25株植物内生放线菌的系统发育分析

[目的]初步确定25株植物内生放线菌的种属关系。[方法]采用改进的FRED法从小麦、大葱、油菜等植物中分离出的25株内生放线菌中提取基因组DNA,对其16S rDNA序列进行PCR扩增和测序,并对其进行系统发育分析。[结果]系统发育分析结果表明25株植物内生放线菌可分为5个属,其中1株糖霉菌属,2株拟诺卡氏菌属,7株诺卡氏菌属,10株小单孢菌属和5株链霉菌属。[结论]25株供试菌株中,小单孢菌属所占比例最高。供试内生放线菌与相应菌属中已知菌株之间的进化距离集中在97.39%~99.92%范围内。     

西藏青稞根际土壤可培养放线菌的遗传多样性及其促生功能分析

【目的】认识藏区青稞根际土壤中可培养放线菌的遗传多样性及应用价值。【方法】采集藏区青稞根际土壤,对根际样品中的放线菌进行分离,测定分离菌株的溶磷能力、抗病促生(IAA产量)能力,并运用反转录重复因子扩增(BOXA1RPCR)技术、16S r RNA基因测序和系统发育分析系统分析可培养放线菌的系统发育地位。【结果】通过7种培养基共分离得129株放线菌菌株,其中有51株菌株(占总分离菌株的39.5%)产IAA,8株产量较高(>57 mg/L),77株(占总分离菌株的60.0%)表现出溶磷活性。基于BOXA1R-PCR图谱,采用平均连锁聚类法(UPGMA)进行聚类分析,129株菌被分成19种不同的遗传图谱类型。基于分离菌株的菌落特征和遗传聚类图谱选取32株代表菌株进行16S rRNA基因序列测定。通过Mothur软件对分离菌株进行OTUs(operational taxonomic units)聚类分析,共得到5个OTU分类单元,其中以OTU1为主。系统发育显示代表菌株分属于链霉菌属(Streptomyces),拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis),类诺卡氏菌属(Nocardioides),小单孢菌属(Micromonospora),放线菌属(Actinomyces)等5个属,其中链霉菌属(Streptomyces)为优势种属。【结论】西藏青稞根际土中放线菌多样性明显,这些放线菌中蕴藏着大量的有开发应用前景的菌株。     

西藏低温放线菌的多样性及其生物活性

【目的】研究西藏低温环境下放线菌的组成及其抑菌效果和酶活性,为放线菌新药物先导化合物和高活性酶的筛选提供资源。【方法】从西藏低温地区采集16份土样,用平板稀释法分离放线菌,经形态学和培养特征初步鉴定后得到有代表性的低温放线菌,对这些代表性菌株的16S rRNA基因序列进行系统发育分析,对其进行鉴定;采用菌丝生长速率法测定代表性低温放线菌菌株发酵液对11种农作物真菌的抑菌活性,并对其纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶等活性进行测定。【结果】从16份土样中共分离到22株有代表性的低温放线菌,其在10~25℃均能生长。16S rRNA基因序列分析表明,这22株菌分布于放线菌门放线菌纲2个亚目3个科的3个属,即链霉菌亚目(Streptomycineae)链霉菌科(Streptomycetaceae)链霉菌属(Streptomyces)、假诺卡氏亚目(Pseudonocardineae)束丝放线菌科(Actinosynnemataceae)伦茨氏菌属(Lentzea)和假诺卡氏亚目(Pseudonocardineae)假诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)拟无支酸菌属(Amycolatopsis),其中以链霉菌属最多,占分离菌的91%。在分离的22株代表性低温放线菌菌株中,27.3%的菌株有抑菌活性;40.9%的菌株具有纤维素酶活性,22.7%的菌株具有淀粉酶活性,18.2%的菌株具有蛋白酶活性。【结论】西藏低温生境中蕴藏着丰富的低温放线菌资源,其中一些菌株具有拮抗活性和酶活性。     

新疆13种荒漠植物根内生放线菌多样性及其抗菌活性筛选

以荒漠植物骆驼刺、铃铛刺、碱蓬、盐穗木、柽柳等13种植物的根为材料,利用SCA培养基分离其内生放线菌,通过菌株16S rRNA基因测序,分析荒漠植物内生放线菌物种多样性。以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、细极链格孢菌、大丽轮枝菌和尖孢镰刀菌为靶标,通过琼脂扩散法和平板对峙法开展抗菌活性筛选。从13种荒漠植物分离出533株内生放线菌,鉴定的361株,分布于6个目,7个科,9个属,77个种,另有3个潜在新种,其中链霉菌属为优势类群,冢村氏菌属与伦茨菌属首次从植物中分离得到。研究表明13种荒漠植物内生放线菌多样性有明显差异,骆驼刺内生放线菌最丰富,分离到6个属27个种,链霉菌属有20个种;老鹳草分离到的菌株数量最多,有3个属;铃铛刺分离到2个属,其中的链霉菌属有28个种;猪毛菜、盐穗木等植物只分离到链霉菌属。抗菌活性筛选显示80株放线菌有抗菌活性,其中链霉菌74株,拟无枝酸菌3株,拟诺卡氏菌、糖霉菌和链孢囊菌各1株。本研究为寻找新型抗菌活性化合物,为生物医药和生物肥料提供菌株来源。     

中江县丹参连作土壤细菌多样性研究

【目的】为了揭示中江县丹参连作土壤的细菌多样性。【方法】在中江丹参GMP基地采取患病丹参根际与非根际土壤、正常生长丹参根际与非根际土壤,采用可培养和免培养技术细菌研究供试土壤的细菌类群变化。【结果】应用稀释分离法,从供试土壤中获得46株可培养细菌,16S rDNA-RFLP分析表明,在79%相似水平分为7个遗传群,对代表菌株16S rDNA进行序列分析,构建了系统发育树,供试菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)和假单胞菌属(Pseudomonas)。【结论】PCR-DGGE图谱聚类分析表明,丹参连作显著影响了土壤细菌类群,供试土壤细菌类群间存在着明显的遗传多样性;条带克隆测序表明绝大多数菌株属于未培养细菌。     

海南野生阿宽蕉根际土壤产纤维素酶放线菌的筛选

为从海南野生阿宽蕉居群根际土壤中筛选出具有较高酶活的产纤维素酶的放线菌,并对其进行分子鉴定,从而探索阿宽蕉居群根际土壤产纤维素酶的潜力。从海南不同的野生阿宽蕉居群采集7份根际土壤,采用GA培养基和HV培养基进行选择性分离放线菌,采用刚果红染色法对分离得到菌株进行产纤维素酶活性筛选,并对具有活性的菌株进行16S rRNA鉴定,以确定其分类地位。结果表明:从7份野生阿宽蕉根际土壤中共分离得到210株放线菌。其中, 55株菌具有纤维素酶活性, 12株菌表现出强活性。16S rRNA基因序列分析结果表明,它们属于放线菌纲下5个亚目6个科8个属,分别为链霉菌属、小单孢菌属、野野村氏菌属、疣孢菌属、戈登氏菌属、假诺卡氏菌属、拟诺卡氏菌属和球孢囊菌属,其中链霉菌属、小单菌属和野野村氏菌属为优势菌属。菌株X2303、 X2502和X2733与已知菌的序列相似率最高,分别为98.52%、 98.79%和99.11%,可能分别为链霉菌属、戈登氏菌属和疣孢菌属潜在的新分类单元。具有最高纤维素酶活性的菌株X2407为链霉菌,其与Streptomyces iranensis的16S rRNA基因序列相似率最高,为99.64%,具有较高的开发价值和应用前景。所以,海南野生阿宽蕉根际土壤中存在产纤维素酶的放线菌资源,主要以链霉菌为主。阿宽蕉根际土壤中存在一些新的放线菌分类单元。     

陕西等地区豆科植物根瘤内生细菌遗传多样性和系统发育研究

采用16S r DNA PCR-RFLP、16S r DNA全序列分析、BOX-PCR等多相分类技术,对采集自陕西神木、甘肃天水、青海泽库地区的豆科植物根瘤内生细菌资源的多样性进行了研究。从采集的豆科植物根瘤中共分离到50株供试菌株,对这50株供试菌株和8株参比菌株进行了16S r DNA PCR-RFLP聚类分析。结果显示,全部供试菌株在81.5%的相似性水平上分成4个分支(在86%相似性水平上,分支I包括3个群,分支III包括3个群)。选取各群代表菌株进行16S r DNA测序,确定了50株供试菌株中,1株属于慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium),1株属于土壤杆菌属(Agrobacterium),6株属于中华根瘤菌属(Sinorhizobium),27株属于芽孢杆菌属(Bacillus),2株属于类芽孢杆菌属(Paenibacillus),其余13株则分别归属于寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)和泛菌属(Pantoea)。表明16S r DNA PCR-RFLP和16S r DNA全序列分析结果具有较好的一致性。对部分16Sr DNA序列相似性达到100%的菌株进行BOXPCR来确定是否为同一克隆。研究结果表明,陕西神木等地区豆科植物根瘤内生菌具有很丰富的遗传多样性。     

四川汉源铅锌矿区植物内生真菌的遗传多样性初步研究

【目的】了解铅锌矿区植物内生真菌的分布特点和遗传多样性。【方法】采用传统组织块培养法对四川汉源铅锌矿区6种常见植物进行内生真菌分离,根据菌落形态特征挑选了27株代表菌株,采用随机扩增多态性DNA(RAPD)指纹图谱分析技术进行了遗传多样性分析,并在RAPD分析的基础上测定了8株代表菌株的rDNA-ITS序列,利用MEGA 4.0构建了供试菌株的系统发育树。【结果】从6种植物的300个组织块中分离获得内生真菌186株,内生真菌的分离频率在0.43⁰.85之间,平均为0.62,所有植物茎内生真菌的分离频率最高,叶部次之,根部最低。RAPD分析表明,在76%的相似性水平处,27株供试菌株被分为8个遗传群。系统发育表明,这8个代表菌株分别分布于镰刀菌属(Fusarium),青霉属(Penicillium),座囊菌纲(Dothideomycetes),小不整球壳属(Plectosphaerella),漆斑菌属(Myrothecium),格孢腔菌属(Pleosporales),链格孢属(Alternaria)和拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)8个系统发育分支。【结论】铅锌矿区植物内生真菌具有一定的多样性,值得进一步研究。     

赤水河流域土壤放线菌及其拮抗活性研究

从贵州赤水河流域茅台镇及周边地区采集土样,用高氏1号培养基从6份土样中共分离到放线菌32株,根据形态学和生理生化特征,从中筛选15株进行分子鉴定和系统发育树分析,16S rDNA测序比对结果表明：MA06为白色类诺卡氏菌(Nocardioides albus),MA24为原小单孢菌(Promicromonospora),其余13株为链霉菌(Streptomyces),其中MA03为极暗黄链霉菌(Streptomyces fulvissimus),MA14为Streptomyces europaeiscabiei,MA07属Streptomyces sp.。通过构建系统发育树发现：15株放线菌分离株聚为三支,MA06和MA24各单列一支,其余的聚为第三大支,进一步表明了链霉菌属、类诺卡氏菌属和原小单孢菌属相互之间亲缘关系较远。抗菌活性检测发现M07、M25、M30和M32抗菌作用强,预示其作为生防资源菌和抗生素产生菌的潜在价值。     

虎杖内生放线菌的分离鉴定及抗菌活性

采集秦巴山区野生虎杖(Polygonurn cuspidatum),选取以海藻糖、葡萄糖、淀粉等为主要营养和能源的4种培养基,经分离纯化得到47株内生放线菌.经形态学鉴定并结合16S rDNA序列分析,将6株具有较强抑菌活性的菌株初步鉴定为链霉菌属(Streptomyces)2株,小单孢菌属(Micromonospora)2株,链孢囊菌属(Streptosporangium)2株;采用滤纸片法初步研究了内生放线菌发酵液的抑菌活性.结果表明,17株菌株具有不同程度的抗菌活性,占所有分离菌株的36.2%,其中6株具有较明显的抑菌活性,菌株PEA023对所有靶标菌均有较强的抑制作用,菌株PEA023和PEA032对铜绿假单胞菌具有拮抗活性.     

新疆棉花根际土壤铁载体产生菌的遗传多样性及系统发育研究

 【目的】了解中国新疆地区铁载体产生菌的遗传多样性和系统发育,为筛选高效铁载体产生菌提供依据。【方法】采用BOXAIR-PCR、16S rRNA PCR-RFLP和16S rDNA全序列分析方法对分离自新疆地区棉花根际土壤的铁载体产生菌的遗传多样性进行分析。【结果】在BOXAIR-PCR分析中,68株供试菌分为11个遗传群;在16S rRNA PCR-RFLP分析中,68株供试菌分10个遗传群;代表菌株的16S rDNA 全序列分析表明,供试菌分属于假单胞菌属（Pseudomonas）、肠杆菌属（Enterobacter）、不动细菌属（Acinetobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、短状杆菌属（Brachybacterium）和泛菌属（Pantoea）。其中,假单胞菌属（Pseudomonas）为优势属。【结论】分离自新疆地区棉花根际土壤铁载体菌存在极大的遗传多样性。     

拮抗性苦豆子内生细菌的遗传多样性

[目的]研究了分离自苦豆子,对棉花枯萎病菌和黄萎病菌有较强拮抗作用的48株内生细菌进行遗传多样性,分析并对有代表性的10株菌进行序列测定和系统发育分析。[方法]采用总DNAERIC-PCR方法和16S rRNA基因全序列分析方法对48株内生细菌进行了遗传多样性和系统发育分析。[结果]ERIC-PCR指纹图谱分析表明,在Watson距离为0.31时,48株菌被划分为6个ERIC群和2个独立成群的菌株,从每个群中挑选出代表性的菌株测定其16S rRNA基因,进行系统发育分析,结果表明这些菌株分别属于Bacillus atro-phaeus、Bacillus subtilis、Bacillus cereus、Bacillus megaterium、Bacillus pumilus、Serratia marcescens。[结论]该48株内生菌遗传多样性明显,通过对该48株菌的多样性和系统发育地位的确定,可以为研究棉花枯萎病菌和黄萎病菌的机制研究奠定基础,同时为棉花生产中病害的生物防治提供新的途径。     

宁夏黄土高原马铃薯连作栽培对土壤可培养细菌遗传多样性的影响

采用平板培养、BOXAIR-PCR和16SrDNA RFLP技术对宁夏黄土高原马铃薯连作栽培土壤可培养细菌遗传多样性进行研究。结果表明,4个连作年限2个生育期8份土样共分离到91株细菌菌株,BOXAIRPCR分析发现,91株细菌菌株的遗传相似系数为0.531~0.939,相同连作年限不同生育期根际土细菌菌群分布不同,不同连作年限同一生育期根际土细菌菌群的分布也不同,随着连作年限增加,可培养细菌遗传多样性呈现下降趋势;结合16SrDNA的序列分析,从91株菌株中筛选出的41个代表菌株可分为23个物种,分属于细菌域的12个属,其中,芽孢杆菌属(Bacillus)占同一连作年限菌株数的53.6%。连作导致土壤细菌菌群结构发生变化,出现各自特有的菌属。系统发育分析表明,23个细菌物种分布于6个系统发育群。     

尖峰岭热带雨林土壤中可培养芽胞杆菌多样性分析

采用热处理法从海南省尖峰岭热带雨林土壤中分离出164株芽胞杆菌,运用16S rDNA PCR-RFLP与序列分析技术对所得菌株进行遗传多样性分析。根据16S rDNA PCR-RFLP酶切图谱的UPGMA聚类分析,在相似性为100%的水平上,分离到的164株芽胞杆菌分属于23个酶切类型,显示出丰富的遗传多样性。16S rDNA序列分析结果表明,这些菌株主要分布于Bacillus(52%)、Paenibacillus(36%)、Lysinibacillus(4%)、Brevibacillus(4%)和Psychrobacillus(4%)5个属,其中优势属为Bacillus;有6株芽胞杆菌的16S rDNA序列与数据库中相应模式菌株的最大相似性为98.3%~99.0%,可能为潜在的芽胞杆菌新种资源。     

山苍子（Litsea cubeba）可培养内生细菌的多样性

【目的】研究山苍子可培养内生细菌的多样性。【方法】利用添加植物组织浸提液的营养琼脂培养基分离山苍子根、茎、叶及果实中的可培养内生细菌,采用16S rDNA序列鉴定法对分离获得的山苍子可培养内生细菌进行鉴定。同一组织内,对16S rDNA序列及形态完全一样的菌株合并冗余,用Clustalx对分离得到的菌株16S rDNA进行排序,构建NeighborJoining系统进化树,并计算Jaccard指数和多样性指数。【结果】 共分离得到52株山苍子可培养内生细菌（根23株、茎8株、叶7株、果实14株）,分属于芽孢杆菌属（Bacillus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、Paenochrobactrum、普罗威登斯菌属（Providencia）、假单胞菌属（Pseudomonas）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和Lysinibacillus共7个属的16个种,其中芽孢杆菌属细菌40株,与Bacillus tequilensis、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）3个种最接近的内生细菌占分离细菌株数的69.2%;根及果实中的可培养内生细菌数量及种属均最丰富,其多样性指数高于茎、叶;叶与果实可培养内生细菌的Jaccard指数最高,达0.56,其余均较低。【结论】山苍子可培养内生细菌在植株内部的分布既有种属特异性,又有器官相似性。     

玉米内生细菌的动态分布及拮抗作用

[目的]比较不同品种及生育期玉米内生细菌的多样性差异,对分离到的内生细菌的拮抗作用进行鉴定。[方法]以桂单0810、迪卡008、正大619玉米品种苗期和穗期的不同组织为研究对象,采用组织研磨匀浆方法分离培养内生细菌,结合形态生理特征和16S r DNA基因序列同源性比对分析对菌株进行了分类,并测定了所分离的菌株对4种玉米病原菌的拮抗作用。[结果]从桂单0810、迪卡008、正大619这3个玉米品种苗期和穗期的根、茎、叶中共分离到82株内生细菌,归于4个属,芽孢杆菌属为优势菌群,各菌群在不同生育期及组织的分布动态各有特点,其中有8株菌对4种玉米病原菌表现出不同程度的拮抗作用。[结论]玉米内生细菌的多样性丰富,可作为玉米病害生防菌的来源。     

螃蟹脚可培养内生细菌多样性及其促生活性研究

【目的】揭示螃蟹脚可培养内生细菌的多样性及其产IAA、铁载体及解磷、解钾能力,筛选具促生活性菌株,为后续植物内生细菌资源的开发与利用提供一定的基础数据和理论依据。【方法】以寄生植物螃蟹脚为研究材料,采用4种分离方法和5种不同培养基分离其内生细菌,通过16S rRNA基因序列对内生细菌进行鉴定,并构建系统发育进化树确定内生细菌的分类地位;从分离获得的螃蟹脚内生细菌中筛选具有ACC脱氨酶活性菌株,并对含ACC脱氨酶内生菌株的产IAA、铁载体及解磷、解钾能力进行测定。【结果】从螃蟹脚中共分离纯化获得60株内生细菌,通过16SrRNA测序及比对分析,去重复后共获得52株螃蟹脚内生细菌,分属于15科22属,其中以悬浮法（Z法）和纤维素—脯氨酸培养基（4号）的分离效果最佳,分别获得16和17个菌属,且以短小杆菌属（Curtobacterium）为优势菌属,占23.08%。促生能力测定结果表明,12株具ACC脱氨酶活性的内生细菌中7株菌（占58.33%）具有产IAA能力,其中菌株SWFU34产IAA能力最强,为4.95mg/mL;10株菌（占83.33%）具有产铁载体能力;8株菌（占66.67%）具解磷和解钾能力,其中有4株菌株（占33.33%）同时具有产IAA、铁载体及解磷、解钾能力。【结论】螃蟹脚蕴藏着丰富的微生物资源及具促生活性的菌株,其中短小杆菌属为优势菌属,假单胞菌属菌株SWFU34的促生活性最突出,具有农业应用的潜力。     

川西高海拔地区饲用黄芪根瘤菌的遗传多样性

为了揭示川西高海拔地区（四川甘孜藏族自治州和阿坝藏族羌族自治州）原生野生饲用黄芪根瘤菌的遗传多样性,为筛选优良菌株提供依据,采用纯培养法从该地区部分饲用黄芪植物根瘤中分离纯化根瘤菌;通过BOXAIR、16S rDNA-RFLP及PCA（principal component analysis）分析饲用黄芪根瘤菌的遗传多样性。结果表明,从川西高海拔地区7个县15个采样点获得10种饲用黄芪植物的根瘤,共分离纯化出36个根瘤菌菌株;在相似系数82.4%的16S rDNA PCR-RFLP分析中,所有供试菌株均与参比菌株完全分开,供试菌株聚成8个遗传群（SCAU509,SCAU553单独分开）;在相似系数83.2%的BOX-PCR分析中,饲用黄芪根瘤菌36个供试菌株和14个参比菌株聚成10个遗传群。饲用黄芪根瘤菌16S rDNA Simpson遗传多样性指数 D = 0.949。 研究显示川西高海拔地区（四川甘孜藏族自治州和阿坝藏族羌族自治州）饲用黄芪根瘤菌具有丰富的遗传多样性。     

广西北部湾入侵植物互花米草内生可培养细菌多样性及促生防病活性分析

【目的】探究不同入侵程度互花米草（Spartina alterniflora）根、茎和叶内生可培养细菌的多样性,并分析其对植物的防病促生活性,为互花米草入侵研究提供新思路,同时为后续的农业应用提供菌种资源。【方法】以不同入侵程度的互花米草为研究对象,采用6种选择培养基,通过稀释涂布法分离内生细菌;利用16S rRNA序列相似性及构建系统发育进化树确定内生细菌的分类地位。通过平板对峙法检测内生细菌拮抗香蕉枯萎病病原菌活性;通过功能培养基分析内生细菌产吲哚乙酸（IAA）、溶磷和固氮等促生活性。【结果】从互花米草的根、茎和叶中共分离出269株内生细菌,根据菌落形态和培养特征去重复后获得82株细菌;对内生细菌进行16S rRNA测序及比对分析,82株细菌分属于6纲16目19科31属,其中包括固氮细菌21株（占25.61%）、产IAA细菌21株（占25.61%）、溶磷菌11株（占13.41%）,可拮抗香蕉枯萎病病原菌14株（占17.07%）,并发现潜在新种13株（占15.85%）。互花米草入侵程度不同,内生细菌多样性也发生变化,随着入侵程度的增加,γ变形菌占据优势,而放线菌和芽孢杆菌多样性增加。【结论】互花米草内生细菌具有丰富的多样性,且多具有促生活性和生防功能,在未来农业生产中具有潜在应用价值。     

油茶内生真菌多样性与抑菌性研究

为弄清油茶内生真菌的种类、分布特点及应用潜能,采集湖北省5个地区不同季节的油茶样品,分离其内生真菌并进行多样性分析和抑菌性分析。结果表明,共分离得到内生真菌1 612株,经形态学鉴定可归于24属,未产孢的菌株暂归为无孢菌群(66株)。青霉属(Pencillium)、链格孢属(Alternaria)、刺盘孢属(Colletotrichum)为优势类群,分别占总菌株数的21.09%、19.11%、14.70%。多样性分析结果显示,对于不同地区而言,黄冈地区油茶内生真菌的Shannon-Wiener指数(H')最高,为2.44;就不同组织部位来看,茎中内生真菌的Shannon-Wiener指数(H')最高,为2.52;就不同季节而言,秋季油茶内生真菌的Shannon-Wiener指数(H')最高,为2.58。总体而言,油茶中内生真菌的菌群较为稳定,地区间及组织部位间样品内生真菌组成有一定的相似性。抑菌性结果显示,在挑选的24株内生真菌中,有17株内生真菌的发酵提取物具有抑菌活性,其中3株表现出较好的抑菌效果,分别属于青霉属、链格孢属、叶点霉属(Phyllosticta),这说明油茶内生真菌的抑菌性较强,值得进一步研究。