小鼠FABP4基因启动子驱动红色荧光蛋白载体的构建及在牛体细胞中的表达

小鼠脂肪型脂肪酸结合蛋白(FABP4)的启动子/增强子元件是脂肪组织特异性启动元件,为了鉴定该元件在牛体细胞中的启动效果,首先以小鼠肝脏DNA为模板,通过PCR克隆得到5.9 kb的FABP4基因启动子片段,连入p MD19-T载体后进行酶切及测序鉴定,经Eco T 22I酶切去除非核心启动子区后精简为2.3 kb的片段,通过SacⅡ酶切将5.9 kb片段和2.3 kb片段的启动子连入红色荧光蛋白载体p Ds-Red 2-1的多克隆位点,构建为表达质粒p MF5.9-Red和p MF2.3-Red,利用脂质体法将上述载体分别转染牛脂肪间充质干细胞及牛胎儿成纤维细胞,24 h后实时定量PCR检测红色荧光蛋白转录水平。结果表明,克隆得到的5.9 kb小鼠FABP4启动子片段酶切及测序结果正确,与红色荧光蛋白载体相连的载体p MF5.9-Red和p MF2.3-Red酶切结果与预期相符,表达载体构建成功,实时定量PCR结果显示以上2种细胞在转染后24 h红色荧光蛋白均有表达,且p MF2.3-Red的转录水平是p MF5.9-Red的2倍以上。成功构建了小鼠FABP4启动子驱动红色荧光蛋白表达载体p MF5.9-Red和p MF2.3-Red,5.9 kb片段和2.3 kb片段均可驱动外源基因在牛体细胞中转录,且2.3 kb片段启动效率高于5.9 kb片段。     

丝瓜超氧化物歧化酶(SOD)酶学特性的研究

为了研究丝瓜超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)酶学特性,本研究应用分光光度计开展了温度、pH、酶体积、反应底物浓度等对酶反应的影响,为丝瓜酶促褐变的研究提供基础。试验结果表明SOD酶最优反应体系为:以底物氮蓝四唑(NBT)为例,最优温度为40℃,最适pH为7.8,其底物浓度为0.08 mol/L,最适酶液体积为0.14 m L,其根据米氏方程:y=0.002 7x-0.013(x=1/V,y=1/S),Km为0.207 9 mol/L。     

无机氮素形态对茶树氮素吸收动力学特性及个体生长的影响

选用龙井43、乌牛早、迎霜和浙农139等4个茶树品种,在盆栽条件下研究不同形态比例的无机氮肥对苗高和地径的影响,并通过对茶树硝态氮和铵态氮吸收过程的Michaelis-Menten动力学方程比较,探索氮素形态对茶树吸收氮的影响机制。结果表明,氮素形态对苗高影响极显著,对地径影响较小,NO₃^--N : NH₄⁺-N为5∶5处理的苗高增量最大,每年达15.45 cm,纯铵处理最小,每年仅7.03 cm。品种间的苗高增量以乌牛早最大,地径增量以龙井43最小。铵态氮比例增加后,茶树根系对硝态氮吸收的最大速率(V_max)下降,而亲和力先变强,后变弱;铵态氮V_max随铵态氮比例的增加快速上升,然后下降,而亲和能力会逐渐变弱,但铵态氮比例较低时,亲和力变化较缓。NO₃^--N : NH₄⁺-N 为5∶5处理时,各品种茶树对硝态氮和铵态氮的V_max分别在0.24~0.35和0.19~0.30 mmol FW g^-1 d^-1之间,根系亲和力(K_m)在0.65~0.74和0.63~0.80 mmol L^-1之间,对氮素的整体吸收生理特征优于其他处理。在盆栽条件下,不同氮素形态处理会使茶树对两种氮素的V_max和K_m均发生改变,表明茶树体内具备对土壤环境养分变化的适应机制。     

EuDQD/SDH6基因在巨尾桉莽草酸途径中的功能分析

莽草酸脱氢酶家族是多酚类物质合成的关键分支酶,本研究体外分离获得巨尾桉EuDQD/SDH6基因(KY401152.1),在大肠杆菌中表达并纯化了DQD/SDH6蛋白,以莽草酸为底物的DQD/SDH6酶动力学参数为K_m=29.93 mmol/L,V_max=(149.96±0.003) mmol·L^-1·s^-1,表明该蛋白具有SDH活性。实时定量PCR技术研究Eu DQD/SDH6在巨尾桉中的表达特性,发现Eu DQD/SDH6主要在叶片中表达,其次是茎部,根部最少,随着叶片的成熟Eu DQD/SDH6的表达量也逐渐减少。综合分析了实时定量PCR、SDH酶活性和HPLC法测定的酚酸含量的数据,研究巨尾桉DQD/SDH6的酶功能。Eu DQD/SDH6的基因表达量与SA、PCA累积量均呈负线性相关,与GA累积量正线性相关,但关联性较弱,推测桉树DQD/SDH6在巨尾桉中的生物功能可能是以3脱氢莽草酸为底物合成没食子酸,为单宁合成提供前体。Eu DQD/SDH6基因的表达量与硫酸木质素的含量呈正相关,推测E...     

富士苹果中多酚氧化酶特性的研究

以富士苹果为原料,从中提取多酚氧化酶粗提液,通过底物筛选,从不同的pH值、温度和抗氧化剂对PPO酶的影响等方面进行研究。结果表明,PPO酶对4种底物催化活性不同,由高到低的顺序依次为:邻苯二酚,DL-半胱氨酸,苯甲酸,山梨酸;PPO酶的最适pH值为5.0,最适温度30℃,最佳酶浓度0.25mol/L,最佳底物浓度0.6mol/L;当VC浓度达到150mmol/L,90%的PPO酶活性被抑制。     

莴笋多酚氧化酶的酶学特性研究

采用分光光度法测定莴笋多酚氧化酶(PPO)活性,考察底物特异性、pH值、温度、热稳定性、底物浓度、金属离子及抑制剂对PPO酶活特性的影响,研究莴笋PPO酶学特性。结果表明,莴笋PPO的最适底物为邻苯二酚,最适pH值5.0,最适温度25℃;90℃热处理60 s莴笋PPO酶活基本完全丧失;莴笋PPO最适底物浓度为0.10 mol/L,PPO酶促褐变反应动力学符合米氏方程,相应的动力学参数Km=0.667 mol/L,Vmax=826.4 OD/min;Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+对PPO酶活有一定的的抑制作用,Cu2+和Fe3+对PPO酶活有一定的促进作用;五种抑制剂对抑制莴笋PPO酶活力均具有一定的作用,且抑制作用随抑制剂浓度的增大而加强,试验范围内抑制作用由强到弱依次为:抗坏血酸L-半胱氨酸Na HSO3柠檬酸EDTA,抗坏血酸对莴笋PPO酶活的抑制效果最佳。     

茶树菇多酚氧化酶动力学特性研究

采用分光光度法分析茶树菇多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)动力学特性,研究了底物浓度、pH值及温度等因素对PPO活性的影响,建立了茶树菇褐变的反应动力学方程.结果表明,茶树菇PPO最适温度50℃,最适pH4.0～5.0.用Michaelis-Menten机理描述得茶树菇PPO相应的动力学参数KM=2.59mol/L,Vmax=0.127U/min.此外还对茶树菇不同部位的PPO活性进行了调查分析.     

拟南芥硫代葡糖苷酶基因TGG1的克隆、表达和酶学特性

本研究克隆拟南芥硫代葡糖苷酶基因TGG1,利用毕氏酵母表达。重组蛋白用镍亲和柱纯化,获得高纯度芥子酶。重组蛋白分子量78 kD,与天然TGG1分子量接近,为糖基化蛋白。TGG1信号肽在酵母中具有分泌功能,约25%芥子酶分泌到培养基中。TGG1重组蛋白具有广泛的pH适应性,最适反应温度40℃左右。其活性被低浓度维生素C激活,被高浓度维生素C抑制。用Hanes plot方法计算TGG1重组蛋白以Sinigrin为底物时,Km为65μmol/L,最大反应速率Vmax=3.28μmol.min-1.mg-1。     

大果山楂多酚氧化酶的酶特性研究

以广西平乐大果山楂为原料,邻苯二酚为底物,采用分光光度法测定大果山楂多酚氧化酶(PPO)活性,考察p H、温度、热处理、底物浓度及抑制剂对PPO活性的影响,为控制其生产过程中酶促褐变提供参考。结果表明,以邻苯二酚为底物时,PPO酶促反应产物的最大吸收波长为420 nm,反应时间为3 min,最适p H为6.8,最适温度为45℃;90℃处理4 min,PPO基本失活,80℃处理6 min后,相对酶活性为19.75%;最适底物浓度为0.08 mol/L,PPO酶促动力学符合米氏方程,相应的参数Km=51.24 mmol/L,Vmax=54.53 U/min;在试验浓度条件下,5种抑制剂对大果山楂PPO活性均有抑制作用,氯化钠的抑制作用最弱,高浓度下,柠檬酸的抑制效果较EDTA、抗坏血酸、草酸要好。     

甘蓝型油菜苯丙氨酸解氨酶的分离纯化与性质研究

分离和部分纯化了甘蓝型油菜荚果中的苯丙氨酸解氨酶,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得亚基分子量约为46KD,推测其全酶分子量为184KD。酶反应的最适pH值为8.4;最适温度是60℃,70℃处理10min残存活性仍保持在50%,具有较好的耐热性;底物L-Phe最适反应浓度是0.02mol/L;有两个Km值,即Km1为1.01×10-3mol/L,Km2为0.778×10-3mol/L。     

豌豆种子萌发过程中脲酶活性的检测

实验根据脲酶水解尿素释放NH3而使得水溶液pH值增高的原理.来测得萌发的豌豆种子中脲酶活性的高低.结果表明,底物浓度对豌豆脲酶活性的影响较大,当底物浓度为0.35 mol/ml时,秦选1号脲酶活性最强;当底物浓度为0.45 mol/ml时,豌杂1号中脲酶活性最强.豌豆脲酶的最适温度是60℃.本实验可为豌豆的合理栽培提供参考.     

木薯Linamarase基因的克隆、表达及酶学特性分析

亚麻仁苷酶(Linamarase)是存在于木薯、巴豆等作物中的降解生氰葡萄糖苷Linamarin（亚麻仁苷）的酶,在结构上与芥子酶有很大的相似性,对它的研究有利于揭示生氰葡萄糖苷酶和芥子酶之间的关系以及芥子酶的起源问题。通过真核表达的方法,克隆了木薯Linamarase基因,构建酵母表达载体,转化毕赤酵母GS115,经诱导表达和亲和纯化,获得纯化的Linamarase重组蛋白。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子量集中在71 kD左右。该酶最适反应温度在37℃左右,最适pH约为5。以pNPG为底物时,Km为1.70 mmol/L,最大反应速率Vmax为8.36 μmol/(min?mg)。     

棉花不同GbU6启动子截短克隆及功能鉴定

U6启动子是CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统中驱动sgRNA转录的重要元件, 而使用较短序列的启动子也是构建CRISPR/Cas9基因组编辑载体的基本要求之一。将已经克隆的海岛棉GbU6-5P启动子(长度为1166bp), 采用Transfer PCR方法成功地截出6个长度不同的U6启动子, 其长度分别为672、468、358、280、202和105bp, 并分别构建了6个启动子驱动的GUS融合植物表达载体。将构建好的6个GbU6-5Ps::GUS-pCAMBIA1300与初始克隆的GbU6-5P::GUS-pCAMBIA1300植物表达载体一起利用农杆菌真空渗透转化法分别转染棉花花粉。GUS组织化学染色显示, 克隆到的7个不同截短大小的GbU6-5Ps启动子均能驱动GUS基因在棉花花粉中转录, 棉花花粉被染成蓝色但颜色深浅存在显著差异。结果显示启动子长度越短, 其转录活性越高。而且另外两种棉花U6启动子GbU6-1P和GbU6-7P也表现出类似的结果。本研究克隆了3个短小的、在棉花花粉细胞中具有转录功能的GbU6启动子。结果显示更短的U6启动子具有更高的转录活性, 而且这一特点在不同U6启动子上具有共性。这预示着使用更短U6启动子不仅符合构建CRISPR/Cas9基因组编辑载体的要求, 而且会提高sgRNA的转录水平, 进而可能提高基因组编辑效率。     

甘菊DlBADH1基因启动子DBP12表达特性研究

用pCAMBIA1305.2做载体,构建含有甘菊(Dendranthema lavandulifolium)DlBADH1基因(登录号:DQ011151)启动子DBP12(登录号:DQ497621)的质粒pCHW-2.利用叶盘转化法,通过农杆菌EHA105菌株介导,将重组质粒导入烟草叶片.采用GUS组织活性检测法鉴定烟草转基因植株,结果表明:DPB12启动子驱动的GUS基因表达无组织特异性.对转基因植株进行NaCl、ABA、SA处理,GUS荧光测定发现:100μmol/L ABA胁迫处理24 h和400 mmol/LNaCl胁迫处理48 h,转pCHW-2烟草植株叶片中GUS酶活性均有大幅度提高.该结果表明:DlBADH1基因启动子DBP12是一个诱导型启动子.这一研究结果为进一步研究甘菊中BADH基因调控表达机理提供了参考.     

1株野生茶树菇的鉴定及其母种培养条件研究

为更好地开发利用茶树菇,同时丰富国内茶树菇种质资源,以采自贵州的1 株野生茶树菇NC1 菌株为材料,对其进行内转录间隔区ITS(internal transcribed spacer)鉴定和母种培养条件研究,包括对菌丝生长的最适碳源、氮源、C/N 比、最适温度、最适pH 等。结果表明：该菌株为柱状田头菇(Agrocybe aegerita),其菌丝生长的最适碳源为玉米淀粉,其次为葡萄糖或果糖,最适氮源为酵母粉,其次为蛋白胨,最适C/N 比为30/1~40/1,最适温度为29℃,最适pH 5.0~6.0。研究结果可为野生茶树菇NC1 菌株进一步驯化栽培和开发利用提供参考。     

沙棘种子萌发期过氧化物酶活性检测

沙棘是一种生命力极强的灌木,一般生长在干燥、寒冷的贫瘠山区.沙棘果实和叶片中含有丰富的生物活性成分,是珍贵的药食两用植物资源.同时沙棘还对防止水土流失、改善生态环境,具有十分重要的作用.对沙棘进行高层次的综合开发利用具有重要意义.过氧化物酶(POD)作为植物细胞内保护酶系统的一种,与植物抵御极端温度、干旱、重金属胁迫、病害等各种不良环境有着密切的关系.本文研究了在不同pH、温度条传下,沙棘种子萌发期过氧化物酶的稳定性.结果表明,沙棘种子萌发期过氧化物酶的pH值稳定性和热稳定性都比较低,其作用最适pH值为6.2,最适温度为35℃.同时,实验还检测了底物浓度对沙棘种子萌发期过氧化物酶活性的影响,其最适底物浓度为0.06 mol/L.     

甜菊叶片β-葡萄糖苷酶的提取及其性质研究

为研究β-葡萄糖苷酶在甜菊糖苷降解代谢中的作用,并为今后通过抑制甜菊糖苷的降解从而提高其含量的育种工作等奠定理论基础。本研究以甜菊为试验材料,首先对甜菊叶片β-葡萄糖苷酶的提取及酶活性测定方法进行了优化,并进一步对该酶性质进行了初步分析。结果表明,以pH 7.0的50 mmol/L磷酸缓冲液提取,研磨时添加等量PVP,粗酶液经20%~40%饱和度硫酸铵进行盐析的酶液其酶活性最高;以pNPG为底物测定其酶活性时37℃孵育60 min最佳。酶性质分析结果表明,该酶具有较高的热稳定性和pH值稳定性,其最适温度为30℃,最适pH 7.0;4℃保存时酶活性逐渐降低,至26天时酶活力仅余26.4%;在9种常见金属离子中Mn ²⁺、Fe ²⁺对该酶有显著的激活作用,而Cu ²⁺、Hg ²⁺对该酶的抑制作用较明显。     

柞蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子的克隆与分析

以柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)DNA为模板,运用PCR技术钓取ApNPV(IE-1)基因的启动子片段,并将其克隆到pMD18-T载体上进行测序分析.将测序的2.7 kb DNA片段用EcoR I和Bgl II双酶切,回收3＇端1.6 kb的DNA片段.将该片段插入到pGFP-N2表达载体上构建以其作为启动子的IE-1/pGFP-N2重组质粒.重组质粒经脂质体介导转染Hela细胞,结果可见绿色荧光蛋白(GFP)在细胞中的表达,证明钓取的IE-1基因启动子片段具有启动子的转录活性.     

菠菜乙醇酸氧化酶的酶学特性及同工酶电泳分析

为了解析菠菜乙醇酸氧化酶(Sp GLO)的酶学特性及同工酶谱。首先提取菠菜的RNA并反转录成c DNA,通过NCBI数据库中提供的菠菜GLO基因mRNA序列信息,设计特异性引物,扩增目标序列并连接到p MD19-T载体上进行测序鉴定;随后再次设计引物并在上游引物加入His标签,克隆Sp GLO基因构建到p YES2载体上,将该载体转入酿酒酵母中进行表达并通过His-tag亲和柱纯化,然后在不同诱导时间点取样测定Sp GLO酶活。结果显示,转化后的酿酒酵母菌株在诱导发酵20 h后能得到最高的GLO活性。以乙醇酸为底物测定Sp GLO在不同p H、不同温度条件下的催化活性,其最适p H值为8. 0,最适温度为39℃。然后分别以乙醇酸、乙醛酸、甘油酸为反应底物,系统分析了Sp GLO的酶学特性,数据显示,Sp GLO对乙醇酸的亲和力最高,其Km为0. 41 mmol/L,Vm为45. 92μmol/(min·mg)。以乙醇酸、乙醛酸为底物,使用草酸抑制其催化活性,其Ki分别为4. 61,2. 09 mmol/L,表明以乙醛酸为底物时Sp GLO的催化活性更易被草酸抑制。同时将纯化后的Sp GLO通过Caps-氨水电泳体系进行同工酶电泳,经过染色后出现2条同工酶带,表明菠菜叶片中可能存在2种GLO同工酶。为将来深入研究植物GLO同工酶之间的生化特性差异并分析其不同生理功能奠定良好的基础。     

蜜梨果实多酚氧化酶酶学特性的研究

多酚氧化酶（PPO）是酶促褐变的关键酶,与果蔬加工制品的色泽、抗氧化能力密切相关。以蜜梨果实为原料,邻苯二酚为底物,采用分光光度法研究蜜梨多酚氧化酶的酶学特性。结果表明：pH和温度对蜜梨PPO活性有明显的影响,其最适pH为4．5,最适温度为34℃。在加工过程中,可通过调节pH和温度来降低蜜梨PPO活性,减少褐变的发生：蜜梨PPO催化底物邻苯二酚的酶促反应动力学与米氏方程高度符合,R^2-0．9972,其动力学方程为专1/V=0．17371/[S]＋0．4775,最大反应速率Vmax=2．09U·min^-1,米氏常数Km=0．36mol·L^-1;蜜梨PPO具有一定的热稳定性,随着温度的提高。完全抑制PPO活性所需要的时间逐渐减少。采用短时高温（90℃,1min）的热处理,不仅可有效降低蜜梨加工过程中的酶促褐变．而且可减少蜜梨汁营养成分的损失．较好地保持其固有色泽。