泡桐丛枝植原体河北平山和江西吉安株系胸苷酸激酶基因多态性分析

设计引物并 PCR扩增河北平山株系 PaWBPs 和江西吉安株系 PaWBJan 的 tmk 基因,直接和克隆测定tmk序列,利用DNAMAN,MEGA等软件进行序列多样性、序列变异、蛋白功能域、系统进化等比较分析。结果表明：从 PaWBPs和 PaWBJan中克隆测序的93条和41条 tmk-a中,分别有52和24种不同的序列,tmk-a ORF 可被划分为2类,tmk-a-1为639 bp,tmk-a-2为627 bp,PaWBPs株系tmk-a-1与tmk-a-2序列条数的比值约为2.5,而PaWBJan株系为3.3; PaWBPs有5个相同的 tmk-a-1序列与 PaWBJan的一个 tmk-a-1序列及枣疯植原体 tmk-Y 序列完全一致。因多位点突变,PaWBPs含假基因比例达48.1%,PaWBJan的为41.7%; tmk-b基因为单一序列,两株系的 tmk-b核酸序列相似性为99.8%,编码蛋白仅有一个氨基酸差异。TMK-a和 TMK-b中都具有胸苷酸激酶的3个保守功能域。系统进化分析显示,泡桐丛枝植原体的2个株系的所有tmk-a序列都与枣疯植原体tmk-X和tmk-Y等聚为一个进化枝Ⅰ中;而tmk-b与小麦蓝矮tmk-2等聚为另一进化枝Ⅲ,基于tmk-b序列和基于16S rDNA序列构建的系统进化树一致,tmk-b有助于植原体16Sr组水平的分类,而 tmk-a可用于植原体株系变异和遗传多样性分析。     

4种植物病害植原体病原质粒全序列测定及分子特征

根据已发表植原体质粒序列设计引物,经2次PCR扩增,获得大小不同的2段DNA片段,测序后拼接得到4种完整的环状质粒,分别是桑树萎缩植原体濮阳株系质粒(pMDPy)、长春花绿变植原体海南株系质粒(pPeVHn)、泡桐丛枝植原体山东株系质粒(pPaWBG33D)及苦楝丛枝植原体福清株系质粒(pCWBFq-2),其中pMDPy为首次测定,其质粒全长分别为3 833,3 943,3 843和3 913 bp,4种质粒皆编码5种蛋白,ORF1和ORF5分别编码复制相关蛋白(RepA)和单链DNA结合蛋白(SSB),ORF2-4编码未知功能蛋白.4种质粒序列的非编码区分析表明,ORF1和ORF2之间的非编码区存在启动子和核糖体结合位点.将4种植原体质粒全序列与GenBank中登录的植原体质粒进行序列相似性比对和系统进化分析,结果表明这4种质粒与其他16Sr Ⅰ组的质粒聚为一个大的分支,与16S rDNA系统发育树基本一致.这可为进一步深入了解不同植原体质粒的结构与功能、寄主专化性和质粒基因变异及进化奠定基础,也可为基于多基因分类鉴定提供新的理论依据.     

泡桐丛枝植原体pPaWBNy-2-ORF4编码蛋白的抗体制备和表达分析

以感病泡桐组培苗提取的DNA为模板,采用PCR方法扩增pPaWBNy-2-ORF4的部分片段.将目的片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-3,重组质粒pGEX-p2ORF4转化大肠杆菌Rosseta(DE3)菌株.IPTG诱导表达,分子量约为38 kDa的含GST标签的融合蛋白得到表达.切胶回收目的蛋白,免疫大白兔制备抗血清.间接ELISA测定抗血清的效价约为1:4096,免疫印迹实验显示:抗血清能够与原核表达的GST融合蛋白发生特异的免疫反应,与pPaWBNy-1-ORF5的原核表达蛋白无明显的交叉反应.利用制备的抗血清,在感病泡桐饲毒的茶翅蝽中检测到分子量约为18 kDa的蛋白条带,而在无菌茶翅蝽和感病泡桐组培苗中均未检测到,表明pPaWBNy-2-ORF4在饲毒的茶翅蝽中表达,而在感病泡桐组培苗中未表达或表达量低于检测水平.据此推测,该基因参与茶翅蝽传播泡桐丛枝植原体.     

猪屎豆丛枝病植原体的分子检测与鉴定

植原体(phytoplasma),原称类菌原体(MLO),在植物和昆虫中广泛分布,为无细胞壁原核微生物,尚不能在人工培养基上离体培养.迄今,世界各地已统计有1000多种植物自然感染植原体病害(Seemüller et al.,1998),我国也报道了100多种植物植原体病害(赖帆等,2008).     

羽脉山黄麻丛枝植原体的分子鉴定及病害调查

【目的】了解羽脉山黄麻丛枝病在云南省玉溪市新平县的发生情况和危害程度,通过分子生物学方法确定病原物及其分类地位,为本地区植原体防控提供参考。【方法】利用普查法获得病害发病率,评估病害危害程度。利用植原体通用引物P1/P7及R16F2n/R16R2对感病植株总DNA进行巢式PCR扩增、克隆和测序,得到16S r DNA序列。再用植原体在线分类鉴定工具i PhyClassifier以及MegaX软件分别进行序列分析和构建基于16S r DNA序列的系统进化树,确定病害病原物及其分类地位,通过在线分析软件MUSCLE比较相关序列的同源性。【结果】根据调查发现羽脉山黄麻丛枝病发生于大约101°35'—101°53'E和23°56'—24°20'N之间,主要是在低海拔400～600 m温度相对较高的干热河谷地区,说明高温有利于植原体病害的发生。该处连续3年发生此病害,2018年7月调查得知其平均发病率为38.9%,属中度危害。PCR扩增获得约1 246 bp的羽脉山黄麻丛枝病植原体16S r DNA序列(株系:TLWBYN01,登录号:MN513329)。分析表明TLWBYN01与翠菊黄化植原体(Candidatus Phytoplasma asteris)的参考菌株(M30790)相似度为99.8%,因此该植原体为‘Candidatus Phytoplasma asteris’相关菌株,属于16S r I组成员。TLWBYN01的F2nR2片段虚拟RFLP模型与16S r I-X亚组的参考模型番木瓜束顶植原体(登录号:JF781308)最为相似,相似系数为0.98,17种限制性内切酶的酶切图谱显示与16S r I-X参考株只有MseI不同,因此该植原体属于16S r I-X亚组的变种。比较得出TLWBYN01与16S r I-X亚组成员番木瓜束顶植原体(JF781308)和印度葫芦植原体(LT594117、LT594118)同源性分别为99.2%和99.6%。【结论】玉溪市新平县发现的羽脉山黄麻丛枝病属局部常发病害,中度危害,但一旦感染,就会严重影响植物生长。羽脉山黄麻丛枝植原体属16 Sr I组成员,也是报道较少的植原体16S r I-X亚组的一个变种,且羽脉山黄麻为新发现的植原体新寄主。     

多位点序列分析揭示我国16SrI组植原体不同株系间遗传变异和系统发育关系（英文）

【目的】16SrI组植原体对我国作物和生态植物危害严重。目前植原体尚不能分离培养,对于我国植原体不同株系间遗传变异和种群结构尚不清晰,通过多位点序列分析(MLSA)揭示我国不同地区16SrI组不同植原体株系的遗传多样性及其地理分布特征,比较不同植原体株系间不同持家基因的变异程度,为我国不同植原体株系的检测、分类鉴定和系统发育研究提供一定的参考方法和依据。【方法】应用rp,tuf,secA,secY,ipt,dnaK,fusA,gyrB,pyrG和rpoB共10个持家基因序列,结合16S rDNA序列,以全基因序列已完成的洋葱黄化植原体(OY-M)、翠菊黄化丛枝植原体(AYWB)、澳大利亚葡萄黄化植原体(CPA)、草莓致死黄化植原体(SLY)和苹果簇生植原体(CPM)共5种植原体株系为参照,分析我国10个省(市)苦楝丛枝、莴苣黄化、桑萎缩、泡桐丛枝和长春花绿变植原体株系(共18株)的遗传变异规律和系统发育关系,通过多重序列比对分析不同基因片段的序列多态性和变异程度。【结果】我国18株苦楝丛枝、莴苣黄化、桑萎缩、泡桐丛枝和长春花绿变植原体株系的rp,tuf,secA,secY,ipt,dnaK,fusA,gyrB,pyrG和rpoB多位点序列共有15种序列类型,从而揭示16SrI组不同植原体株系间丰富的遗传多样性。基于rp等10个基因多位点序列分析可将16SrI-B、D亚组的不同植原体株系清晰地分开。10株苦楝丛枝植原体株系与2株桑萎缩植原体株系系统发育关系最近,多位点序列分析可将这2种基于16S rDNA序列难以区分的植原体株系清晰地区分。10株苦楝丛枝植原体株系分为4个进化枝,其多位点序列存在8种序列类型,这4个分枝与植原体株系的地理分布关系密切。与我国长春花绿变和泡桐丛枝植原体株系相比,福建三明2株莴苣黄化植原体株系与日本洋葱黄化植原体株系OY-M系统发育关系较近。在已检测分析的植原体不同基因序列片段中,dnaK基因序列片段的变异水平最高。【结论】多位点序列分析可做为一种对植原体鉴定、区分以及株系遗传多样性全面检测的有效、可靠方法。在以后的研究中该方法可广泛应用于深入探讨植原体不同组间或亚组间株系的遗传变异和系统发育关系。     

车桑子丛枝病的病原分子检测鉴定及风险分析

在攀枝花市米易县车桑子Dodonaea viscosa种植区调查丛枝病的发生情况。应用植原体16S rDNA基因的通用引物R16m F2/R16mRl和R16F2/R16R2对具有典型植原体侵染症状和无症车桑子进行检测,巢式PCR得到约1.2 kb的特异性片段,经过测序并在NCBI数据库进行比对,获得1条植原体特定的16S rDNA基因序列(DvWB-PZHMY1);将测得的序列与已报道的植原体序列进行同源性比对,并构建系统进化树,结果显示获得的植原体序列均聚类到16S rI-B亚组中。风险评估分析表明,车桑子丛枝病达到中度风险级别,应给予重视。     

绣线菊丛枝病病原的分子鉴定

用植原体16S rRNA基因的通用引物,对表现黄化、丛枝、顶枯等症状的绣线菊DNA进行PCR扩增,得到了约1.2kb的特异性片段.测序结果证明其病原为植原体.RFLP和序列分析表明:该分离物属于翠菊黄化组的16SrⅠ -B亚组.与GenBank中其他植原体分离物序列比较,发现该分离物与16SrⅠ -B亚组中的西方翠菊黄化植原体(SAY)同源性高达99.6%.     

我国林业有害生物种类动态分析Ⅲ.螨、线虫、细菌、植原体、病毒

第三次全国林业有害生物普查记载螨76种,植物线虫6种,细菌21种,植原体11种,植物病毒18种。全国螨类,植物线虫类,细菌类,植原体类,植物病毒类发生面积分别为22.26,7.21,14.53,3.65,1.96万hm2,分别占林业有害生物发生总面积的1.17%,0.38%,0.77%,0.19%,0.10%。基本摸清我国林业有害螨、植物线虫、细菌、植原体、植物病毒的主要种类、分布范围和危害类型。     

寡核苷酸管芯片技术检测和鉴别我国不同组植原体

[目的]不同组植原体检测和鉴别的特异性探针已有报道,为了筛选出适合于我国不同组植原体检测和鉴别的特异性探针,建立管芯片检测和鉴别植原体技术,并对我国发生的疑似植原体病害进行鉴别。[方法]通过PCR扩增结合管芯片杂交技术,对收集到的15种植原体侵染的植物样品及其健康对照进行检测和鉴别。[结果]建立了管芯片检测和鉴别植原体技术体系。15种病害样品中,13种获得显著的阳性杂交信号,并且所有的健康对照都呈现为阴性。13种植原体病害依16Sr DNA直接测序可分为16SrⅠ、Ⅱ、Ⅴ、XIX四组植原体。在所有探针中,植原体的通用探针(Pp-502)可以检测到所有确定的植原体样品。16SrⅠ组特异性探针(PpⅠ-465)可以确定16SrⅠ组的泡桐丛枝、苦楝丛枝、桑树萎缩和莴苣黄化4种植原体样品。16Sr II组特异性探针(PpⅡ-629)仅可以确定16Sr II组的花生丛枝、甘薯丛枝和臭矢菜丛枝3种植原体样品。但16Sr V组的枣疯病、樱桃致死黄化和重阳木丛枝及16Sr XIX组的板栗黄化皱缩植原体与其他组专化性探针皆有明显的交叉杂交信号。相比于PCR扩增的凝胶电泳检测,管芯片检测的灵敏度提高了1 000倍。对疑似植原体病害的诊断结果显示河南濮阳的红花槐丛枝的病原应为16Sr V组植原体,福建福州的长春花黄化丛枝应为16SrⅠ组植原体;而北京戒台寺牡丹黄化皱叶和内蒙古包头柳树丛枝未出现任何植原体专化的杂交信号。[结论]管芯片杂交技术作为一种检测和鉴别植原体的方法,可应用于我国植原体病害调查和诊断,并为植原体的鉴别和分类提供可靠的依据。     

毛竹木质素合成相关基因C4H的克隆及组织表达分析

采用RT-PCR和RACE技术,从毛竹中克隆了C4H基因cDNA全长序列。该基因包含1 506 bp开放读码框,编码502个氨基酸。与NCBI核酸和蛋白数据库中序列进行比对, 结果表明该基因与单子叶植物高粱、水稻和玉米中的C4H基因同源性较高,分别达到88%、88%和87%。经过荧光定量PCR分析,该基因在毛竹不同发育时期和不同组织中表达丰度不同,在冬笋中表达量最高,其次为春笋顶部、中部、叶、3年生茎、根、叶鞘、2年生茎、春笋、1年生茎,而在春笋基部中表达最低。在笋顶部、中部的高水平表达表明本文克隆的C4H基因与发育时期维管组织的细胞壁加厚相关,可以作为调控木质素合成的目标基因用于竹子基因工程改良。     

麻疯树磷酸烯酮式丙酮酸羧化酶em>pepc基因全长cDNA克隆及序列分析

应用RT-PCR和RACE法从麻疯树总RNA中分离出pepc基因全长cDNA,长度为3 142 bp,阅读框2 898 bp,编码965个氨基酸,在GenBank中登录,序列号为EU069413。它的氨基酸序列与蓖麻、陆地棉、橙、大豆、花生、烟草、油菜、拟南芥的氨基酸同源性分别为94.94%、92.46%、90.60%、90.50%、90.50%、88.33%、84.61%、82.44%。该基因编码了pepc基因家族中的pepc1,蛋白属于C₃型PEPC。推测了pepc编码蛋白分子量为110.6 kD,并对其稳定性、二级结构、疏水性等特性进行了分析,最后确定了该蛋白的功能位点和结构域。     

金花茶组物种遗传关系的ISSR分析

利用ISSR分子标记技术对广西南宁金花茶公园29份金花茶组物种进行遗传关系分析。筛选出的14条引物扩增得到133条清晰条带,其中126条为多态性条带,多态性位点百分比为94.74%。29份金花茶种质材料的Nei’s基因多样性指数为0.360 6,Shannon’s 信息指数为0.531 4,遗传相似系数介于0.481 0.835,金花茶组物种的遗传基础较宽。用NTSYS软件对样品进行UPGMA聚类分析,29份金花茶样品聚为3大类群,其中扶绥中东金花茶单独为一类,顶生金花茶和龙州金花茶聚为一类,其它金花茶聚为一类。分析结果表明：夏石金花茶和小花金花茶的遗传相似系数最高,支持将两者归并到柠檬黄金花茶;弄岗金花茶和毛籽金花茶亲缘关系很近,支持合并到同一个种;龙州金花茶和薄叶金花茶分别归为单独的种。     

30个桉树无性系人工林碳储量分析

通过对国营雷州林业局30个5年生桉树无性系人工林的调查、试验,旨在阐明不同桉树无性系人工林碳储量的变化规律及营建桉树碳汇林的合理措施.结果表明:30个桉树无性系人工林生态系统平均碳储量为148.743 t·hm-2,高于之前学者研究的桉树人工林碳储量,其中,乔木层和土壤层分别占34.39％、61.88％;乔木层平均碳储量达51.948 t·hm-2,不同无性系间差异极显著(p＜0.01),其中,23(101-1)、25(179-1)、4(BU1)、26(184-1)号无性系表现最优;土壤层的平均碳储量为92.033 t·hm-2,不同无性系土壤层碳储量差异不明显;灌木层、草本层、凋落物层碳储量分别是2.430、0.731、1.592 t·hm-2,占比例较小.营建桉树碳汇林关键在于无性系的正确选择.     

版纳龙竹CONSTANS同源基因的克隆与序列分析

以版纳龙竹基因组DNA为模板,采用前人基于水稻CO同源基因Hd1序列的保守区所设计的特异引物COS1和COA1,运用PCR方法扩增出一条1 520 bp的DNA片段,并克隆到pGEM-T载体。测序和序列分析结果显示:该片段含有1个590 bp的内含子,编码区930 bp共编码310个氨基酸;该基因被命名为DxCO1,其DNA序列在G enB ank中的注册号为GQ358925。在G enB ank中进行同源性检索的结果显示:其核苷酸序列与其它禾本科植物CO同源基因的氨基酸序列同源性高达81%~91%;推测的DxCO1蛋白质序列与其它种子植物CO同源基因蛋白质序列的系统发育分析结果显示:DxCO1与小麦Hd1-like等5个基因聚成了一个强烈支持的分支;另外,在该片段推测的蛋白质序列的氨基端含有一个类似锌指蛋白的B-box(Cx2Cx8Cx7Cx2Cx4Hx8H)结构域,羧基端含有一个CCT(CO,CO-like,TOC1)结构域。序列和结构的高度同源性表明:DxCO1是版纳龙竹的1个CO-like基因,可能对其开花调控有着重要作用。     

杜仲1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因cDNA全长克隆与序列分析

以杜仲叶片cDNA为模板,采用反转录RCR及RACE技术分离出DXR基因cDNA全长。序列分析结果表明该基因序列全长1 814 bp,共编码478个氨基酸,推导的蛋白质分子量为51.71 kD,理论等电点5.79,命名为EuDXR。推导的EuDXR蛋白质序列具有植物DXR酶的5个典型基序,并预测出26个潜在的功能位点。系统进化树分析表明EuDXR蛋白与玉米、水稻亲缘关系最近,其次为橡胶、拟南芥、烟草。     

云南野生黄牡丹PlbHLH3转录因子基因的克隆与表达

以云南野生黄牡丹为试材,基于已构建的花瓣转录组数据库,筛选到了24个与花色素苷合成相关的bHLH转录因子蛋白同源性高的Unigene序列,命名为PlbHLH1~24。通过开放阅读框(ORF)的氨基酸序列比较和系统进化树分析,发现PlbHLH3可能参与调控花色素苷合成,其ORF包含一个 2 040 bp的开放阅读框,编码一个679个氨基酸的蛋白;其氨基酸序列与葡萄VvMYC1和苹果MdbHLH3的亲缘关系最近,相似性达60%以上。相对荧光定量PCR分析表明,PlbHLH3在黄牡丹和紫牡丹的不同组织中均有表达,在两者的花药,心皮和花瓣中的表达显著高于在萼片和叶片中的表达;PlbHLH3在紫牡丹的硬蕾期高丰度表达,而在黄牡丹的硬蕾期表达量最低,在其他4个时期的表达量显著或极显著高于在硬蕾期的表达量。本研究推测PlbHLH3参与黄牡丹花色素苷合成的调控作用,为今后深入探讨黄牡丹花色形成机制奠定理论基础。     

双斑长跗萤叶甲对几种植物挥发物的触角电位和行为反应

采用触角电位(EAG)、"Y"型嗅觉仪和风洞的方法研究双斑长跗萤叶甲成虫对14种植物挥发物的电生理和行为反应,筛选出对双斑长跗萤叶甲有效的植物挥发物,为该害虫的种群监测和防控提供新技术。研究结果表明:稀释102、103倍的薄荷精油和1 mol.L-1的香叶醇能引发双斑长跗萤叶甲强烈的EAG反应(P<0.01),且嗅觉测试表明,薄荷精油(稀释102倍)对双斑长跗萤叶甲的最大驱避率为(74±5.47)%,香叶醇(1 mol.L-1)对双斑长跗萤叶甲的最大引诱率为(70±10.00)%。风洞行为趋性研究表明:稀释102倍的薄荷精油对双斑长跗萤叶甲的最大驱避率为(72±8.37)%,而1 mol.L-1的香叶醇对双斑长跗萤叶甲的最佳引诱率为(66±8.94)%。     

泡桐优良无性系“TF33”干材表型性状杂种优势研究

以“毛泡桐×白花泡桐”的优良无性系TF33和两个标准对照品种(白花泡桐C001与兰考泡桐C125)为试验材料,研究了泡桐优良无性系干材表型性状的杂种优势.结果表明:(1) TF33、C001、C125无性系间各性状存在广泛和显著的变异;(2)3个生长性状(接干高、接干材积和主干材积)与3个干形性状(通直度、接干形数和主干平均削度)为高度变异性状(CV≥30％),CV变幅为33.10％～53.19％;(3)接干因子是影响和决定性状杂种优势最终状况和总体表现的最重要因素;(4)通直度性状的遗传改良是毛泡桐×白花泡桐杂种无性系干形遗传改良的关键和瓶颈;(5)多数性状间存在极显著或显著的相关性,且不同的性状间相关性变化较大;(6) TF33较C001有显著的材积生长杂种优势,较C125没有显著杂种优势.     

荔波连蕊茶肌动蛋白基因全长cDNA的克隆及其表达分析

根据植物肌动蛋白(Actin)基因编码区的保守序列设计引物,以山茶属植物荔波连蕊茶幼嫩茎段为材料,提取总RNA,进行RT-PCR。采用RACE技术扩增获得1 631 bp的Actin基因全长cDNA序列,命名为ClActin1(GenBank登录号KF366912)。序列分析表明,ClActin1开放阅读框(ORF)为1 134 bp,编码377个氨基酸,5’非编码区90 bp,3’非编码区407 bp。预测的ClActin1蛋白分子量为41.69 kD,理论等电点为5.31,具有Actin超基因家族的保守结构域和肌动蛋白家族特有的特征信号序列。ClActin1与GenBank中收录的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性在82%以上,氨基酸序列的相似性在97%以上。与其它植物肌动蛋白比较并构建系统进化树,结果显示山茶肌动蛋白与茶树和杨树的肌动蛋白的亲缘关系最为密切。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在荔波边蕊茶不同组织器官及不同发育时期的表达量稳定,表明ClActin1基因可作为内参基因。