正交设计对‘红阳’猕猴桃ISSR反应体系的优化研究

以‘红阳’猕猴桃及其杂交F1代为试材,通过正交设计对ISSR-PCR扩增反应的影响因子进行优化,初步确立了适合‘红阳’猕猴桃ISSR-PCR反应体系:总体积20μL,10×PCR buffer2.0μL,Mg2+0.75 mmol/L,Taq酶1.5 U,模板DNA 60 ng,引物1.25μmol/L,dNTPs 0.15mmol/L。扩增程序:94℃预变性7 min,94℃变性30 s,50~58℃退火45 s,72℃延伸2 min,45个循环,72℃延伸7 min。引物UBC841的最佳退火温度为58.5℃。应用该优化反应体系,用UBC835对35份杂交F1代DNA进行ISSR-PCR扩增,结果显示优化后的反应体系具有较高的稳定性。     

硅胶干燥胡杨叶片DNA提取与RAPD反应体系的建立

以塔里木河流域胡杨(Populus euphratica)硅胶干燥叶片为材料,采用改进CTAB法提取胡杨基因组DNA,得到满足RAPD(Random amplif ied polymorphic DNA),随机扩增多态性DNA分析的胡杨基因组DNA。通过单因素优化试验,得到胡杨RAPD分析的最佳反应体系为:40 ng模板DNA,0.8 U rTaqDNA聚合酶,2.5 mmol/L Mg2+,0.3 mmol/L dNTPs,0.5μmol/L随机引物,1×buffer缓冲液,ddH2O补足至10μL。扩增反应程序为:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,38℃复性30 s,72℃延伸120 s,35个循环,最后72℃延伸7 min。     

新疆野生樱桃李SSR体系的建立及应用

为建立适宜新疆野生樱桃李的SSR分子标记技术体系,通过对PCR反应程序、反应体系(DNA模板量、引物浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶用量)以及退火温度进行了探索,建立了适宜野生樱桃李的SSR-PCR反应体系。结果表明:在25μL反应体系中,Mg2+1.0 mmol/L、引物0.5μmol/L、dNTPs 0.20 mmol/L、TaqDNA聚合酶1.0 U、模板DNA 30 ng、退火温度为60℃。SSR扩增程序:94℃预变性5 min,35个循环(94℃30 s,60℃1 min,72℃1 min),72℃延伸10 min,可筛选出稳定性好、多态性高的SSR引物。     

中国樱桃S-RNase基因PCR扩增技术体系的建立

通过对TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTP、通用引物、模板DNA浓度等反应参数的系统研究,建立了中国樱桃S-RNase基因特异PCR扩增体系。该体系反应的总体积25μL,其中Taq酶1.25U,MgCl22.5mmol/L,dNTP0.15mmol/L,通用引物0.25μmol/L,模板DNA 50 ng。反应程序为:94℃预变性3 min;33个循环的94℃变性1 min,56℃退火45 s,72℃延伸1.5 min;最后72℃延伸10 min。利用优化的扩增体系在中国樱桃的不同品种中获得有效扩增,进一步证明了该体系具有良好的稳定性和重复性。     

辣椒SSR反应体系的优化

本试验研究了辣椒SSR-PCR反应体系的主要成分对扩增结果的影响,同时进行了退火温度梯度和循环次数试验。优化后的反应体系为:总体积20μL,1.5μL模板DNA(25ng/μL)、1U Taq酶、0.375μmol.L-1引物、1.875mmol.L-1Mg2 、0.2mmol.L-1dNTPs、1XPCR buffer。扩增程序为:94℃预变性4min,94℃变性45s,58℃(以SSR005为例)退火45s,72℃延伸90s,35个循环,最后一个循环延伸增加为8min,4℃保存至电泳。     

山楂ISSR分析体系的建立和优化

为在DNA分子水平上对山楂种质资源进行分析奠定基础,对退火温度、循环次数、DNA模板质量、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶的种类和浓度等影响ISSR反应的因素进行研究,建立并优化了山楂的ISSR分析体系。优化的山楂ISSR分析体系为:采用改进的CTAB法或QIAGEN试剂盒法提取总DNA;PCR反应体积为20μL,内含1×PCR反应缓冲液(Promega公司),3.0mmol/L MgCl2,0.2mmol/L dNTP,0.3μmol/L引物,0.5U Taq DNA聚合酶(天根公司),50ng总DNA;扩增程序为94℃ 3min;94℃ 30s,退火温度1min,72℃ 2min,38个循环,72℃ 7min。筛选出了10个适宜山楂遗传分析的ISSR引物。     

野蔷薇的DNA提取和RAPD反应体系的建立

以野蔷薇(Rosa multiflora)的冬末初春芽和夏初叶片为材料,研究了DNA的提取方法,并对影响随机扩增多态DNA(RAPD)的反应因素进行了优化.建立了适合野蔷薇RAPD的反应体系和反应程序,在20μL反应体系中,25ng模板DNA,2.0mmol/LMgCl2,0.2mmol/LdNTPs,1UTaqDNA聚合酶,0.1μmol/L引物.扩增程序为:94℃预变性4min,然后94℃变性45s,37℃退火1min,72℃延伸1min,37个循环,最后72℃延伸5min,4℃保存.     

内蒙古红干椒RAPD反应体系的正交优化

以内蒙古开鲁县12个红干椒品种为材料,采用改良的CTAB法提取基因组DNA,通过采用正交优化设计方法,对红干椒RAPD反应条件进行了优化。试验结果表明,最佳红干椒RAPD的反应体系(25μL)为:PCR染料2.0μL,MgCl22.0 mmol·L-1,dNTPs0.6 mmol·L-1,引物0.5μmol·L-1,DNA模板125ng,Taq酶1.25U,超纯水14.9μL;适宜扩增条件为:94℃预变性4min,40个PCR循环94℃变性1min,37℃退火1min,72℃延伸1.5min,72℃复延伸5min,4℃保存。     

菊花SSR-PCR反应体系的建立和优化

为快速确定菊花SSR反应体系,利用正交实验设计L16(45)对菊花基因组SSR-PCR反应体系的5个因素(模板DNA、Mg2+、dNTP、引物和Taq酶)在4个水平上进行正交设计,筛选出适合菊花的最佳SSR-PCR反应体系,进一步利用单因素完全随机试验筛选各反应因素的最佳水平。结果表明:建立菊花基因组DNA SSR-PCR反应体系为25μL:60ng模板DNA、2.0mmol/L Mg2+、0.1mmol/L dNTP、0.3μmol/L引物、1UTaq酶。并对菊花引物进行梯度退火试验,其最佳退火温度在53.1℃;扩增程序是:95℃预变性5min;32个循环的94℃变性50s、53.1℃退火50s、72℃延伸50s;72℃延伸8min,4℃保存。该体系的建立为今后菊花SSR分析奠定了基础。     

内蒙古红干椒RAPD反应体系的正交优化

以内蒙古开鲁县12个红干椒品种为材料,采用改良的CTAB法提取基因组DNA,通过采用正交优化设计方法,对红干椒RAPD反应条件进行了优化.试验结果表明,最佳红干椒RAPD的反应体系(25 μL)为:PCR染料2.0μL,MgCl2 2.0 mmol·L-1,dNTPs 0.6 mmol·L-1,引物0.5μmlo·L-1,DNA模125 ng,Taq酶1.25 U,超纯水14.9μL;适宜扩增条件为:94℃预变性4 min,40个PCR循环94℃变性1 min,37℃退火1 min,72℃延伸1.5 min,72℃复延伸5 min,4℃保存.