利用基因工程对紫花苜蓿进行遗传改良的应用及研究进展

紫花苜蓿是重要的牧草作物,培育优质苜蓿对于畜牧业的发展具有十分重要的意义。随着分子生物学的不断发展,利用基因工程技术对紫花苜蓿进行遗传改良已成为培育优良品种的重要途径。本文从苜蓿品质改良、提高抗逆性、抗病虫害、抗除草剂及转抗原基因等方面对基因工程在紫花苜蓿遗传改良研究中的应用及最新进展进行综述,阐述了基因工程在紫花苜蓿遗传改良中应用的优缺点并就紫花苜蓿基因工程遗传改良今后的发展方向做出展望。     

紫花苜蓿基因工程研究进展

牧草基因工程是近年来国内国际研究的热点之一,紫花苜蓿是世界范围内栽培历史最悠久、面积最大、研究最深入的优良豆科牧草,以其品质好、产量高而被誉为“牧草之王”。本研究结合国内外苜蓿基因工程研究动态,从生物胁迫、非生物胁迫、品质改良等方面系统介绍了苜蓿转基因研究的主要内容,在对已有成果进行综合分析的基础上,就目前苜蓿基因工程研究中亟待解决的一些问题进行了探讨。     

紫花苜蓿转基因研究进展

作为生物技术领域的前沿,转基因技术已在多种植物上取得重大进展。紫花苜蓿（Medicago sativa）是公认的优质牧草,通过转基因技术改良其遗传性状,提高其产量、抗性、品质等重要农艺性状已成为研究热点。本研究围绕与生产实践密切相关的非生物胁迫、生物胁迫、除草剂抗性、品质改良和生物反应器5个方面,归纳总结了近期紫花苜蓿转基因研究进展,并根据转基因紫花苜蓿的生物安全性和研究中存在的问题,分别提出了针对性建议并为今后的研究指明了方向,以期为我国紫花苜蓿的转基因基础研究和应用开发提供有益信息。     

紫花苜蓿作为生物反应器研制基因工程疫苗的进展

紫花苜蓿作为生物反应器研制基因工程疫苗已成为目前研究的热点之一。基因工程疫苗较传统疫苗更加廉价、高效、安全和稳定。随着生物技术的发展完善,植物生物反应器将会成为生产疫苗的有效途径。文章综述了用紫花苜蓿作为生物反应器研制基因工程疫苗的基本原理与步骤、研究进展、优点与问题及其应用前景。     

生物技术在紫花苜蓿中的应用

紫花苜蓿是世界上重要的豆科牧草,具有品质优良、易于栽培等特点,在生态环境保护方面也发挥着积极作用。随着分子生物学和植物基因工程的发展,在分子水平上对紫花苜蓿进行遗传改良的研究已取得了部分成果。介绍了紫花苜蓿组织培养的种类及影响因素,综述了近年来遗传转化和分子标记等生物技术在紫花苜蓿研究领域的应用,并展望了紫花苜蓿基因工程在今后研究工作中的重要地位和前景。     

紫花苜蓿研究进展

紫花苜蓿是世界上重要的豆科牧草,培养优质苜蓿对于畜牧业的发展具有重要意义。紫花苜蓿的生长特性和光合特性受很多不同因素的影响,基于这些因素对苜蓿进行性状及品质的改良是关键。随着分子生物学技术的不断发展,在分子水平上对紫花苜蓿进行遗传改良的研究已取得了很多有价值的研究成果。文章归纳了各种生物技术在紫花苜蓿遗传改良中的应用,对基因工程在不同性状改良的研究进展进行了详细阐述,在此基础上,对紫花苜蓿分子生物学的研究前景进行了展望。     

干旱和高温胁迫下紫花苜蓿PEPC酶活性变化及其基因序列分析

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是一种分布极其广泛的多年生优质豆科牧草，分析干热胁迫下其磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)酶活性变化及PEPC蛋白的生物信息学。本研究以‘阿尔冈金’紫花苜蓿和云南德钦县野生紫花苜蓿为材料，测定其在干旱胁迫和高温胁迫下的PEPC酶活性的变化，同时扩增了PEPC基因，并对PEPC蛋白进行了生物信息学分析和系统发育分析。结果表明，在胁迫第12 h酶活性达到峰值，两种胁迫下野生紫花苜蓿的酶活性基本高于‘阿尔冈金’紫花苜蓿，两种紫花苜蓿PEPC蛋白均为不稳定蛋白和亲水性蛋白。干旱胁迫与高温胁迫都对紫花苜蓿PEPC酶活性产生了较大的影响，且两种紫花苜蓿PEPC氨基酸序列保守性均较高。本研究可为提高高温和干旱条件下紫花苜蓿的光合特性进而增加产量提供理论依据。     

生物炭与干旱胁迫对接种紫花苜蓿光合效率及生长的影响

试验以接种根瘤菌‘Sm1021’的紫花苜蓿（Medicago sativa L.）为材料,将土壤和生物炭按比例混合（0%,0.5%,1%,1.5%,2%）,然后进行不同程度（正常土壤水分处理,轻度,中度,重度）干旱胁迫,旨在研究土壤中添加不同水平生物炭与干旱胁迫对接种根瘤菌紫花苜蓿光合效率及生长的影响,探讨生物炭多孔性特性是否能够提高根瘤菌固氮能力,从而促进苜蓿生长。结果表明：干旱胁迫显著抑制紫花苜蓿的光合效率和生长（P<0.05）,重度干旱抑制作用最显著（P<0.05）;添加生物炭能够提高接种紫花苜蓿光合效率,促进植株生长;随生物炭水平升高,紫花苜蓿光合效率和生物量先增加后降低。研究认为,添加0.5%~1%水平的生物炭可增加接种紫花苜蓿叶面积,促进光合效率,缓解干旱胁迫对植株造成的伤害,从而促进生长。     

干旱胁迫对苗期紫花苜蓿3种生理指标的影响

以紫花苜蓿Medicago sativa金皇后盆栽苗为试验材料,用改良空气干旱法进行0~6 h的干旱胁迫,试剂盒测定地上部分和地下部分的丙二醛(MDA)含量,抗坏血酸(AsA)含量和过氧化物酶(POD)活性的变化。结果表明:轻度干旱胁迫下,随着干旱时间的延长,紫花苜蓿地上部分和地下部分的MDA含量、AsA含量均在短时间内增加,地下部分的POD活性也在较短时间内增强,地上部分则无明显变化;紫花苜蓿地下部分比地上部分对干旱胁迫反应更为敏感;改良空气干旱法模拟干旱胁迫效果明显,可以作为一种模拟方法选用。     

一氧化氮对干旱胁迫下紫花苜蓿幼苗次生代谢产物的影响

本研究以盆栽紫花苜蓿为试验材料，在聚乙二醇（PEG-6000）模拟干旱的条件下，分别以硝普钠、c-PTIO(carboxy-PTIO)为NO供体和清除剂进行叶面喷施，通过研究紫花苜蓿幼苗叶片、根系中次生代谢产物及关键代谢酶活性的变化，探讨干旱胁迫对次生代谢产物的影响及NO介导下紫花苜蓿耐旱机制的响应。结果表明，干旱胁迫使紫花苜蓿叶片及根系中总酚、类黄酮、木质素和花青素的含量呈先升高后降低的变化趋势，同时增强了苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）活性。外源NO的施加则会促进这种趋势的进行，使总酚含量提高33.08%，在胁迫后期仍使酚类物质保持较高的代谢水平，改善胁迫所导致的损伤状况。而NO抑制剂c-PTIO则会不同程度地抑制紫花苜蓿幼苗中酚类物质的合成及其代谢关键酶的活性。因此，外源NO的喷施使紫花苜蓿中次生代谢物的积累与抗氧化酶活性维持在一个高于仅干旱胁迫的水平，更大限度地降低干旱对紫花苜蓿造成的危害，提高对干旱的耐受性。本研究进一步扩充了紫花苜蓿抗旱手段的工具箱，对紫花苜蓿的抗旱具有重要的意义。     

紫花苜蓿SAUR基因家族的鉴定及其在非生物胁迫中的表达模式研究

SAUR(small auxin-up RNA)是植物早期响应生长素的一类基因,参与植物生长发育与非生物胁迫响应等一系列生物过程。在拟南芥、水稻、棉花等物种中已经对SAUR基因家族进行了系统鉴定与分析,但是,在世界上最重要的豆科牧草紫花苜蓿中关于SAUR基因家族的研究尚未开展。本研究利用生物信息学的方法在紫花苜蓿参考基因组共鉴定到433个MsSAUR成员,并对其基因组位置、基因结构、启动子顺式作用元件以及不同组织中的表达模式进行了分析。同时,利用紫花苜蓿在不同非生物胁迫下的转录组数据,发现有5、11、19以及12个MsSAUR成员分别响应干旱、盐、冷以及碱胁迫,MsSAUR14/94/254可以同时响应干旱和盐胁迫,MsSAUR297可以同时响应干旱、盐以及碱胁迫,MsSAUR306可以同时响应干旱、盐以及冷胁迫。本研究结果可为后期通过基因工程技术创制高产抗逆新种质提供重要的候选基因。     

CPB-LAR-GFP表达载体的构建及其在紫花苜蓿愈伤组织中的表达

以无色花青素还原酶编码基因LAR为靶序列,构建携带绿色荧光蛋白GFP和抗除草剂bar基因的双标记选择植物表达载体,通过农杆菌介导法对紫花苜蓿进行遗传转化,经PCR检测和PPT筛选出抗性愈伤组织,转基因紫花苜蓿愈伤组织的缩合单宁含量比对照高30.8%。试验证明重组基因已转化至紫花苜蓿愈伤组织中并发挥生理功能,为研究缩合单宁合成与代谢的分子调控机制和培育具有抗除草剂和抗臌胀病的牧草新品种奠定基础。     

低温干旱复合胁迫对8个紫花苜蓿品种形态和生理特征的影响

紫花苜蓿种植中普遍遭受低温和干旱胁迫，是亟需重视的问题。本研究选择8个代表性的紫花苜蓿品种作为试验材料，采用盆栽方式模拟低温和土壤干旱环境，通过测定株高、叶绿素、过氧化物酶(Peroxidase,POD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)等形态生理指标，来研究低温干旱复合胁迫对紫花苜蓿的影响。结果显示，与对照组相比，低温干旱处理后各品种紫花苜蓿的形态指标如株高、叶长、叶宽等以及叶绿素含量、氮含量、POD、CAT等生理指标均呈下降趋势。隶属函数综合评价与株高、叶绿素含量和氮含量均呈显著相关关系，表明这三个指标是评价苜蓿抗低温干旱复合胁迫的重要参数。基于隶属函数值综合指数对紫花苜蓿品种在低温干旱环境下的抗逆性进行评价，表现较好的品种为‘东苜2号’及‘北极熊’。     

紫花苜蓿与蓝花苜蓿抗旱性比较研究

试验采用两次反复干旱法在三叶期对77份紫花苜蓿及蓝花苜蓿材料进行干旱胁迫,以正常浇水为对照,于第二次胁迫后调查植株存活率、株高、地上生物量、地下生物量、根长及根冠比等6项形态指标。对各指标抗旱系数进行方差、相关性、主成分及聚类分析,以揭示紫花苜蓿及蓝花苜蓿材料对干旱胁迫的响应及抗旱性差异。结果表明,在紫花苜蓿与蓝花苜蓿材料中,地下生物量均为抗旱系数差异最大的指标,最大值与最小值之间的差异分别为4.07倍(紫花苜蓿)和2.11倍(蓝花苜蓿)。株高的抗旱系数在不同亚种及种质间差异均达到极显著水平,且与存活率、地上生物量及根冠比间均存在显著相关性,表明株高在鉴定苜蓿抗旱性的6个有效指标中效果最明显。主成分分析可将6个形态指标分别归类为地上部性状和地下部性状,且可根据前两个主成分因子将紫花苜蓿和蓝花苜蓿清晰地划分为两个抗旱性不同的独立类群。聚类结果将77份材料划分为抗旱特征不同的5个亚组,可根据不同研究目的进行选择利用。综上,依据6个形态指标对紫花苜蓿及蓝花苜蓿进行抗旱性评价的结果为四倍体紫花苜蓿的抗旱性要强于二倍体蓝花苜蓿,试验结果对多倍体逆境胁迫研究和紫花苜蓿抗旱育种研究具有重要意义。     

紫花苜蓿MsCCD4基因克隆及耐盐功能鉴定

为验证紫花苜蓿(Medicago sativa L.)胡萝卜素裂解双加氧酶(Carotenoid cleavage dioxygenase，CCD)基因的耐盐功能，本试验克隆了紫花苜蓿MsCCD4的CDS全长序列，并以其叶片为试验材料，通过发根农杆菌介导的毛状根诱导法获得过表达MsCCD4的转基因毛状根，验证过表达MsCCD4对紫花苜蓿耐盐性的影响。结果表明：MsCCD4为稳定的酸性亲水蛋白质，二级结构以无规则卷曲为主，C-端含有RPE65保守结构域；MsCCD4启动子区含有光响应、激素应答和非生物胁迫响应结合元件；盐胁迫可诱导MsCCD4表达量升高；盐胁迫生理实验证明，过表达MsCCD4可以增强毛状根的耐盐性。本研究为紫花苜蓿耐盐遗传改良提供基因资源及耐盐基因快速鉴定方法。     

紫花苜蓿MsUGT87A1基因克隆及其对非生物胁迫的响应分析

尿苷二磷酸(Uridine diphosphate, UDP)糖基转移酶(UDP-glycosyltransferase, UGT)催化植物体内黄酮等次生代谢产物的糖基化反应，在植物抵御逆境胁迫过程中具有重要作用。本研究从紫花苜蓿(Medicago sativa)中克隆UGT家族基因MsUGT87A1,利用生物信息学方法对其蛋白质理化性质、二级结构和亚细胞定位等进行分析，并通过荧光定量PCR分析MsUGT87A1基因的组织表达特异性及对不同非生物胁迫的响应情况。结果表明，MsUGT87A1基因全长1 353 bp,编码450个氨基酸，蛋白质相对分子量为50.98 kDa,理论等电点(pI)为5.78,属于亲水性蛋白，主要定位于细胞质中。系统进化树结果表明紫花苜蓿MsUGT87A1与蒺藜苜蓿、红三叶等豆科植物的UGT87A1同源性较高。MsUGT87A1基因在紫花苜蓿根中表达量最高，对干旱、盐和ABA处理均有响应，初步确定MsUGT87A1基因参与紫花苜蓿应对干旱及盐胁迫响应。该研究为进一步探究MsUGT87A1基因功能奠定基础，为紫花苜蓿抗逆性遗传改良提供理论依据。     

原花青素对酸铜胁迫下紫花苜蓿种子萌发的影响

为研究原花青素对酸铜胁迫下紫花苜蓿种子萌发及幼苗生长的影响,以6个紫花苜蓿品种为试验材料与不同浓度原花青素(0、12. 5、25. 0、37. 5、50. 0毫克/千粒种子)进行拌种,研究其酸铜胁迫下的发芽试验。结果表明:不同原花青素浓度均能促进紫花苜蓿种子发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数等萌发指标和根长、根系表面积等根系性状指标。随着原花青素浓度的增大,酸铜胁迫下紫花苜蓿种子萌发指标和根系指标都增大,但是不呈连续增长趋势,且不同紫花苜蓿品种间表现有差异。     

AtSOS基因在紫花苜蓿中的表达及其耐盐性研究

本研究采用基因工程技术改良紫花苜蓿耐盐性,通过种植转基因耐盐紫花苜蓿达到改良土壤的目的。以紫花苜蓿子叶节为外植体,通过农杆菌介导法将来源于拟南芥的AtSOS1-AtSOS2-AtSOS3多基因表达载体导入阿尔冈金紫花苜蓿中,经PCR检测、抗除草剂筛选和RT-PCR鉴定,获得了能稳定表达的转基因株系。以转基因的紫花苜蓿和野生型紫花苜蓿为材料进行盐处理,每个处理重复3次,测定其生理生化指标、株高、Na⁺和K⁺含量、细胞膜透性、叶绿素含量。结果显示,在不同盐浓度处理下,所有植株的株高均有所增长,但在100和200 mmol·L^-1的NaCl处理下,转基因植株的长势显著高于野生型植株;随着处理时间的增加,所有植株的叶绿素含量均呈先上升后下降的趋势,且野生型植株叶绿素含量均低于转基因植株;在100和200 mmol·L^-1的NaCl处理下,转基因植株的细胞膜透性、超氧化物歧化酶活性和脯氨酸含量的增加量均小于野生型植株,而过氧化物酶、过氧化氢酶活性和可溶性糖含量的增加量均大于野生型;各植株中丙二醛含量均下降,且野生型植株下降的更为明显;盐处理后,转基因植株根系中Na⁺的积累比野生型植株少,而K⁺的吸收多于野生型植株。转AtSOS基因的紫花苜蓿通过发挥AtSOS途径的作用,促进了植物体将细胞内的Na⁺外排,从而减轻盐胁迫对植物体的伤害,提高了转基因植株的耐盐性。     

44个紫花苜蓿品种的酸铝适应性与耐受性评价

为了解紫花苜蓿在贵州地区的适应性及耐酸铝胁迫机理，以44份紫花苜蓿品种为研究对象，研究紫花苜蓿处于酸铝胁迫下的生理变化，并揭示其生理变化与耐酸铝胁迫间的关系。利用基因与环境互作模型对两个地点1年的紫花苜蓿进行产量分析，筛选出阿尔冈金、新疆大叶苜蓿、Trifecta、Vernal和中牧1号苜蓿5个耐酸铝强适应品种。利用敏感型UC-1465和耐受型阿尔冈金进行酸铝胁迫试验。结果表明：相同处理下，耐受型紫花苜蓿的电导率、相对铝含量、死亡率显著低于敏感型；紫花苜蓿对酸铝胁迫的响应主要通过柠檬酸、苹果酸、乙酸、酒石酸、反丁烯二酸和草酸的显著（P<0.05）增加来体现，其中苹果酸的合成和分泌增多可能是其耐酸铝胁迫的重要原因。     

紫花苜蓿抗热性鉴定与评价的研究进展

紫花苜蓿Medicago sativa因其营养丰富被广泛栽培,已成为草食家畜和奶牛养殖业的重要饲草,更是一种重要的生态改良草,在我国畜牧业发展和生态保护中起着不可比拟的作用。高温是影响紫花苜蓿生长的重要限制因子,研究发现高温胁迫致使植物发生一系列生理、生化及形态上的响应。在河南省,由于夏季高温的胁迫,致使紫花苜蓿夏眠,甚至死亡,严重影响其品质和产量。结合植物自身的调节机制,从植物形态及抗氧化系统综合阐述了高温条件下紫花苜蓿的抗热性鉴定方法和评价指标,旨为其抗热性鉴定和选育工作提供一定的科学参考。