内参基因的选择提供了理论与实验依据。     

玉米ZmPP2C6-01基因的克隆及表达分析

为了研究玉米蛋白磷酸酶2C (PP2C)基因对非生物胁迫的响应及生理功能,以耐旱玉米自交系豫882为试验材料,对玉米20%PEG6000胁迫处理转录组进行分析,筛选受干旱诱导强烈表达的PP2C基因,然后对其进行克隆、生物信息学分析及表达模式分析。结果表明,在玉米20%PEG6000胁迫处理转录组中筛选到一个干旱胁迫下显著上调表达的PP2C蛋白基因,命名为ZmPP2C6-01。ZmPP2C6-01基因的开放阅读框为1 242 bp,编码413个氨基酸,编码蛋白质的分子质量为43.8 ku,等电点为6.6,是一种亲水性蛋白。ZmPP2C6-01蛋白与高粱的PP2C蛋白亲缘关系最近,而与冬小麦、粗山羊草等的PP2C蛋白亲缘关系相对较远。ZmPP2C6-01蛋白定位于细胞核中。利用实时荧光定量PCR分析发现,ZmPP2C6-01基因在玉米根中的表达量最高,其次是叶,茎中最低;PEG胁迫下,ZmPP2C6-01基因在根中的表达量大部分时间点均高于对照,同时在叶中呈上调表达模式;在ABA、NaCl、高温胁迫下,ZmPP2C6-01基因在根中大部分时间点的表达量均低于对照,整体呈下降趋势,而在叶中的表达量均高于对照,呈上调表达模式。综上表明,ZmPP2C6-01基因响应干旱等逆境胁迫,但表达模式不一致。     

山羊KLF6的分子克隆及其时空表达特征分析

旨在获得山羊Kruppel样因子6(Kruppel-like factor 6,KLF6)CDS序列,明确其组织及在皮下脂肪细胞分化过程中的表达模式。利用RT-PCR技术克隆山羊KLF6基因序列,利用生物学软件及在线网站对获得的KLF6基因进行序列分析。利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)技术检测KLF6在山羊各组织中的表达丰度及成脂诱导分化不同阶段皮下脂肪细胞中的表达水平。结果显示,获得山羊KLF6基因全长序列1 233 bp,其中包括CDS区957 bp,编码318个氨基酸残基,与牛和绵羊的亲缘关系最近。KLF6基因在山羊各个组织中都有广泛表达,且在脂肪组织中高表达,极显著高于其他组织(P0.01)。KLF6在诱导分化60 h的山羊皮下脂肪细胞中的表达量极显著高于在前体脂肪细胞中的表达水平(P0.01)。获得山羊KLF6基因序列并明确其分子特征,发现其在脂肪组织中存在高表达,且在分化后表达水平显著高于分化前的表达水平,为最终揭示KLF6调控山羊脂肪细胞分化提供重要数据。