速生型刺槐遗传转化体系的建立

为获得稳定的转基因刺槐植株,以速生型刺槐叶轴为转化受体,对转化过程中的一些影响因素进行了探究,建立了较为完善的遗传转化体系。结果表明:继代20~35d之间刺槐叶轴最适宜转化;卡那霉素的筛选浓度为30mg/L;头孢霉素的抑菌浓度为200mg/L;合适的侵染时间是20min;30mg/L的乙酰丁香酮有利于抗性芽的发生;共培养2d对转化适宜;抑菌7d后再加选择压有利于抗性芽的产生。最后得到的抗性植株经PCR检测,初步证明外源目的基因OsDREB1已整合到刺槐基因组中。     

正交设计在杨树最佳遗传转化体系的建立

本试验以建立的南林95杨高频再生体系为基础,利用正交试验设计,通过GUS组织染色分析法研究了预培养时间、菌液浓度、AS浓度、侵染时间和共培养时间5个因素在4个水平上对南林95杨遗传转化的影响,并探讨了南林95杨转化中添加卡那霉素(Kanamycin)的适宜浓度。结果表明:外植体预培养7d,在含乙酰丁香酮AS200μmol/L、菌液浓度OD值为0.6的农杆菌液中侵染20min,共培养3d为最佳遗传转化体系,适宜的卡那霉素筛选浓度为50mg/L;经GUS染色检测和PCR分析表明,GUS基因已初步整合进南林95杨基因组中。     

EuFPS基因表达载体构建及对杜仲遗传转化的研究

本实验用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切植物表达载体pSH737和含有目的基因的pUC-FPS,定向连接得到重组质粒pSH-FPS,将其导入农杆菌EHA105。采用农杆菌介导法对杜仲进行遗传转化,研究了卡那霉素(kanamycin,Km)浓度、预培养时间、菌液浓度及侵染时间、乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)浓度、共培养时间等对杜仲遗传转化效率的影响。结果表明,选择无菌苗苗龄15d的杜仲下胚轴,卡那霉素浓度50mg/L,农杆菌浓度OD600值0.3~0.6,侵染时间8min,侵染时菌体重悬液中添加50μmol/L乙酰丁香酮,共培养时间3d,抗性芽的获得率最高。对再生植株进行GUS检测发现有45%的植株呈阳性。     

农杆菌介导高羊茅遗传转化体系的建立

为建立农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导高羊茅(Festuca arundinaceaSchreb.)遗传转化体系,以草坪型高羊茅品种凌志的胚性愈伤组织为受体材料,通过gus基因瞬时表达检测,研究了多种因素对农杆菌介导转化的影响。结果表明,农杆菌介导高羊茅胚性愈伤组织转化的适宜条件为:愈伤组织在含BAP和NAA各0.5mg/L的培养基上预培养3d;菌液浓度OD600值0.7,感染时间15min;农杆菌预培养基和悬浮培养基以及共培养基中添加100μmol/L的乙酰丁香酮;共培养温度23℃,共培养时间3d,共培养基pH值5.2。不同浓度潮霉素筛选效果试验表明,采用低浓度(50mg/L)潮霉素连续筛选,再生获得的转基因植株数最多,因此是最为可取的筛选方式。     

影响根癌农杆菌介导的丰香草莓遗传转化因素分析

将构建的携带NPTⅡ和AP-D基因的植物表达载体pBI121导入根癌农杆菌EH105中后,用其对草莓主栽品种丰香叶盘进行遗传转化,探讨了卡那霉素(Kan)的浓度、菌液浓度、侵染时间、预培养时间、共培养时间和筛选方式等因素对转化率的影响。结果表明:丰香草莓适宜的转化条件是Kan筛选浓度为20 mg/L,预培养时间为2~3 d,菌液浓度OD6000.3~0.5,侵染时间10~20 min;共培养2~3 d后将外植体接到含有5 mg/L Kan和500 mg/L Carb的诱导培养基上进行培养,以后每次继代逐步提高Kan选择压力至终浓度20 mg/L(每次增加5 mg/L);或共培养2~3 d后将外植体接到含有500 mg/L Carb的诱导培养基上,培养2周后继代到含20 mg/L Kan和400 mg/L Carb的培养基上进行选择培养。根据PCR检测结果,抗性愈伤组织转化率高达18.5%。抗性愈伤组织经进一步诱导,最后获得了17株抗性植株。本文探讨了影响丰香草莓转化的多个因素,以期建立高效的遗传转化体系,为草莓属植物种质的遗传转化奠定基础。     

农杆菌介导的洋桔梗遗传转化体系的建立

以洋桔梗叶片为外植体,建立了植株再生体系,并在此基础上,用根癌农杆菌介导法,研究了影响洋桔梗转化的若干因素。结果表明,诱导最佳培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.15mg/L,不定芽诱导率达74.5%;不定芽生根培养基为1/2MS+IBA 0.5 mg/L,生根率达90%。不定芽分化阶段和生根阶段的Km筛选浓度分别为45mg/L和15mg/L;根癌农杆菌菌液浓度OD600值为0.6,侵染时间10min,共培养时间3d,有利于抗性芽的产生。Km筛选得到的抗性植株经过PCR和Southern检测表明,八氢番茄红素合成酶基因(PSY)已经整合到洋桔梗基因组中。     

甘蓝型油菜抗病虫双价基因转化体系的建立

以甘蓝型油菜（Brassica napus L.）品种浙双758子叶柄外植体为受体,建立农杆菌介导转化体系,研究乙酰丁香酮、羧苄青霉素浓度和潮霉素筛选浓度等对农杆菌遗传转化效果的影响。结果发现,羧苄青霉素对农杆菌的抑制效果以500mg/L最佳,且对子叶柄外植体愈伤组织诱导和分化的影响最小,愈伤组织诱导率和芽再生率分别为75.2%和65.1%。5.0mg/L的潮霉素能完全抑制未转化再生植株的生长,使其最终褐化死亡,在此潮霉素筛选浓度下,获得了32株转化再生植株。共培养时培养基中添加100μmol/L AS的芽再生率为3.9%,显著高于未添加AS的芽再生率（2.0%）,说明共培养阶段添加酚类物质乙酰丁香酮有利于转化载体T-DNA的转化。部分转化再生植株经PCR和Southern杂交检测呈阳性,病虫害接种试验表明转化植株对菌核病和小菜蛾有较好的抗性。     

保加利亚尖椒再生及遗传转化条件的优化

为了提高辣椒子叶不定芽的伸长率和遗传转化效率,本研究以保加利亚尖椒子叶为外植体,通过正交试验分别对影响保加利亚尖椒子叶不定芽伸长的激素组合以及遗传转化参数进行了优化。结果表明：诱导不定芽伸长的最佳激素组合为0.2mg/LIAA＋1.0mg/LGA3＋0.1mg/LPBU,不定芽伸长率最高为60%;以5mg/L潮霉素为选择压,预培养时间为4d、共培养时间为2d、侵染时间为20min时,诱导的抗性不定芽比率最高。本研究建立的辣椒再生及遗传转化体系为辣椒转基因研究奠定一定的基础。     

根癌农杆菌介导的蓝猪耳遗传转化

报道了根癌农杆菌（Agrobacterium tumifaciens）介导的蓝猪耳（Torenia foumieri）遗传转化的方法。筛选蓝猪耳转化芽的最适卡那霉素（Kan）浓度为400mg／L；以稀释10倍的菌液浸染叶盘10～20min，固体共培养基（含20μmol／L乙酰丁香酮）上23℃共培养7～8d可获得转化芽诱导率27．2％；16h光照，8h黑暗是较理想的共培养光周期；茎段作为外植体，其转化芽诱导率要高于叶盘的转化芽诱导率，而且其转化芽比叶盘的转化芽健壮；1／2MS＋100mg／L Kan＋0．5mg／L IAA是比较理想的生根培养基。实验结果表明，根癌农杆菌介导的蓝猪耳转化获得了抗性再生植株，转化率为24．1％。     

雪樱子组织培养及植株再生体系的研究

以雪樱子无菌苗叶片及茎段为外植体,研究了不同激素及不同浓度激素配比的培养基对雪樱子愈伤组织的诱导、不定芽分化及其生根的影响。结果表明,愈伤组织诱导以及芽分化最适培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+ IAA 0.2 mg/L,出愈率为87.5%,分化率为65.0%;生根最适培养基为MS+ IAA 0.2 mg/L。     

高粱茎尖再生体系及其遗传转化影响因子的研究

本文对高粱茎尖再生体系及其转化影响因子进行了研究。不同基因型的茎尖再生频率有很大差异,说明基因型是影响茎尖再生的一个重要因素。在9种不同的激素组合中,以0.25MG/L KT、0.5MG/LBAP和0.25MG/L IAA对茎尖的再生效果最好。在MS培养基的基础上,采用B5培养基维生素并添加200MG/L L-ASN,10MG/L抗坏血酸和100MG/L PVP可提高茎尖再生频率。对农杆菌介导高粱茎尖转化的因子进行了优化,获得较高转化频率的条件为:茎尖预培养时间3D,在OD600值为0.5农杆菌菌液中感染10MIN,共培养3D。     

农杆菌介导的大豆成熟胚芽尖遗传转化体系的优化

以大豆品种‘浙春3号’的胚芽尖为受体材料,利用农杆菌介导法转化抗逆相关大豆转录因子GmGT-2A,为探讨过量表达该基因以提高大豆对非生物胁迫的抗逆性准备材料,通过研究预培养时间、共培养培养基的6-BA浓度、侵染时间等因子对转化效率的影响,系统优化了大豆的成熟胚芽尖转化体系。单因素优化实验结果表明：预培养时间、6-BA浓...     

根癌农杆菌介导的马铃薯转化系统的优化

以马铃薯品种PB 04的叶片和茎段为外植体,对其再生和农杆菌介导的遗传转化体系进行了研究。分别比较不同转化条件(菌液浓度、感染时间、预培养及共培养时间)对马铃薯遗传转化效率的影响,以及选择压浓度和加入时间对抗性愈伤出芽的影响,结果表明:(1)在玉米素(ZT)2 m g/L,萘乙酸(NAA)0.01 m g/L条件下能有效地提高马铃薯愈伤组织分化率;(2)外植体经过2 d的预培养,在OD600=0.8的农杆菌菌液中侵染10 m in后,抗性愈伤诱导率最高。(3)头孢霉素(C ef)比羧苄青霉素(C ar)更适合用于马铃薯外植体的遗传转化。(4)农杆菌侵染后恢复培养5~7 d再加入卡那霉素(Km)50 m g/L能有效地提高外植体的转化率。     

棉花农杆菌基因转化体系的优化和抗黄萎病转基因植株的获得

为了优化根癌农杆菌介导的棉花下胚轴切段的基因转化体系,以苜蓿抗菌肽基因（alflafa antifungul peptide gene, alfAFP）为目标,利用GUS报告基因和潮霉素抗性基因的检测方法,分析和探讨了根癌农杆菌菌种、菌液浓度、浸染下胚轴的时间、共培养中乙酰丁香酮（AS）的浓度、共培养温度和时间等因子对基因转化的影响。优化分析表明,用农杆菌菌株LBA4404当OD600值为0.5-0.7的菌液浸染5-7日龄的棉花无菌苗下胚轴切段10-15分钟,在含200µmol/L AS的共培养基中21℃暗培养60h可更有效地提高转化率。经上述条件处理的下胚轴在含50mg/L潮霉素的愈伤诱导培养基上培养3周可产生转化率最高的愈伤。愈伤组织经分化培养获得15株再生棉花,经过PCR和southern-PCR分析,发现其中12株含有外源抗病基因alfAFP,可作为棉花抗病育种的种质。     

苹果砧木对低氮胁迫的响应及适应性评价

  【目的】  明确低氮胁迫对7种苹果砧木生长及生理生化特性的影响,为耐低氮苹果砧木的选育和氮高效吸收利用生理机制的研究提供理论依据。  【方法】  沙培试验以改良1/2 Hoagland营养液为基础,设定硝态氮含量正常水平(NN,5 mmol/L NO₃–)和低氮胁迫(LN,0.5 mmol/L NO₃–)两个处理,供试苹果砧木包括矮化砧T337、Nic29、Pajam2、B9、71-3-150和半矮化砧青砧2号、乔化砧山定子(Malus baccata L. Borkh.),均为一年生健康苗。处理60天后,测定砧木新稍生长、物质积累、根系形态、叶片和根系硝酸还原酶活性、植株氮累积量,利用隶属函数模糊评价法比较不同苹果砧木的耐低氮能力。  【结果】  在正常供氮条件下,乔化砧山定子的植株总干重和氮利用效率明显高于其他5种矮化砧;矮化砧中Pajam2的植株干物质积累量最大,B9的根冠比最高;矮化砧Nic29的新梢生长速率和叶片硝酸还原酶(NR)活性显著高于其余6种砧木;半矮化砧青砧2号的根系NR活性显著高于其余砧木,有利于植株的氮累积。与正常供氮相比,低氮条件下,T337、Nic29和山定子的新稍生长均受到显著抑制;B9、Pajam2和青砧2号的新稍生长未受明显影响;而71-3-150的新稍生长速率提高,叶面积增大,根系中干物质积累量增加,植株根冠比显著增大,为正常供氮处理的2.59倍。低氮条件下,T337、B9、Pajam2和山定子根系总表面积和总根长均显著降低,T337降幅最大;而71-3-150的根系总表面积、总根长、根系总体积、根尖数等根系参数显著升高;Nic29的根系总表面积、总根长和根总体积升高,但根尖数减少,根系分枝数也升高。低氮胁迫条件下,苹果砧木叶片NR活性减小,B9、Nic29、Pajam2和山定子根系中NR活性较正常供氮分别提高了3.70、5.16、2.85和5.14倍。低氮条件下,T337、B9、Pajam2和青砧2号的叶片、茎干和根系中氮累积量均趋于降低,植株氮累积量减小,青砧2号降幅最大,但B9、Nic29、Pajam2和青砧2号的氮利用效率均显著提高,青砧2号的增幅最大;而71-3-150的根系和植株氮累积量均显著升高。基于7种苹果砧木生长、根系参数、氮代谢酶活性、氮累积量和氮利用效率等19个指标的耐低氮胁迫指数,结合隶属函数模糊评价法和聚类分析将7种砧木分为3种耐性类型:第Ⅰ类为耐性强的砧木(71-3-150);第Ⅱ类为耐性较弱的砧木(Nic29、山定子、B9和青砧2号);第Ⅲ类为耐性最弱的砧木(Pajam2和T337)。  【结论】  在正常供氮条件下,乔化砧木山定子和半矮化砧青砧2号在植株干物质积累、根系发育和养分吸收利用等方面均强于矮化砧,但其对低氮胁迫适应性较弱。低氮条件下,苹果砧木通过提高氮利用效率适应养分亏缺,耐性强的砧木植株生长受抑制程度较小,并通过调节自身生理特性,增加根系中的物质和养分积累,提高植株根冠比,以适应低氮环境。     

根癌农杆菌介导转褪黑素基因草莓的获得

为建立根癌农杆菌介导的草莓褪黑素基因高效遗传转化体系,以草莓品种“早红”叶片和叶柄为外植体,优化了影响根癌农杆菌遗传转化的因素,包括农杆菌菌液浓度、侵染时间、共培养时间和预培养时间等,建立了适宜草莓“早红”的农杆菌遗传转化体系。结果表明,“早红”草莓适宜的转化条件是：外植体的最适预培养时间为2～3 d,农杆菌侵染的最佳菌液浓度为OD600 0.3～0.5,最适侵染时间为15 min,最适共培养时间为3 d。在此基础上,通过根癌农杆菌介导法将褪黑素合成关键酶N -乙酰转移酶（AANAT）和羟吲哚-氧甲基转移酶（HIOMT）基因AANAT和HIOMT转入草莓基因组,并对获得的抗性植株进行PCR和PCR-Southern blot检测分析,结果表明外源基因已经整合进草莓基因组中。RT-PCR分析证明外源基因已经在转录水平表达。     

农杆菌介导陆地棉棕彩选1号茎尖遗传转化

为建立高效的棕色棉茎尖遗传转化体系,以陆地棉棕彩选1号为材料,采用农杆菌介导茎尖的遗传转化方法,以培养7 d的棕彩选1号幼苗茎尖为受体,设计正交试验对共培养时间、共培养温度、菌液OD600、侵染时间等条件进行优化;此外,还研究了受体茎尖的大小及真空渗透等因素对转化效率的影响,初步建立了棕色棉茎尖农杆菌介导的遗传转化技术体系。结果表明,带有0.5 cm下胚轴的茎尖适合转化,适宜的农杆菌介导遗传转化条件为农杆菌菌液浓度OD600=1.0,侵染时间20 min,共培养时间3 d,共培养温度24℃。此外,真空渗透处理有助于抗性苗的发生。再生植株经在含100 mg·L~(-1)卡那霉素的培养基上筛选,获得102株抗性植株,再进行PCR鉴定和Southern杂交检测,共获得24株转基因植株,转化率为0.4%,且为单拷贝基因插入。本试验建立的优化条件为棕色棉的遗传转化奠定了理论基础。     

低磷胁迫下五种苹果砧木的磷吸收与利用特性

【目的】磷是植物必需的矿质元素之一,能够促进植株花芽分化,但施入土壤中的磷易被固定从而变成难以利用的闭蓄态磷,使土壤中的有效磷含量降低。因此,研究和发掘磷高效的苹果砧木对于解决低磷胁迫和提高磷利用效率具有重要意义。本研究以5种一年生苹果野生砧木为试材,进行低磷胁迫处理,调查苹果野生砧木对磷的吸收和利用特性。【方法】盆栽试验以正常管理的一年生八棱海棠（M. micromalus Makino）、 平邑甜茶（Malus hupehensis Rehd.）、 东北山荆子（M. baccata Borkh.）、 富平楸子［M. prunifolia（Willd）Borkh.］、 新疆野苹果［M. sievesii（Ledeb.）Roemer］5种苹果砧木为试材。试验分为低磷（LP）和正常施磷（CK）两组处理,每个处理6次重复（6盆）。根总表面积、 根系总长度分析用WinRHIZO 根系分析软件进行; 植株各器官组织烘干粉碎后,用钒钼黄比色法测定其含磷量。离子吸收动力学参数的测定采用平邑甜茶水培幼苗,吸收前置于黑色培养瓶饥饿处理24 h,幼苗吸收24 h后采集营养液10 mL,钼锑抗比色法测定含磷量。【结果】5种砧木的相对磷效率从高到低为富平楸子（93.66%）平邑甜茶（87.69%）东北山荆子（83.44%）八棱海棠（74.54%）新疆野苹果（74.01%）。在低磷及正常施磷条件下,5种砧木的磷吸收效率均为富平楸子平邑甜茶东北山荆子新疆野苹果八棱海棠; 磷利用效率为平邑甜茶富平楸子八棱海棠新疆野苹果东北山荆子。H2PO-4离子最大吸收速率（Vmax）最高的为富平楸子［101.81 mol/(gh)］,其次为平邑甜茶［66.40 mol/(gh)］、 东北山荆子［45.00 mol/(gh)］和新疆野苹果［44.32 mol/(gh)］,八棱海棠的Vmax最低,为41.28 mol/(gh); 平邑甜茶的Km值最低,为4.05 mol/L,富平楸子为8.68 mol/L,东北山荆子为12.29 mol/L,新疆野苹果为12.64 mol/L,八棱海棠最高为13.57 mol/L。吸收根总表面积和总根长均以富平楸子最大,八棱海棠最小。【结论】低磷胁迫下富平楸子的相对磷效率和磷吸收效率最高,在低磷胁迫下生长势最好并且磷吸收能力最强,是一种对低磷胁迫适应能力较好的苹果砧木; 平邑甜茶的相对磷效率仅次于富平楸子,磷利用效率最高,其耐低磷胁迫的能力也仅次于富平楸子。进一步分析发现,砧木对磷的吸收效率与吸收根总表面积和总根长存在显著正相关关系,说明低磷胁迫下植物通过增加吸收根总表面积及总根长等方式,扩大根系吸收面积,从而增加根系对磷的吸收。