菠萝NAC转录因子基因AcoNAC1生物信息学及表达分析

NAC转录因子作为植物中数量最大的转录因子家族之一,在植物生长发育及各种逆境胁迫中发挥非常重要的调控作用。本研究以菠萝为试验材料,采用RT-PCR技术克隆得到基因AcoNAC1（GenBank登录号：XM_020225830）,对其进行生物信息学及表达分析。生物信息学分析表明,该基因cDNA序列全长1723 bp,ORF为1062 bp,编码353个氨基酸,相对分子量为38.34 kDa,理论等电点为8.88;其编码蛋白的二级结构由20.40%的α-螺旋（H）和15.30%的β-折叠（E）以及59.21%的无规则卷曲（C）组成,具有NAC典型结构保守域。基因表达分析表明,AcoNAC1基因的表达受低温和干旱胁迫诱导,低温胁迫24 h和干旱胁迫12 h时的表达量最高;在不同成熟期品种中表现出持续的诱导表达,但诱导强度逐渐下降,其中早熟品种谢花后20~50 d及晚熟品种谢花后20~60 d基因表达量均处于较高水平。因此,推测AcoNAC1基因可能参与菠萝逆境胁迫响应以及果实发育与成熟的调控。     

甜瓜自毒作用相关MYB转录因子的克隆和表达分析

根据甜瓜自毒作用相关MYB转录因子核心区序列设计引物,采用RACE技术获得MYB c DNA全长。生物信息学分析表明,该转录因子全长1 164 bp,包括174 bp的5′非翻译区,105 bp的3′非翻译区,885 bp的开放阅读框,编码294个氨基酸,属于MYB类转录因子中R2R3-MYB类型,与黄瓜R2R3-MYB类转录因子的氨基酸序列的同源性达97.28%。实时荧光定量PCR结果表明,该基因在植株浸提液胁迫处理2 d时表达量最高,推测该转录因子可能参与了甜瓜自毒相关基因初期的诱导表达,使植株对自毒胁迫做出主动的系统性应答反应。     

甘蔗MYB转录因子基因ScMYB52-1的克隆及表达特性分析

MYB转录因子家族成员广泛参与植物的各种生物学过程,在调控植物适应非生物逆境过程中起关键作用。为分离甘蔗（Saccharum spp.）逆境响应MYB基因并研究其功能,本文应用3°RACE的方法,从甘蔗品种ROC22中克隆到一个R2R3-MYB转录因子基因,命名为ScMYB52-1。生物信息学分析表明,该基因cDNA序列长度为1072 bp,开放阅读框（ORF）长度为696 bp,5°非翻译区长54 bp,3°非翻译区长322 bp。该ORF编码231个氨基酸,推导蛋白的分子量为26.65 kDa,含有2个串联的MYB结构域。ScMYB52-1推导蛋白与模式植物拟南芥中的MYB家族蛋白的进化树聚类分析结果表明,ScMYB52-1蛋白与AtMYB52和AtMYB54的亲缘关系较近;进一步的多序列比对分析结果表明,上述三者蛋白质N端的MYB结构域序列高度一致,且三者的预测蛋白质三级结构类似,表明它们可能具有类似的功能。实时荧光定量PCR结果显示,ScMYB52-1在甘蔗组培苗的根中对PEG处理总体上不敏感,在叶中仅在3 h时短暂上调;ScMYB52-1在叶中受外源ABA和NaCl胁迫的诱导,在处理0.5 h均迅速上调表达,表达量分别为对照的3.35倍和2.75倍,并在处理期维持高于对照的水平;在根中受外源ABA和NaCl胁迫的抑制,在处理0.5 h时就开始下调表达,在处理24 h时表达量分别下调为对照的12%和40%,并在处理周期内总体上维持低于对照的水平。亚细胞定位分析表明,ScMYB52-1-GFP重组蛋白定位在烟草叶肉细胞的细胞核中。酵母双杂交自激活活性鉴定结果表明,ScMYB52-1蛋白无自激活活性。以上结果表明ScMYB52-1参与了甘蔗对高盐胁迫的应答,并可能受ABA信号通路的调控,在叶和根中存在差异的调控机制。本研究结果为进一步理解该基因在甘蔗非生物逆境适应过程中的功能及分子调控机制提供了初步的信息。     

木薯MYB转录因子MeMYB2特性及功能分析

MYB转录因子是植物最大的转录因子家族之一,其部分成员在植物非生物胁迫响应过程中发挥着重要的调控作用。通过转录组数据分析,筛选到了多个木薯干旱胁迫相关的MYB类基因,本研究针对其中的1个MYB转录因子MeMYB2展开研究。MeMYB2蛋白N末端与AtMYB60蛋白的N末端氨基酸序列具有95%以上的相似度,但其C末端氨基酸序列与AtMYB60只有30%左右的相似度。编码该蛋白的基因在木薯成熟叶片中优势表达,并且其表达受干旱胁迫负调控。MeMYB2蛋白主要定位于细胞核中,且在酵母中具有明显的转录自激活活性,其转录激活结构域在蛋白C末端247~267位点之间的20个氨基酸残基内。利用酵母双杂交系统从木薯cDNA文库中筛选到了8个与MeMYB2互作的蛋白,其中的2个蛋白与气孔运动和光合作用有关。MeMYB2-RNAi转基因木薯成熟叶片的失水率显著低于野生型木薯成熟叶片,说明MeMYB2转录因子负调控木薯叶片失水率,推测其可能具有调控气孔运动的功能。     

芒果MiAGL80基因特征及表达模式分析

AGL80/FEM111属于Type I型MADS-box基因家族,调控拟南芥中央细胞及胚乳的发育。目前,AGL80在木本植物中鲜有研究报道。本研究从芒果转录组数据中获得并命名为MiAGL80基因。生物信息学分析表明：MiAGL80基因位于1号染色体上,ORF全长为897 bp,无内含子,编码299个氨基酸,理论等电点为4.95,蛋白质分子量为73.19 kDa,氨基酸序列中含有1个MADS_SRF_like保守结构域。系统进化树分析表明：芒果MiAGL80与阿月浑子PvAGL80最为接近,且同源性最高,氨基酸相似性为64.29%。启动子序列分析显示：芒果MiAGL80基因的启动子包含光响应元件、逆境响应元件、转录因子结合位点以及激素响应元件等,其中光响应元件相较其他元件数量较多,不仅包含光调节相关元件,还包含昼夜节律表达所必需的区域元件;激素响应元件中包括赤霉素响应元件、生长素响应元件和乙烯响应元件;逆境响应元件主要是干旱响应元件。基因表达模式分析显示：在芒果果实中,MiAGL80随着芒果果实的逐渐发育,其在果肉中的表达水平持续下降,在花后100 d的果实与成熟果中的表达水平很低;在种胚发育过程中其表达水平先上升后下降,在花后100 d的胚和成熟胚中表达水平也很低;在种胚萌发发育期,其表达水平再次升高。在成花发育不同时期的组织器官中：MiAGL80主要在叶片中表达,其表达量先降低后逐渐升高,然后再降低,在花器官发育末期达到最大值;在花芽中的表达水平也显著高于营养芽;但在茎中表达量极低,几乎不表达。说明MiAGL80在芒果果实发育、种胚发育、种子萌发以及成花调控方面发挥作用。以上研究结果为深入研究MiAGL80基因的功能提供参考。     

龙眼DlWRKY52基因克隆及表达分析

WRKY转录因子在植物的生长发育和逆境胁迫响应中起着重要作用。前期研究发现,部分WRKY基因（比如DlWRKY52）参与了龙眼的成花诱导和逆境胁迫响应过程。为进一步研究龙眼WRKY基因的功能,以‘四季蜜’龙眼叶片cDNA为模板克隆得到DlWRKY52基因,并对其序列特征、组织表达模式、花果发育过程表达模式及亚细胞定位进行研究。结果表明：DlWRKY52基因的开放阅读框（open reading frame, ORF）全长为918 bp,编码306个氨基酸,具有典型的WRKY结构域和锌指结构,属于Ⅱc型WRKY蛋白。qRT-PCR结果表明,DlWRKY52基因在叶片、茎和果实器官中高表达;在花后80 d的果肉中显著上调表达;特异在‘四季蜜’成花诱导中下调表达。拟南芥原生质体瞬时表达结果显示,荧光信号主要集中在细胞核。上述结果表明,作为典型的转录因子,DlWRKY52编码的蛋白定位于细胞核。DlWRKY52可能参与了龙眼成花诱导及果实早期发育调控。     

芒果MinMYB10基因的克隆及表达分析载体的构建

MYB（myeloblastosis）转录因子主要参与调控植物类黄酮代谢、植物生长发育等。为了研究在芒果果实中类黄酮代谢调控机制,本研究从金煌果肉中克隆得到一个MYB基因,将其命名为MinMYB10,其全长cDNA序列为1021 bp,开放阅读框为837 bp。该基因编码的蛋白有278个氨基酸残基,分子重量为31.60 ku,等电点为5.89。通过系统发育分析发现MinMYB10与拟南芥是亲缘关系较近的蛋白。本研究还构建了基因沉默载体pTRV2-MinMYB10和过表达载体 pGreenII 62-SK-MinMYB10,以期在后续研究中探明MinMYB10基因在芒果果实花青素代谢中的作用。     

菠萝R2R3-MYB基因家族鉴定与表达分析

R2R3-MYB转录因子参与植物众多生命活动的调控,在植物生长发育中至关重要。本研究采用生物信息学分析方法,从菠萝基因组中筛选鉴定R2R3-AcMYB转录因子,并对其基因结构、编码蛋白和系统进化进行了分析;基于转录组数据和荧光定量PCR分析,研究了乙烯利处理后菠萝顶端分生组织MYB基因的表达模式。研究结果显示,菠萝基因组含有103个R2R3-AcMYB转录因子,其中67个的基因结构组成为3（外显子）+2（内含子）,17个为2（外显子）+1（内含子）。103个R2R3-AcMYB蛋白中,有31个偏碱性,55个显酸性和17个呈中性。亚细胞定位预测显示,有67个编码蛋白定位于细胞质,20个定位于细胞核。保守基序分析发现,有91个R2R3-AcMYB的序列包含SANT结构的motif 1和motif 2。系统进化树分析表明,81个R2R3-AcMYB转录因子可以分别被归入18个亚组,其余22个R2R3-AcMYB转录因子则未能进行明确归类。基于转录组数据和荧光定量PCR分析结果,发现菠萝顶端分生组织中多个MYB基因的表达受到乙烯利的诱导或抑制,暗示这些基因可能参与了乙烯利诱导条件下菠萝生长发育（包括开花诱导等）调控。这些研究结果为进一步挖掘菠萝激素响应、生长发育和开花调控等基因,揭示菠萝生长发育调控机制提供了数据支持。     

香蕉MaARF2基因的克隆及序列表达分析

利用RT-PCR方法从巴西蕉（Musa acuminata L. AAA group, cv. Brazilian）中克隆MaARF2基因,并对其进行序列及表达分析。基因克隆结果获得该基因编码片段,命名为MaARF2,全长2655 bp,编码884个氨基酸,分子量为97 917.38 Da,理论等电点pI为6.64,序列富含丝氨酸、脯氨酸,亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸并均匀分布在整个肽链中;通过Motif Search工具发现了ARF基因所特有的B3、Auxin_resp、AUX_IAA family结构域;多序列比对和进化树分析表明,MaARF2基因编码的蛋白与其他植物中ARF基因编码的蛋白具有较高的一致性。qRT-PCR结果表明,MaARF2在香蕉根、茎、叶、花和果实中均表达, 其中叶片中表达水平最高,果实表达量最低;MaARF2在低温、盐和干旱胁迫后表达量均上调,表明其可能参与调控香蕉低温、盐和干旱胁迫响应的过程。本研究首次在香蕉中克隆了MaARF2基因,为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。     

菠萝PEPC基因家族生物信息学分析

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC）在C₄和景天酸代谢（CAM）光合途径吸收CO₂过程中发挥重要作用,并参与各种非光合作用过程,包括果实成熟、气孔开放、碳氮相互作用、种子形成和萌发以及调节植物对逆境胁迫的耐受性。菠萝为典型的景天酸代谢途径（CAM）植物,为了解磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）在菠萝景天酸代谢途径（CAM）中的作用,本研究鉴定到3个菠萝PEPC基因,按照基因描述命名为AcPEPC1、AcPEPC3和AcPEPC4,进化树分析结果AcPEPC1和AcPEPC3为植物型PEPC（PTPCs）蛋白,序列同源性较高且基因结构、保守结构域及保守基序均一致。AcPEPC4为细菌型PEPC（BTPCs）蛋白,与AcPEPC1/AcPEPC3间的序列同源性低。组织表达分析表明AcPEPC1菠萝叶片表达量较高,而AcPEPC3和AcPEPC4在菠萝花和果实表达量较高。     

菠萝AcSOC1基因调控因子筛选

菠萝（Ananas comosus）是我国热区种植的主要经济作物之一,农业种植上常通过施用乙烯利促其成花,但关于乙烯诱导菠萝成花的分子机制与植物体内已知的五大成花途径之间关系尚不清楚。SOC1（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1）是一种开花整合因子,能够整合多种成花信号,诱导植物成花。有实验数据显示,AcSOC1（XM_020238379.1）基因响应乙烯诱导,在乙烯处理菠萝后,AcSOC1表达量上升。为了深入了解SOC1在菠萝成花中的作用及乙烯诱导菠萝成花与五大成花途径之间的关系,本研究以乙烯敏感品种‘台农4号’为材料,克隆AcSOC1启动子,构建pAbAi-pAcSOC1诱饵载体,利用酵母单杂技术,筛选AcSOC1候选调控因子,并用双荧光素酶实验进行验证。结果显示：共筛选出4个AcSOC1候选转录的调控因子:GHD7 （Heading Date7）、SVP1（SHORT VEGETATIVE PHASE 1）、SVP2（SHORT VEGETATIVE PHASE 2）、AP1（APETALA1）,只有AcSVP1、AcSVP2与pAcSOC1存在互作关系。SVP是一种开花抑制因子,乙烯能够抑制菠萝AcSVP基因表达。因此推断认为,乙烯诱导菠萝成花,可能是通过抑制AcSVP基因实现的,即乙烯通过抑制AcSVP的表达,从而降低了AcSVP对AcSOC1表达的抑制作用,AcSOC1表达增强,加快了乙烯诱导成花的过程。     

热带植物基因组研究进展

基于全基因组测序结果,探讨了包括热带水果香蕉（Musa spp.）、龙眼（Dimocarpus longan）、番木瓜（Carica papaya）、菠萝（Ananas comosus）、椰子（Cocos nucifera）、榴莲（Durio zibethinus）,经济作物橡胶（Hevea brasiliensis）、木薯（Manihot esculenta）、枣椰（Phoenix dactylifera）、可可（Theobroma cacao）、油棕（Elaeis guineensis）、咖啡（Coffea canephora）以及药用植物铁皮石斛（Dendrobium officinale）在内的13种热带植物的全基因组测序的发展历程,并对热带植物基因组研究进行了概述。     

茶树体胚APX基因克隆及其在体胚发生过程中的表达与酶活性分析

以铁观音茶树体胚为材料,克隆了茶树抗坏血酸过氧化物酶基因CsAPX(Genbank登录号为MG799534.1)。CsAPX基因包含一个长度为753 bp的开放阅读框(ORF),共编码250个氨基酸,并对其进行相关生物信息学分析。APX酶活性测定结果表明在球形胚至子叶胚阶段APX酶活性呈现下降趋势,并在子叶胚阶段到达最低值,随着体胚进一步的分化,在子叶胚、成熟胚和萌发胚阶段,茶树APX酶活性不断上升,总体呈"先降后升"的趋势。在体胚发生过程中CsAPX基因的表达分析显示,CsAPX基因在茶树体胚发生的5个阶段均存在显著差异表达,总体呈"升—降—升"的趋势,其中在萌发胚阶段的CsAPX基因的表达水平显著高于其他4个阶段,推测CsAPX基因在体胚发生过程中的萌发胚阶段发挥着重要的作用。     

菠萝AcHMGR基因的克隆与表达分析

以菠萝(Ananas comosus L.cv.Comte de Paris)果实为材料,采用RT-PCR结合RACE方法得到3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因(命名为AcHMGR)的c DNA及基因组DNA全长。AcHMGR的c DNA全长2 407 bp,其开放读码框长度为1 740 bp,编码579个氨基酸;其基因组DNA全长为4 115 bp,从起始密码子到终止密码子的长度为3 764 bp,含有4个外显子和3个内含子。荧光定量PCR结果表明,对照的菠萝果实中,AcHMGR基因表达量在花后0 d最高,从花后30 d开始,其表达量急剧下降,之后维持在一个较低水平直到果实成熟。经20 mg/L N-(2-氯-4-吡啶基)-N'-苯基脲(CPPU)处理后,显著提高了AcHMGR基因在花后30 d果实中的相对表达量,为同期对照的1.8倍;但其他时期的相对表达量与对照相比无明显差异。研究结果表明,AcHMGR基因在菠萝果实早期发育过程中表达量较高,CPPU处理提高了AcHMGR基因的相对表达量并显著提高果实的重量,说明CPPU处理后AcHMGR基因可能在促进果实重量的增加中起着重要作用。     

田间补充灌溉施肥对菠萝生长、产量及水肥生产力的影响

为探明菠萝田间控水减肥效应及确定补充灌溉施肥水平,为粤西地区菠萝生产中节水节肥和提质增效提供依据。研究以金菠萝‘MD-2’为材料,设置无灌溉常规施肥（常规）,2个补灌W₁（-15~-35 kPa）和W₂（-35~-55 kPa）与3个肥料F₁（100%）、F₂（75%）和F₃（50%）梯度处理（F₁W₁、F₂W₁、F₃W₁、F₁W₂、F₂W₂、F₃W₂）,以无灌溉无施肥作为对照（CK）。研究菠萝光合面积、光合效率、干物质积累、经济性状、灌溉水生产力及肥料偏生产力对不同处理的响应。结果表明,补充灌溉施肥能够显著提高菠萝株高、叶长、叶宽、叶片数和植株干物质含量。水肥限制下,叶片数和叶长的减少是单株叶面积下降的主要因素,而光合面积的减小是干物质量下降的主要因素,菠萝植株生长受限来自于肥料减施和因干旱而导致的肥料利用受限。雨季干旱胁迫解除后叶片实际光化学效率（Φ_PSII）能够快速恢复,但营养生长期光合面积显著下降的不可逆转仍然导致果实干物质量和产量显著下降。补充灌溉施肥条件下肥料偏生产力表现为F₃>F₂>F₁,而果实田间产量和田间糖锤度均表现为F₃2≈F₁,因此确定F₂是最佳施肥水平;在F₂施肥水平下,水分生产力表现为W₂>W₁,但果实增产率和田间糖锤度在W₁和W₂之间差异不显著。因此,采用F₂W₂补充灌溉施肥方式可为菠萝生产中节水节肥和提质增效提供支撑。     

薏苡bZIP基因家族全基因组鉴定与非生物胁迫表达分析

薏苡是传统药食兼用经济作物,具有极高的营养价值和重要的药用价值,越来越受人们重视。转录因子是一类能够与调控基因的顺式作用元件或者功能基因特异性结合的重要调控蛋白质分子,在植物的许多生物学活动过程中起着重要的调控作用。碱性亮氨酸拉链（bZIP）转录因子家族在调控植物的生长发育及响应生物与非生物胁迫中起着重要作用。本研究利用北京薏苡（2n=20）基因组信息鉴定出83个bZIP基因家族成员,命名为ClbZIP1~ClbZIP83,2个bZIP基因（Cl042706和Cl042496）不能最终定位到任何连锁群。通过生物信息学方法,分析了基因结构、理化性质、染色体分布,研究了其与其他物种的系统进化关系,并利用转录组技术研究了家族成员在栽培种兴仁小白壳苗期响应非生物胁迫的基因表达规律。结果表明：薏苡全基因组中bZIP成员分别编码氨基酸97~1008个,最小的是ClbZIP5（97个氨基酸）,而最大的是ClbZIP28（1008个氨基酸）;蛋白质分子量在11.33~110.03 kDa之间,pI在4.15（ClbZIP44）到12.33（ClbZIP50）之间;将其划分为A~I、K、S等11个亚组,不均匀地分布于基因组的10条染色体上;除了广泛分布的bZIP结构域的motif 1或motif 2外,每一类都具有相似基因结构与基序;然而,不同成员间存在外显子数目差异,最多为15个外显子（ClbZIP15）,最少为0个;干旱、高温、干旱和高温胁迫条件下,83个ClbZIP家族基因在干旱和高温胁迫后表达量的发生明显的变化,这说明这些基因可能在干旱和高温中的调控作用存在着不同。上述结果为更深入研究薏苡bZIP家族基因的生物学功能奠定基础及其在调控薏苡生长发育与响应生物与非生物胁迫机制提供参考。     

菠萝酸性转化酶基因家族初步生物信息学及表达分析

酸性转化酶（acid invertase, AIN）在菠萝采后蔗糖降解过程中起着重要作用,基于菠萝全基因组数据库,预测菠萝AIN家族基因并进行生物信息学分析,解析其在采后菠萝不同贮藏温度下的表达变化情况,为阐明AIN基因在采后菠萝果实贮藏特性中的作用奠定基础。以水稻AIN家族基因为探针,在菠萝全基因组中鉴定到2个菠萝细胞壁酸性转化酶基因（cell wall acid invertase, CWIN）和2个液泡酸性转化酶基因（vacuolar acid invertase, VIN）,分别命名为AcCWIN1、AcCWIN2、AcVIN1、AcVIN2,设计编码区引物进行测序验证,并进行生物信息学分析。进化分析结果表明,AcCWIN1、AcCWIN2和AcVIN1、AcVIN2蛋白分别归于细胞壁酸性转化酶和液泡酸性转化酶2个进化支上,且均属于糖基水解酶家族GH32,基因结构、保守域和保守基序均一致。荧光定量分析结果表明,菠萝果肉中AcVIN1和AcVIN2在果实采后贮藏过程中表达量升高,且AcVIN1在发生黑心病的部位大量表达,而AcCWIN1和AcCWIN2在采后贮藏过程中表达量逐渐降低,且随着贮藏温度的升高其表达量降低,预示AcVIN1、AcVIN2较AcCWIN1、AcCWIN2在菠萝采后蔗糖降解和黑心病的发生方面发挥着更为重要的作用。     

西番莲水通道蛋白PePIP2基因克隆及表达分析

西番莲作为新兴的热带果树，在热带农业中具有非常重要的作用，然而干旱、高温等非生物胁迫严重影响其正常生长发育。相关研究表明水通道蛋白(AQP)能够提高植物的抗逆性，本研究以西番莲‘台农’(Passiflora edulia Sims)为实验材料，利用西番莲的基因组数据，通过同源克隆法从西番莲中克隆得到了一个水通道蛋白基因PePIP2，其开放阅读框(open reading frame,ORF)为861 bp，编码286个氨基酸。对其进行生物信息学分析，其分子式为C₁₄₁₇H₂₁₅₆N₃₆₀O₃₇₃S₈，预测分子量为30 459.37 Da，等电点为8.84，亚细胞定位于细胞膜上。启动子区域分析显示其含有参与胁迫应答的顺式作用元件。对其进行干旱、高盐、低温、高温胁迫下的表达分析，结果表明：PePIP2能够受到干旱、高温和低温胁迫的诱导表达，其中在土壤含水量为50%，在45℃高温处理4 h和0℃低温处理48 h，其表达量最高。在烟草中进行瞬时表达，在不同时间的干旱胁迫处理下，PePI...