基于苎麻转录组测序的SSR序列分析及EST-SSR标记开发

为加快苎麻分子遗传学研究和分子标记辅助育种,本研究利用转录组测序技术开发苎麻EST-SSR标记,筛选到48 547条Unigene,覆盖31 Mb的片段长度,对所筛选到的Unigene进行SSR分析后,利用Primer 3.0批量设计引物,随机挑选1 214对EST-SSR引物对表型性状差异较大的8份苎麻种质资源进行PCR扩增及聚丙烯酰胺电泳检测,以期得到可利用的EST-SSR标记。结果发现,在48 547条Unigene中含有SSR的共有13 770条,共有19 964个SSR位点,平均每2.43条EST发现一个SSR、每1.55 kb含有1个SSR。在19 964个SSR位点中,主要为单、二核苷酸,占总数的83.6%,三核苷酸重复单元占14.98%,其余核苷酸重复单元占比共为1.42%;去掉单核苷酸重复单元,共设计3 579对SSR引物,从中随机选择1 214对EST-SSR引物对8份苎麻种质进行SSR引物筛选及多态性分析。1 214对引物中有216对引物表现出良好的多态性,占总引物的17.79%;扩增条带数为2～5;Shannon指数为0.233 8～1.461 5;PIC值为0.110 3～0.700 9。通过遗传相似性分析,上述8份种质遗传相似性系数为0.669 0～0.859 5,在相似系数为0.72处可将8份种质分为3类。本研究开发的EST-SSR引物可为苎麻及其近源物种遗传多样性分析,遗传图谱构建及分子标记辅助育种等研究提供帮助。     

基于苦瓜转录组序列的SSR分子标记开发

为了全面了解苦瓜转录组SSR位点特征和满足苦瓜分子育种对分子标记的需求,利用MISA软件对来自苦瓜材料‘大沥-11’6个组织的59740条转录组Unigene序列进行SSR位点搜索,共检测出31066个SSR位点,出现频率(发现的SSR个数与总Unigene数之比)为52.00%,平均每2.62 kb出现1个SSR位点。在苦瓜转录组SSR位点中,基元类型主要为三核苷酸,占总SSR位点的42.17%;其次是二核苷酸,占总SSR位点的31.66%。利用Primer 3软件对搜索到的苦瓜转录组SSR位点进行引物设计,然后把获得的引物序列比对回苦瓜的参考基因组,选择上下游引物序列都是唯一比对的序列并去除重复后共获得9135对特异SSR引物。选择MC00上的232对特异SSR引物对‘谭边大顶’和‘华艺320’两个苦瓜品种基因组DNA进行PCR扩增,其中有219对特异引物可扩增出清晰的条带,有效扩增率为94.40%;有31对特异引物扩增产物表现出多态性,多态率为13.36%。本研究开发的苦瓜转录组特异SSR引物为苦瓜的种质资源分析、基因定位、分子标记辅助选择等理论与应用研究提供了引物数据参考。     

马尾松转录组SSR序列特征分析及其分子标记开发

为了开发马尾松SSR标记,本研究利用MISA软件对马尾松转录组测序获得的148 186条Unigene (序列总长约91 449.7 kb)进行全面分析,共搜索获得6 611个SSR位点,分布在6 003条Unigene上,SSR发生频率为4.05%,平均每13.83 kb出现1个SSR,结果发现单核苷酸重复出现的频率占总SSR的53.60%;二核苷酸为23.46%;三核苷酸为21.33%。通过对含SSR的Unigene的GO分析,显示生物过程包含的Unigene占40.60%;细胞组分包含的Unigene占35.45%,分子功能包含的Unigene占23.95%;转录组中有724个Unigene可被注释到110个KEGG通路中,其中被注释到新陈代谢的Unigene最多有312个,其次是遗传信息处理类有183个。根据含SSR的Unigene序列共设计了4 247对SSR引物,并随机挑选30对SSR引物进行PCR扩增验证,其中12对引物能够扩增出目标条带,引物的有效性为40%。本研究结果表明,马尾松转录组测序获得的Unigene序列可作为SSR标记开发的有效来源,所开发的SSR标记为马尾松的遗传图谱构建、分子标记辅助育种等研究提供丰富可靠的标记。     

基于转录组测序的黑枣EST-SSR引物开发与鉴定分析

目前黑枣已有的分子标记比较匮乏,本研究基于转录组测序技术对黑枣品种进行SSR引物开发,为黑枣种质资源评价及分子标记辅助育种提供有力的技术支持。本研究对‘冀洪1号’黑枣转录组序列进行了分析筛选和开发,并利用开发出的引物进行了验证分析。结果表明:共得到52 537个Unigene序列,SSR位点总数22 327个,包含SSR的Unigene序列数为15 286条。黑枣SSR位点的重复单元中,二核苷酸重复类型的SSR最多(52.26%),其次为单核苷酸(25.84%)及三核苷酸(19.25%)。随机挑选90对EST-SSR引物进行验证,有效扩增率为77.78%(70对),多态性引物比例为18.57%(13对),对13个多态性位点进一步分析可得,共扩增了35个等位基因,PIC值介于0.233~0.677之间,平均为0.430。本研究开发出的EST-SSR分子标记,为后期进行黑枣良种的鉴别及分子育种提供了分子技术手段。     

桃(Prunus persica [L.] Batsch)转录组SSR信息分析及其分子标记开发

利用MISA软件筛选桃(Prunus persica[L.]Batsch)转录组数据,获得的109 248条Unigene,检测出24 102个SSR位点,分布于22 689条Unigene中,出现频率为20.76%。SSRs位点中主导类型是以AG/CT(占总SSRs的18.70%)为主的二核苷酸重复,占总SSRs的33%;其次是三核苷酸重复,出现频率为27%;四核苷酸重复,占总SSRs的25%。利用Primer 5共设计出9 657对SSR引物。随机选择50对引物进行PCR扩增,其中20对扩增出清晰可重复的条带,并且在同属材料(苹果试材)中也能获得理想结果,引物多态性检测发现,在15份桃试材中,10对引物具有多态性,利用UPGMA作图,可将15个桃材料很好区分。结果表明,桃转录组测序产生的Unigene是开发SSR标记的有效信息,为SSR标记在桃的遗传分析上提供可靠的标记选择。     

基于花椒转录组序列SSR分子标记开发及花椒种质鉴定

为拓展分子标记在花椒种质资源分析中的应用、开发花椒EST-SSR功能性分子标记、分析花椒DNA指纹图谱,利用凤县大红袍花椒的茎尖节点转录组c DNA数据库中45 057条长度大于200 bp的非冗余Unigene序列,使用MIcro SAtellite(MISA)软件搜索SSR位点,分析花椒c DNA序列中SSR位点的频率和密度、SSR重复基元种类及比例、SSR重复次数与数量等分布特征;用Primer 3.0软件在线设计SSR引物并经PCR扩增筛选适合的多态性引物;用Quantity One软件统计多态性条带和分子量大小;NTsys 2.0软件分析12份花椒种质的遗传距离、构建树状聚类图及DNA指纹图谱库。结果表明,45 057条序列中有3 315条Unigene序列包含SSR位点,共3 814个,3 315条序列中SSR位点出现频率为7.07%;在检索出的SSR位点中,二核苷酸、三核苷酸是主要重复类型,分别占29.42%和58.58%,二核苷酸重复中以AG/TC、CT/GA出现频率最高,三核苷酸重复中GAA/CTT、AGA/TCT出现频率最高;二、三、四、五、六核苷酸重复基元总数随着重复次数的增加呈明显下降趋势。利用Primer 3.0设计的64对EST-SSR引物中,55对引物能产生预期片段大小的PCR产物,其中18对引物具有多态性;利用18对引物对12份花椒种质进行PCR扩增,共产生81条扩增条带,其中多态性条带73条,多态率为90.12%;各花椒种质的遗传相似系数为0.552 6~0.894 7,平均为0.725 0;经UPGMA聚类分析在相似系数0.70处12份花椒种质共分为3类,即顶坛花椒为Ⅰ类、竹叶椒为Ⅱ类、其他花椒为Ⅲ类;指纹图谱分析中,8对引物在5份种质中能扩增出特征带型,最少用3对引物进行组合即可将12份花椒种质区分开。成功在凤县大红袍花椒的茎尖节点转录组c DNA序列中开发SSR标记,设计并筛选出8对能扩增出特征带型的引物,最少用3对引物进行组合即可将12份花椒种质区分开,这为今后花椒遗传多样性分析、遗传图谱构建等方面提供新的引物序列并奠定了基础。     

蓝莓花粉转录组SSR位点信息分析

基于‘灿烂’、‘顶峰’、‘蒂芙蓝’、‘杰兔’和‘园蓝’5个兔眼蓝莓花粉转录组数据,开展SSR信息分析及引物设计,为开展蓝莓的基因定位及花粉直感效应形成的分子机制等研究提供理论依据。本研究采用MIcroSAtellite (MISA)和Blast2GO对无冗余Unigene进行SSR筛选、识别及富集分析,采用Primer 3进行SSR引物设计。在58 985个Unigene中有15 407个Unigene含有20 812个SSR位点,发生频率为35.28%。SSR的主要重复类型为单核苷酸(54.24%)和二核苷酸(33.78%),两者分别以A/T (53.91%)和AG/CT (28.37%)基元占绝对优势。基因GO功能分类表明,含有SSR位点的15 407个Unigene被富集到3个Ontology类别的50个GO Term中,其中涉及代谢、细胞和单机体的生物过程的GO Term最多。成功设计16 854对SSR序列引物,成功率为80.98%。从蓝莓花粉转录组基因序列中成功筛选了具有良好多态性潜能的SSR位点并开发了引物,可为蓝莓的分子标记辅助育种、遗传多样性及花粉直感效应形成的分子机制等研究提供分子标记基础。     

槟榔转录组SSR位点信息分析

采用生物信息学方法对槟榔(Areca catechu L.)果实转录组中的SSR位点信息进行分析,以期为槟榔SSR标记开发提供依据。利用MISA工具对槟榔转录组测序获得的Unigene序列进行SSR检索、位点信息分析和SSR引物设计。从94 562条Unigene中共检索到51 245个SSR位点,分布在31 482条Unigene序列中,平均分布距离为1/2.12 kb,发生频率为54.19%。单核苷酸是主要重复类型,所占比例为30.14%。优势重复基元是A/T、AG/TC、GA/CT和TA/AT,分别占单核苷酸的80%、二核苷酸的27%、26%和25%。重复次数以3～11次重复为主,所占比例为69.37%。大部分基序长度集中在12～20 bp之间,所占比例为92.77%。设计获得34 983对SSR引物。研究结果表明槟榔SSR位点分布频率较高、类型丰富、具有较高的多态性潜能和可用性,可为槟榔SSR标记开发、种质资源鉴定、遗传多样性分析、分子标记辅助育种等方面提供的理论基础。     

枇杷花转录组SSR位点信息分析

通过对枇杷花转录组数据的分析,开发新的枇杷分子标记,为研究枇杷的遗传多样性、分子标记辅助育种提供科学依据。本研究采用MIcroSAtellite (MISA)和Blast2GO对无冗余Unigene进行SSR搜索、筛选、识别及富集分析,并采用Primer 3进行SSR引物设计。搜索发现44 622个SSR位点分布于28 617个Unigene中,SSR位点出现的频率为47.51%,平均分布距离为4.87 kb。单核苷酸和二核苷酸重复是枇杷花转录组中SSR的主要重复类型,分别占总SSR的52.09%和32.83%;优势重复基元为A/T和AG/CT,分别占单核苷酸的50.94%和二核苷酸的26.70%,65.79%的基序长度集中在12～20 bp。基因GO功能分类表明,含有SSR位点的28 617个枇杷花转录组基因被富集到3个Ontology类别的51个GO Term中,Biological process涉及的GO Term最多,有21个。成功设计34 301对SSR序列引物,成功率为76.87%。通过分析表明,枇杷花转录组SSR位点出现频率高、分布密度大,具有良好的多态性潜能,能提供丰富的重复类型,可为研究枇杷的数量性状基因座定位、分子标记辅助育种、基因组进化、遗传多样性研究等提供科学依据。     

霍山石斛叶转录组中SSR位点信息分析

开发霍山石斛简单重复序列(SSR)分子标记,为霍山石斛遗传多样性和种质资源鉴定的研究提供技术支撑。利用Illumina HiSeq X10平台对霍山石斛叶片进行转录组测序,Microsatellite(MISA)软件分析霍山石斛转录组SSR的分布频率和重复基元的类型特征,软件Primer 5设计引物。从202080条Unigene中搜到43291个SSR位点,分布在36382条Unigene序列中,发生频率为18.00%,平均每6.08 kb含1个SSR位点,共有463种重复基元,单核苷酸重复占主要地位,发生频率为47.62%,在所有重复基元中,A/T出现频率最高(47.06%)。试验共获得13960条SSR引物。     

基于转录组测序数据的甘薯SSR标记开发及群体聚类分析

利用转录组数据开发SSR标记,是目前较为经济高效的DNA分子标记开发方法。为了开发更多适用于甘薯的SSR标记,本研究在前期对甘薯体细胞杂种KT1及其两个亲本4个干旱胁迫处理的24个样本转录组de novo测序的基础上,对获得的105 959条Unigene中大于等于1 000 bp的FASTA序列进行搜索,共找到12 105个SSR位点。从中筛选设计了200对SSR引物在KT1及其亲本中筛选验证,最终选择了20对多态性较好的引物,对来自不同地区的94份甘薯种质资源进行了群体聚类分析。聚类分析把94份实验材料分为3个亚群,较清晰地区分了不同材料之间的遗传相似性。这些基于甘薯转录组测序开发的SSR标记为甘薯的遗传多样性分析、辅助育种和遗传图谱构建等研究的开展提供了更加丰富的候选标记。     

基于菊芋转录组的SSR分子标记开发及鉴定

利用菊芋(Helianthus tuberosus L.)转录组测序获得的63 089条Unigene(45.71 Mb)进行SSR查找分析,共检测出6 635个SSR位点,包含于5 452条Unigene中,出现频率为10.52%,SSR位点发生频率为8.64%,其中SSR位点的主要类型为二核苷酸重复,占总SSR的45.24%,其次为三核苷酸重复。SSR位点中共包含180种重复基序,其中出现频率较高的基序主要有AG/CT、ACC/GGT、ATC/ATG、AAG/CTT。设计36对多态性SSR引物组合进行扩增和多态性评价,其中,20对引物存在多态性差异,占55.56%。利用20对引物对18个菊芋资源样品进行多样性分析,分析表明,有效等位基因(Ne)在SSR位点上变化幅度较小;Shannon指数平均值为0.622;期望杂合度(He)和观察杂合度(Ho)平均值分别为0.434和0.447。系统进化树显示,菊芋资源可从块茎表皮颜色上分为白皮和红皮2大类。此外,从地域来源上进行聚类,能将18份菊芋种质资源聚为5类。以上分析表明,菊芋转录组测序产生的Unigene信息可作为开发SSR标记的有效来源,利用获得的SSR标记可为菊芋及其近缘种的遗传图谱构建、遗传多样性分析、基因组比较研究等提供丰富可靠的标记选择。     

濒危珍稀植物半枫荷转录组中SSR位点分析

分析半枫荷转录组中的SSR位点信息,并设计简单重复序列(SSR)引物,以期为半枫荷EST-SSR分子标记提供有力工具。利用MISA工具筛选了半枫荷转录组测序获得的77629条Unigenes,对其SSR位点信息进行了分析;在此基础上利用Primer 3.0设计SSR引物,并随机选择50对SSR引物对4株不同来源的半枫荷进行多态性扩增分析。在半枫荷的转录组中,共找到15041个SSRs,分布于10669条Unigenes,SSR位点发生频率为13.74%,含多个位点的序列数为3114,占SSRs位点总数的29.19%,以复合形式出现的位点数2044个,占SSRs位点总数的19.16%,SSRs的平均距离是3.2 kb。SSRs位点中二碱基重复是主要类型,占总SSRs的42.17%;其次是单碱基重复基序(38.25%)SSRs。所包含的重复基元中,单碱基重复基元A/T(5572),二碱基重复基元AG/CT(4845)是优势重复基元类型,分别占总SSRs的37.05%、32.21%。利用Primer 3共设计出28590对SSR引物。随机选择50对引物进行PCR扩增,其中44对(88.0%)扩增出清晰、可重复的条带,15对(34.1%)扩增条带表现出多态性。半枫荷转录组SSR位点出现频率高,类型丰富;大量的SSR为其遗传多样性分析、分子标记辅助育种和遗传图谱构建提供了丰富的候选分子标记。     

基于白木香转录组的SSR序列特征分析

为探究白木香的简单重复序列特征,开发SSR分子标记用于白木香种质资源的遗传分化和分子鉴定,本研究鉴定了白木香转录组unigene序列的SSR位点,对其SSR的分布及序列特征进行统计分析,进而设计SSR引物,并验证其SSR引物的多态性。结果表明,在128 712条unigene中共鉴定到9 362个SSR位点,分布频率为7.27%。SSR序列中双碱基重复序列最多,占总SSR的54.90%;白木香双碱基重复序列以AG/CT、AC/GT为主,占34.22%。SSR位点重复次数主要集中在5～11次,占总SSR位点数的96.56%,其中三碱基重复5次的SSR位点数最多,共有1 925个。设计并合成50对引物,其中35对引物可扩增出预期大小条带,扩增效率达到70%。以24个不同白木香个体对35对引物进行扩增,采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SSR引物多态性,表明SSR引物具有多态性。研究表明,白木香转录组SSR重复基元类型丰富,分布密度高,多态性高,可用于白木香资源的遗传多样性评价、遗传分化、种质鉴定和分子育种等后续研究。     

基于菜心(Brassica campestris)基因组Survey测序开发多态性SSR标记

为解决菜心SSR标记数量不足、已开发的位点多态性差等问题,本研究利用高通量测序技术,对‘四九-19’和‘3T6’两份菜心材料进行基因组Survey测序,规模化开发多态性SSR标记。两个菜心材料分别获得55 649 657个和59 300 433个Clean reads,分开拼接组装得到430 483个和499 876个Contig。在两个材料的Contig中搜索到共有的SSR位点为30 696个,其中以二和三核苷酸重复基序最为丰富,占总SSR位点的67%。分析比较发现,3 652个(12%) SSR位点在两份测序材料间具有潜在多态性,随机挑选50个SSR位点进行PCR扩增验证,48对(96%)引物在4份菜心材料中扩增出清晰的条带,其中31对(62%)引物在两份测序样品间具有多态性,19对(38%)引物在另两份菜心材料间具有多态性。结果表明,利用基因组Survey测序能开发SSR标记和开发具有多态性的SSR标记,本研究开发的多态SSR标记将进一步为菜心分子标记的发展和应用提供基础。     

星油藤转录组SSR序列特征分析及其分子标记开发

基于星油藤(Plukenetia volubilis L.)转录组信息,分析其表达序列标签-简单序列重复(expressed sequence tag-simple sequence repeat, EST-SSR)并设计引物进行验证,为星油藤的SSR分子标记开发提供数据支持。本研究利用MISA软件对星油藤雌雄花序芽转录组测序所获得的57 664条Unigenes进行分析,共检测出10 572个SSR位点;其中8 825条Unigenes分布有SSR位点,占总Unigenes的15.30%。SSR位点的平均分布频率为每5.34 kb出现1个SSR位点。各类型的SSR位点共有154种,其中单核苷酸重复(40.48%)、二核苷酸重复(25.82%)和三核苷酸重复(28.89%)为主要的重复类型,A/T、AG/TC和AAG/CTT分别为单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸类型中主导的重复基序。利用Primer 3.0设计EST-SSR引物,并随机挑选75对SSR引物,以星油藤及其2个近缘种(亚洲星油藤和大果星油藤)为材料进行筛选验证,其中31对引物可进行有效扩增,并最终获得7对在3个物种间具有多态性的引物。本研究结果表明,星油藤转录组测序产生的Unigenes序列信息作为开发SSR分子标记是可行的,开发的这些SSR分子标记可用于星油藤及其近缘种的遗传多样性评价、种质资源鉴定和分子标记辅助育种等研究。     

西红花转录组SSR信息分析及其多态性研究

为开发西红花转录组SSR标记,利用MISA软件筛选了西红花球茎转录组测序获得的29 572条Unigenes,对其SSR信息进行分析;利用Primer 3.0软件设计SSR引物,并随机选取30对SSR引物对6个西红花品种进行SSR引物筛选及多态性分析。结果发现,在西红花转录组中共搜索到个7 804个SSR位点,分布于6 306条Unigenes,SSR发生频率为18.73%,平均每5.85 kb含有1个SSR;SSR重复基元中单核苷酸重复出现频率最高,占总SSR的47.83%,其次为三核苷酸(32.94%)和二核苷酸重复(17.41%);二核苷酸重复基元以AG/CT为主(86.68%),三核苷酸重复基元以AAG/CTT为主(24.43%)。利用Primer 3.0软件共设计出11 508对候选引物,随机选择30对引物对6个西红花品种进行SSR引物筛选及多态性分析。30对引物均能扩增出预期大小的条带,有效扩增效率为100%,30对引物在6份西红花品种间未表现出多态性。本研究开发的SSR标记可为西红花遗传图谱构建、抗病虫及抗逆功能基因定位、分子标记辅助育种及西红花遗传多样性分析等提供丰富的候选标记。     

枳壳EST-SSR标记的开发

GenBank上已公布的枳壳EST序列为开发新的SSR标记提供了宝贵的数据资源。本研究利用在线SSR鉴定软件SSRIT分析来自枳壳EST数据库的11029条Unigene序列。分析结果共发现327条EST序列含有348个SSR位点,占总数的2.96%。其中,三核苷酸重复的SSR类型最多,共有161个,占检索总数的46.26%。Primer 3.0设计合成58对EST-SSR引物,其中36对能扩增出产物,6对引物产生多态性分离,分别占所设计引物总数的62.07%和10.34%。本文研究成果为今后枳壳遗传多样性分析、遗传图谱构建及比较基因组等研究方面奠定了基础。     

玉米和高粱SSR标记在薏苡中的通用性研究

旨在分析玉米和高粱SSR标记在其近缘种薏苡中的通用性和多态性,以期筛选可用于薏苡种质资源和遗传学研究的分子标记。以11份薏苡资源为供试材料,利用SSR-PCR扩增和毛细管电泳检测方法,对364对SSR引物进行了测试和筛选。结果表明,364对玉米和高粱来源的标记中有163对能在薏苡中扩增并得到清晰的条带,其中44对标记在薏苡中表现出良好的多态性。高粱SSR的通用性和多态性比例分别为58.02%和30.85%,玉米SSR标记的通用性和多态性比例分别为23.45%和26.47%,高粱SSR标记在薏苡中通用性和多态性更好。44对引物在11份薏苡材料中扩增出110条多态性条带,每对引物扩增出的条带数在1～5条之间,平均为2.5条,PIC为0.15～0.79,其中15对引物的PIC值大于0.5,占全部多态性引物的34.09%。筛选出的通用SSR引物可为薏苡种质资源多样性和分子遗传学研究提供可用的遗传标记,也是高粱、玉米和薏苡3种作物之间比较基因组学研究的有力工具。     

芒果EST-SSR位点分析及引物开发

本研究通过芒果转录组数据开发EST-SSR标记,以期为芒果的分子辅助育种和不同品种的资源鉴定提供有效的检测手段。利用MISA软件分析芒果叶片和果实两个组织转录组结果中得到的SSR信息,经PCR验证扩增产物,分析不同品种间的亲缘关系。对芒果组装的99 328个Unigene中,其中含有SSR的序列Unigene数目为4 877个,发生频率,即含SSR的Unigene数目/总Unigene数目(4 877/99 328)是4.91%。芒果转录组中查到SSR位点6 405个。从中随机筛选31对引物,经PCR扩增后进行6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,并选出8对引物扩增具有多态性。利用DPS数据处理软件对得到的条带数据化并进行非加权组平均法UPGMA聚类分析,构建系统发生树得到8个芒果品种间的遗传距离和亲缘关系。芒果转录组测序EST-SSR分析能够为开发EST-SSR标记提供理论依据,此标记可为芒果遗传多样性分析、遗传亲缘关系及图谱构建提供研究基础。